一种蓖麻毒素快速定量检测卡

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种蓖麻毒素快速定量检测卡。

背景技术

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)是蓖麻籽中的一种高毒性糖蛋白，含量约占籽重的1.0～5.0％左右。作为重要的油料作物，蓖麻在我国分布和种植广泛，我国蓖麻籽产量居世界第二位。而RT由于来源广、易制备、施毒方式多样，很早就被列入《禁止化学和生物武器公约》的控制清单之中，并被美国疾控中心(CDC)列为B类生物战剂。此外，根据我国国家疾控中心的数据，每年我国均有因误食蓖麻籽而引起的蓖麻中毒及死亡事件。因此，为应对蓖麻毒素的潜在威胁，各国相关组织一直致力于蓖麻毒素的预防和控制措施的工作。

目前对RT中毒尚无特效的解毒药物，只能采取对症治疗。因此，对毒素污染样品进行快速、灵敏的检测分析是预防控制及中毒患者诊疗的关键。目前针对RT的检测方法主要有：ELISA法是国际最经典的方法，灵敏度可达ng/mL，但因操作复杂、检测设备体积大、耗时长，应用相对受限；胶体金免疫层析试纸条利用胶体金标记技术的可视定位性质，摆脱了专用的仪器设备的限制，且成本低廉、操作简单，缺点是只能做到半定量检测，灵敏度也较低。因此寻求新的对蓖麻毒素快速、有效的检测方法，具有十分现实的军民两用价值。

发明内容

现有层析技术采用的方式是在NC膜一端放置吸水垫，另一端头放置标记物垫，在标记物垫向上依次放置滤物垫、样品垫和加样孔。无论是样本还是样本稀释液在加入加样孔后，样本、稀释液和标记物均仅向吸水垫方向迅速侧流，由于样本基质之间的差异很大，因此样本垫中的标记抗原(或抗体)由于不能完全地与加入样本量进行充分免疫反应，导致在渗透释放到NC膜检测线(T线)的样本总量产生偏差，就直接影响检测结果的稳定性。

本发明提供了一种双孔快速检测卡，在NC膜一端放置吸水垫，另一端放置稀释液垫，标记物垫放在稀释液垫前方，并在标记物垫和稀释液垫之间保留了5-10mmNC 膜裸露空间。标记物垫上依次放置样品垫、滤物垫和加样孔，稀释液垫上方设置清洗孔。当样本加入加样孔后，样本经过滤物垫、样本垫和标记物垫后，标记物随样本沿着NC膜向吸水纸和稀释液垫两个方向层析。样本的这种两个层析方向的特征与现有技术具有本质差异，由于加入样本的量较少，一般为5-50uL，渗透入NC膜的样本和标记物将渐渐减慢直至停滞，这个停滞过程，相比现有技术，增加了样本和标记物耦联的蓖麻毒素单抗反应时间，达到提高灵敏度的作用。

与现有技术中样本和标记物都是趋于全部释放到NC膜上不同，本发明加入样本后，标记物随样本流入NC膜之后，在达到设定的样本等待时间、样本侧流到指定位置或者出现到检测窗口后，立刻在清洗孔加入稀释液。由于大多数的样本和标记物已经渗透到NC膜，标记物垫处于半干半湿状态，并且标记物垫、样品垫和滤物垫的吸水性远低于NC膜，因此，当在加入稀释液后，NC膜的湿度将大于样品垫和标记物垫，未进入NC膜的剩余标记物和样本将无法继续向层析膜中渗透。稀释液只能将仅存于 NC膜上的那部分样本和标记物稀释侧流至吸水纸。以上设计保证了检测的稳定性，从而提高检测的精密性。

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种蓖麻毒素快速定量检测卡。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种蓖麻毒素快速检测试纸条，包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释液垫；所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜一端搭接吸水垫，另一端搭接稀释液垫；所述标记物垫放置在所述硝酸纤维素膜上且位于所述稀释液垫前方，所述吸水垫的方向定义为前方；所述标记物垫上设置所述样品垫；在所述硝酸纤维素膜上从标记物垫到吸水垫依次设置检测线(T线)和质控线(C 线)；在所述标记物垫和检测线(T线)之间设置定量标识线(M线)；

所述标记物垫上包被有标记物标记的鸡IgY抗体、标记物标记的蓖麻毒素单抗；所述检测线处包被蓖麻毒素多克隆抗体，所述质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

所述标记物适用胶体金、荧光素、镧系荧光、彩色乳胶、量子点、上转换荧光物质、磁荧光微球、以及酶标记物、化学发光物质；具体可为镧系荧光微球。

作为优选，所述样品垫上面可设置相应的滤物垫，如滤血垫等，可用于滤除样本中干扰物质。

作为优选，所述标记物垫上还加入色素，以显示待测样本液侧流过程，便于肉眼观察或仪器自动监测控制。

作为优选，当色素被稀释液冲洗干净后，在稀释液耗尽后，色素再次流入检测窗口时，应停止结果判读。

作为优选，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫搭接的重叠宽度为1-2mm；所述硝酸纤维素膜与所述稀释液垫搭接的重叠宽度为1-2mm。标记物垫放置在稀释液垫前方，并在标记物垫和稀释液垫之间保留1-10mm硝酸纤维素膜裸露空隙。

作为优选，所述定量标识线(M线)置于T线和标记物垫之间可视窗上，便于目测和自动检测仪器识别，以控制提示稀释液的加入时间。

所述定量标识线(M线)设定涵盖：满足设定的加样量、满足设定的加样后第一次免疫反应延时时间、样本液迹移动到壳体上指定的定量标识线(M)位置，或者样本液迹出现在检测窗口。

本发明还提供一种蓖麻毒素双孔定量检测卡。

本发明所提供的蓖麻毒素双孔定量检测卡：包括外壳和设置在所述外壳内的蓖麻毒素快速检测试纸条；所述外壳包括上壳盖和下壳盖，上壳盖与下壳盖扣合；且在上壳盖对应所述试纸条中的检测线“T”和质控线“C”的区间设置检测窗，对应所述样品垫处设置加样孔，对应所述稀释液垫处设置清洗孔；在靠近加样孔侧的所述检测窗边沿和“T”线之间设置“定量标识线”，并在对应的壳体上设置标记。

作为优选，加入样本液后，液迹在达到定量标识线(M线)后，再在清洗孔加入稀释液。所述定量标识线(M线)设定涵盖：满足设定的加样量、满足设定的加样后第一次免疫反应延时时间、样本液迹移动到壳体上指定的定量标识线(M)位置，或者样本液迹出现在检测窗口。

作为优选，加入样本液后，在设定时间内液迹仍不能达到定量标识线的可再补加一些样本，使其液迹能到达定量标识线。确保参加免疫反应的样本液一致。这项优选尤其对基质粘稠样本很重要。

作为优选，当样本液加入后，样本液经过滤物垫、样本垫和标记物垫后，样本液会沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释液垫两个方向侧流层析。这种两个侧流层析方向的特征与现有技术具有本质差异：

(1)所述要求，由于增加向“稀释液垫”方向流动，样本与标记垫反应后的液迹不会很快到达T线。随着样本液的耗尽，渗透入硝酸纤维素膜的样本液和标记物将渐渐减慢直至停滞，这个停滞缓冲过程，相比现有技术，增加了样本液和标记物偶联的抗原(或抗体)结合反应时间，达到提高灵敏度的作用；

(2)由于双侧流，被测样本与标记的抗原(或抗体)以标记垫的中心对称分布均匀展开，可改善单侧流形成“反应死角”的现象；

(3)在控制加样量、加稀释液量以及控制免疫反应时间的基础上，增加通过“定量标识线(M)”对第一次的免疫复合物的液量可实施准确的定量控制。

与现有技术中样本液和标记物都是趋于全部释放到硝酸纤维素膜上不同，本发明是在加入样本液后，标记物随样本液流入硝酸硝酸纤维素膜之后，在液迹侧流到定量标识线(M)时，“定量”的样本液和标记物渗透到硝酸纤维素膜，此时标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤物垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜。因此，当稀释液垫在加入稀释液后，硝酸纤维素膜的湿度将大于样品垫和标记物垫，未进入硝酸纤维素膜的剩余标记物和样本液只能有极少量向层析膜中渗透。稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本液和标记物层析至吸水垫，故本发明快速检测卡可精确控制进入硝酸纤维素膜的样本液量。现有技术，虽然定量加样，但由于样本之间基质差异，导致进入硝酸纤维素膜的样本总量存有差异，直接影响检测结果的准确性和稳定性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

结构简单，设计合理，通过中间的加样孔加样品，并且在加入样本后侧流到预设定位置时，再在“清洗孔”中加稀释液的方式，由于此时样品垫、滤血垫和标记物垫的湿度都大于NC膜湿度，在吸水垫作用下，稀释液基本稀释NC膜上的样本，稀释液极少流向样品垫、滤血垫和标记物垫，不但提高被检测物灵敏度和精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。

当稀释液加入清洗孔，标记物垫上的样本和荧光标记物初期将无法继续向层析膜上渗透，当稀释液走完后，残留在标记物垫上的标记物和样本可能继续向膜上渗透，当稀释液全部耗尽后，标记物垫将处于相对NC膜潮湿，标记物则会少量渗透NC膜。在标记物垫上加入色素，用于指示标记物释放过程。当检测窗口看到再次看到色素开始出现时，应停止对结果判读。

本发明建立了一种基于可见光激发的时间分辨荧光免疫层析检测方法，在生物毒素的检测中获得了较高的检测最低检测限，与配套的小型便携化检测仪器配套使用，具有检测快速、可远程传输结果的优势，未来在生物反恐、生物武器核查等领域具有较高的应用价值和应用前景。蓖麻毒素高敏荧光检测法具有较高的检测最低检测限，且检测仪器小、成本低，对于生物恐怖袭击、生物武器核查、突发公共卫生事件以及食品安全等多个领域具有重要意义，为多环境现场检测提供了快速、敏感、准确的检测方法。

附图说明

图1是本发明蓖麻毒素试纸条的结构示意图；

图2是本发明蓖麻毒素试纸卡的俯视图；

图3是蓖麻毒素亲和纯化SDS-PAGE电泳图；1,蓖麻粗提物；2，穿透；3-6，100 mmol/L D-半乳糖洗脱；M,markers；

图4是蓖麻毒素SDS-PAGE电泳图；M.markers；1.未断链北京产地RT；2.断链北京产地RT；

图5是各产地蓖麻毒素免疫印迹鉴定；

图6是蓖麻毒素的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

如图1所示，一种蓖麻毒素双孔快速定量试纸条，包括PVC底板1、吸水垫2、 NC膜3、标记物垫5、样品垫8、滤物垫9和稀释液垫4；所述NC膜3固定在PVC 底板1上，所述NC膜3左端搭接所述吸水垫2，右端搭接所述稀释液垫4；所述标记物垫5放置在所述NC膜3上且位于所述稀释液垫4前方，所述吸水垫2的方向定义为前方；并在所述标记物垫5和稀释液垫4之间保留了1-10mm NC膜裸露空间；在所述标记物垫5上设置所述样品垫8；在所述NC膜3上所述吸水垫2与标记物垫5之间的区间的沿着从标记物垫5到吸水垫2方向依次设置检测线(T线)7和质控线(C 线)6，在所述标记物垫5和检测线(T线)7之间设置定量标识线(M线)13。

所述标记物垫5上浸染标记镧系荧光微球蓖麻毒素的单克隆抗体和标记镧系荧光微球的鸡IgY抗体；在检测线7上包被蓖麻毒素多克隆抗体，质控线6上包被羊抗鸡 IgY抗体的IgG。

作为一种优选，所述标记物垫5中加入有色素的标示物。

如图2所示，一种蓖麻毒素双孔快速定量检测卡，包括外壳14和设置在所述外壳14内的上述双孔快速定量试纸条；在外壳的上壳上对应检测线7和质控线6的区间设置检测窗口10；在检测窗口边沿设置定量标识线(M线)13(也可用检测窗边沿做定量标识线)；对应样品垫处设置加样孔11，对应稀释液垫4处设置清洗孔12。

本发明还提供了上述蓖麻毒素双孔快速定量检测卡检测样本的方法。

本发明所提供的检测样本的方法，包括下述步骤：从所述蓖麻毒素双孔快速定量检测卡的加样孔加入样本液，然后待样本液水印移动到所述检测卡试纸条中的定量标识线，再从清洗孔加入稀释液，最后通过检测窗口观测或通过相应仪器进行判读结果。

所述仪器如金标读数仪、荧光分析仪、上转换分析仪等。

具体使用时，从加样孔11加入样品液，一般样品液加入量为5-50μL，样品液经过滤物垫9、样品垫8和标记物垫5后进入NC膜3，由于稀释液垫4和吸水垫2均为干燥状态，并且样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和远小于两侧的吸水垫2和稀释垫4，因此样品液会带着标记物向层析膜两侧双向渗透，通过控制样品液加入量L，使样品液将带着标记物向NC膜3向两侧层析，将停留在NC膜(M)线13附近，且不会到达检测线7。相比现有技术，本发明使样本和标记物偶联的生物原料在NC膜上获得更充分反应时间。一般为0.5-5分钟样本流动的液迹出现在检测窗(M)处后，将稀释液(加入清洗孔12，清洗液首先经过稀释垫4，清洗液与其混合后进入NC膜3，此时NC膜3的湿度将大于标记物垫5，标记物垫5中残留的标记物只能是极少量向NC膜3中继续释放，于是NC膜3中将已经释放的带有标记示踪物的样本免疫复合液，在吸水垫2作用下，随着清洗液向吸水垫2方向流动，与T、C线上包被的抗体进行免疫结合，并被捕获停留在T、C线上，剩余物质通过侧向层析继续在NC膜上流动被吸水垫吸收，直至完成免疫层析。通过视窗孔10观测或通过仪器检测、判读检测线(T)、质控线(C)荧光信号。

初始状态NC膜3是处于干燥状态，样品液和标记物会快速释放到NC膜3上，基本不受样品差异影响，之后残留在标记物垫5中的标记物和样品液会缓慢进入到NC 膜3，此时的释放过程的快慢受样品差异影响较大，会影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔设置在NC膜中间偏稀释孔位置，样品液和标记物渗透到层析膜上后会向两测层析，甚至样本耗尽并停留在层析膜上，并通过延迟或满足预设条件后加入清洗液的操作设计方式，大大增加免疫反应时间(即样本与标记物之间的反应时间)，从而提高了检测灵敏度和精密度。

本发明通过清洗液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，可根据要求阻止样品液和标记物释放到NC膜3中，确保进入NC膜3的样品液和标记物的数量稳定，提高免疫层析法的稳定性和精密度。本发明通过样品液和清洗液分开加样的方式，可改善依靠样品液自清洗的清洗效率，最大限度地保证观视窗孔10中NC膜3的荧光背景。

本发明实现除控制第一次样本加样量、免疫反应时间定量外，再加一种对被测样本与标记物质反应量的控制，从而提高了侧流层析检测方法的灵敏度和精密度。

下面对本检测卡的制作过程进行具体说明。

下述实施例中：

鸡IgY购自杭州启泰生物科技有限公司；

羊抗鸡IgY的IgG购自杭州启泰生物科技有限公司；

镧系荧光微球购自成都微瑞生物科技有限公司。

蓖麻毒素的多克隆抗体、单克隆抗体的制备方法如下：

(1)蓖麻毒素的制备：

100g蓖麻种子，经浸泡、匀浆、离心等粗处理后沉淀得到所有蛋白，而后用透析、离心，取2mL上清加入介质半乳糖苷琼脂糖凝胶缓慢加入柱管中洗去杂蛋白,然后用 D-半乳糖一次性洗脱目的蛋白(包含RT和其凝集素)。将上述收集的洗脱液用PEG 20000进行浓缩后用Sephacryl S-100预装凝胶柱纯化得到蓖麻毒素。蓖麻毒素亲和纯化SDS-PAGE电泳图见图1。蓖麻毒素SDS–PAGE电泳图见图2

蓖麻毒素的鉴定

将纯化后的RT行免疫印迹分析(Western blot,WB)，然后将含有目的条带的电泳凝胶切下，通过半干转膜仪，将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，1mA/cm

(2)RT多克隆抗体制备：

以脱毒的蓖麻毒素蛋白作为免疫原，取200μg与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀，免疫新西兰纯种大耳白兔。两周后用0.5mg脱毒的蓖麻毒素蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫1次；隔三周后再用1mg脱毒的蓖麻毒素蛋白和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫1次；此后每周耳缘静脉采血，间接ELISA测定效价。加强免疫后，取血清进行多抗纯化。

(3)蓖麻毒素的单克隆抗体制备：

脱毒的蓖麻毒素抗原免疫小鼠，检测结果显示与目的蛋白反应效价较强时，取出小鼠脾脏，在铜网上研碎收集好，和SP/0骨髓瘤细胞一起加到融合管内融合，最后在 96孔细胞培养板上用5％CO

实施例1、制备蓖麻毒素检测卡

蓖麻毒素检测原理(双抗体夹心法)：如图1所示的检测卡，在NC膜质控线6包被羊抗鸡IgY的IgG，检测线7包被蓖麻毒素多克隆抗体，在标记物垫中放置采用镧系荧光微球标记蓖麻毒素单抗。

步骤一，把NC膜(Sartorius CN140)粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在NC膜上喷涂已稀释至0.3mg/ml的羊抗鸡IgY的IgG形成质控线(C线)和已稀释至2mg/mL的蓖麻毒素多克隆抗体形成检测线(T线)，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制16小时；

步骤二，制备标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有蓖麻毒素单抗的镧系荧光微球。将1mL的镧系荧光微球加入到5mL的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.05M， pH7.2)中，再加入10mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2) 复溶，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡IgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记蓖麻毒素单克隆抗体的镧系荧光微球；

步骤三，把标记有鸡IgY和标记有蓖麻毒素单克隆抗体的镧系荧光微球分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml混在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在聚酯膜上构成标记物垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四，把标记物垫切成8mm长，样品垫也切成8mm长，然后通过双面胶叠加粘在一起，然后用连续切割机切成5mm宽的加样条，并把它们组装在检测卡外壳上盖的加样孔下面；

步骤五，把305mm长、12mm宽的稀释垫和305mm长、17mm宽的吸水垫对应粘在PVC底板上的NC膜两端(叠加的宽度均为1-2mm)，组装成大卡，再用连续切割机切成4.15mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳下盖内，把检测卡的上、下盖扣合在一起即得到蓖麻毒素快速检测卡。

进行检测时，在加样孔中加入40μL血清血浆或全血样本，2-3分种后样本液迹移至定量标识线(M)时，再在清洗孔中加入80μL清洗液层析17-18分钟，最后通过荧光分析仪器进行检测。

制备蓖麻毒素检测标准曲线：

配置含有蓖麻毒素的校准液梯度稀释9份，浓度分别0ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、 1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml，取标准液40uL分别加入蓖麻毒素荧光检测卡的加样孔内，校准液迹流至定量标识线(M)13后，加入80uL 稀释液，静置免疫反应10-15分钟后，通过荧光分析仪进行检测，将测得的检测结果，计算出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度比值，并根据此数据进行线性回归制出蓖麻毒素的标准曲线如图6。

蓖麻毒素检测：

在加样孔加入40uL待测样品，当液迹流到定量标识线，加80uL稀释液，免疫反应15-20min，采用成都微瑞生物科技有限公司WR-1608型荧光分析仪对检测卡进行检测，获取检测线和质控线的荧光信号强度比值，荧光分析仪自动依据蓖麻毒素标准曲线，快速计算得出待测样本中蓖麻毒素的含量。

配制8ng/m L质控样本，检测5份验证。

按上述方法操作，加入40uL样本和80uL稀释液，稀释液为PBS，免疫反应时间为20分钟。检测结果分别为7.82ng/mL、7.96ng/mL、8.16ng/mL、7.65ng/mL、8.38ng/mL， 5份检测的均值为7.99ng/mL，其CV＝3.59。检侧结果显示蓖麻毒素荧光试剂卡的稳定性和准确性都很好。

灵敏度实验：

用蓖麻毒素标准品配制5ng/mL的标准液，并将其稀释2倍、4倍、8倍、16倍、 32倍，分别加样和检测，结果如下：5.29ng/mL、2.67ng/mL、1.09ng/mL、0.62ng/mL、 0ng/mL。结果证明灵敏度能够达到0.5ng/mL。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限以限制于本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。