2′FANA修饰的FOXP3反义寡核苷酸及其使用方法

根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年9月26日提交的美国序列号62/737,061和2018年9月28日提交的美国序列号62/739,001的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。

所附序列表中的材料由此通过引用并入本申请。所附序列表文本文件名为AUM1190_2WO_Sequence_Listing.txt，其创建于_______，大小为____kb。可以在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word访问所述文件。

本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助金5R01CA177852和5R01AI123241之下在政府的支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明总体上涉及杂合嵌合体反义寡核苷酸，更具体地涉及包含脱氧核糖核苷酸和2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸的反义寡核苷酸用于降低Foxp3基因的表达水平，提供抗肿瘤活性和治疗癌症的用途。

背景技术

癌症是一种以细胞生长和转移不受控制为特征的异质性病状，其导致显著的发病率和死亡率。在男性和女性中，超过四分之一的癌症相关死亡是由肺癌引起的，据估计，2018年美国的这一数字为154,050。尽管在外科手术、放射、化学疗法和其它治疗中取得了进步，但当前所有阶段的肺癌的5年存活率为18.6％。

如此高的死亡率的原因之一是肿瘤能够逃避免疫系统的破坏。已证明成功地将CD8

被称为反义寡核苷酸(ASO或AON)的单链合成寡核苷酸是核酸治疗剂的一种手段。它们识别靶RNA的序列，并可以实现基因沉默。发生这种情况的机制可能有多种，其中一种是，核糖核酸酶H一旦结合到AON后便介导靶RNA的裂解。尽管常规的AON在发现和临床前研究中已经很有效，但将其转移至临床却面临着诸多挑战，包含靶标可及性、脱靶作用、稳定性差以及向靶细胞递送差。

当前，对利用下一代AON化学物质减少Treg免疫抑制并增强抗肿瘤免疫力(尤其在肺癌中)的新治疗剂的需求尚未得到满足。

发明内容

本发明基于以下重大发现：可以使用结合到Foxp3 mRNA的包含脱氧核糖核苷酸和2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸的杂合嵌合体反义寡核苷酸来降低Foxp3基因的表达水平，提高抗肿瘤活性和治疗癌症。

在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的反义寡核苷酸(AON)，其包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)，其中所述AON结合到Foxp3 mRNA。

在各个方面中，2′-FANA修饰的核苷酸根据式1-16中的任一个进行定位。在一个方面中，所述2′-FANA修饰的核苷酸根据式6进行定位。在某些方面中，所述2′-FANA修饰的核苷酸的核苷酸之间的核苷酸间键为磷酸二酯键、磷酸三酯键、硫代磷酸酯键(5′O-P(S)O-3O-、5′S-P(O)O-3′-O-和5′O-P(O)O-3′S-)、二硫代磷酸酯键、Rp-硫代磷酸酯键、Sp-硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键、亚甲基键(甲基亚氨基)、酰胺键(3′-CH2-CO-NH-5′和3′-CH2-NH-CO-5′)、甲基膦酸酯键、3′-硫代甲缩醛键、(3′S-CH2-O5′)、酰胺键(3′CH2-C(O)NH-5′)、氨基磷酸酯基团及其组合。

在各个方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在一些方面中，所述2′-FANA AON包含5′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸和3′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸，其侧接在包含约0到约20个脱氧核糖核苷酸残基的序列上。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192、SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在另一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包含经修饰的反义寡核苷酸(AON)，所述经修饰的反义寡核苷酸包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)和药学上可接受的载体，其中所述AON结合到Foxp3 mRNA。

在各个方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在一些方面中，所述2′-FANA AON包含5′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸和3′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸，其侧接在包含约0到约20个脱氧核糖核苷酸残基的序列上。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192、SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在另一个实施例中，本发明提供了一种降低细胞中的Foxp3基因的表达水平的方法，其包含使所述细胞与至少一个反义寡核苷酸(AON)接触，其中所述AON结合到Foxp3mRNA，并且其中所述AON包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)。

在一个方面中，所述细胞是调节性T细胞(Treg)。在各个方面中，所述Treg表达细胞标志物CD4和CD25。

在其它方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在各个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192、SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在另一个实施例中，本发明提供了一种提高有需要的受试者中的抗肿瘤免疫力的方法，其包含向所述受试者施用至少一个反义寡核苷酸(AON)，其中所述AON结合到Foxp3mRNA，并且其中所述AON包含至少一个2′-脱氧2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)。

在一个方面中，所述AON降低调节性T细胞(Treg)的活性。在一些方面中，所述Treg表达细胞标志物CD4和CD25。在各个方面中，所述AON诱导Treg细胞凋亡。在另一方面中，所述AON提高免疫细胞的活性。在某些方面中，所述免疫细胞是CD8

在各个方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，并且其中所述AON是2′-FANA AON。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192、SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在又一个实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包含向所述受试者施用至少一个反义寡核苷酸(AON)，其中所述AON结合到Foxp3mRNA，并且其中所述AON包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)。

在各个方面中，所述AON降低Foxp3基因的表达水平。在一些方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192、SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在各个方面中，所述2′-FANA AON提高所述受试者中的抗肿瘤免疫力。在一些方面中，所述2′-FANA AON降低调节性T细胞(Treg)的活性和/或提高免疫细胞的活性。

在某些方面中，所述AON进一步包含药学上可接受的载体。在其它方面中，进一步施用免疫治疗剂和/或化学治疗剂。在某些方面中，所述免疫治疗剂和/或化学治疗剂是检查点抑制剂、疫苗、嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法、抗PD-1抗体(纳武单抗或派姆单抗)、抗PD-L1抗体(阿特珠单抗、阿维鲁单抗或得瓦鲁单抗)及其组合。在其它方面中，所述免疫治疗剂和/或化学治疗剂在施用所述AON之前、同时或之后施用。在某些方面中，进一步施用放射疗法。在某些方面中，所述放射疗法在施用所述AON之前、同时或之后施用。

在某些方面中，所述癌症是乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤和胶质母细胞瘤。在一个方面中，所述癌症是肺癌。

附图说明

图1示出了流式细胞术点图，其示出了脾细胞群中的Foxp3表达细胞的数量。杂乱对照(scramble)：对照FANA反义寡核苷酸；Foxp3-1到9：靶向Foxp3的九种不同的FANA寡核苷酸；2.5uM和5uM：Foxp3 FANA的浓度；荧光：阴性对照，细胞的自发荧光。

图2示出了流式细胞术点图，其示出了纯化Treg细胞群中的Foxp3表达细胞的数量。杂乱对照：对照FANA反义寡核苷酸；Foxp3-1到9：靶向Foxp3的九种不同的FANA寡核苷酸；2.5uM和5uM：Foxp3 FANA的浓度。

图3示出了流式细胞术点图，其示出了Foxp3 FANA对Foxp3表达细胞的数量的体内作用。

图4示出了流式细胞术点图，其示出了脾脏、淋巴结和血细胞对APC标记FANA的体内细胞摄取。IV：静脉内。

图5示出了流式细胞术点图，其示出了脾脏、淋巴结和血液的非Treg Foxp3+细胞对标记FANA的体内细胞摄取。IV：静脉内。

图6示出了流式细胞术点图，其示出了脾脏、淋巴结和血液的Treg细胞对标记FANA的体内细胞摄取。IV：静脉内。

图7示出了共聚焦显微镜图像，其示出了Foxp3表达细胞对FANA反义寡核苷酸的摄取。N：核，*：FANA；箭头：Foxp3。

图8A-8B示出了Foxp3-FANA对通过蛋白质印迹测量的Foxp3的蛋白表达水平的体外作用。图8A是示出了Foxp3表达的免疫印迹；图8B示出了Foxp3定量。

图9A-9B示出了Foxp3 FANA对通过蛋白质印迹测量的Foxp3的蛋白表达水平的体内作用。B6：未处理对照。图9A是示出了Foxp3表达的免疫印迹；图9B示出了Foxp3定量。

图10示出了直方图，其示出了Treg免疫抑制测定。

图11示出了流式细胞术点图，其示出了Foxp3 FANA对Treg抑制功能的体内作用。*：相较于对照的显著差异。

图12A-12B示出了Foxp3 FANA对通过蛋白质印迹测量的Foxp3的蛋白表达水平的体内作用。图12A是示出了Foxp3表达的免疫印迹；图12B示出了Foxp3定量。

图13示出了生长曲线，其示出了Foxp3 FANA对肿瘤生长的体内作用。

图14A-14C示出了AUM-FANA-6在小鼠中对TC1肺肿瘤生长的体内作用。图14A示出了生长曲线，其示出了在对照和AUM-FANA-6(SEQ ID NO:26)处理小鼠中的肿瘤体积；图14B示出了个体生长曲线，其示出了Foxp3 AUM-FANA-6(SEQ ID NO:304)对肿瘤生长的体内作用；图14C示出了Foxp3

图15A-15B示出了Foxp3 FANA对通过流式细胞术测量的肿瘤内Foxp3

图16A-16B示出了Foxp3 FANA对通过流式细胞术测量的脾内Foxp3

图17示出了免疫印迹，其示出了在用0.1或0.5μM AUM-FANA-6(SEQ ID NO:26)处理之后的Foxp3的体外敲除。

图18示出了流式细胞术点图，其示出了九种不同的FANA对鼠脾细胞中Foxp3

图19A-19B示出了AUM-FANA-5(SEQ ID NO:25)、AUM-FANA-5B(SEQ ID NO:303)、AUM-FANA-6(SEQ ID NO:26)和AUM-FANA-6B对Treg抑制功能的体外作用。图19A示出了直方图，其示出了Treg增殖；图19B示出了分裂细胞的定量。

图20示出了免疫印迹，其示出了Foxp3 FANA对荷瘤小鼠的引流淋巴结中的Foxp3表达的体内作用。

图21A-21B示出了Foxp3 AUM-FANA-6B(SEQ ID NO:304)在小鼠中的肺肿瘤生长中的体内作用。图21A示出了随时间的肿瘤生长；图21B是示出了实验结束时的定量的图条。

图22示出了Foxp3 FANA对肺癌小鼠模型中的抗肿瘤免疫力的体内作用。LN：淋巴结；SP：脾脏，T：肿瘤。

具体实施方式

本发明基于以下重大发现：可以使用结合到Foxp3 mRNA的包含脱氧核糖核苷酸和2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸的杂合嵌合体反义寡核苷酸来降低Foxp3基因的表达水平，提高抗肿瘤活性和治疗癌症。

在描述本组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为此些组合物、方法和条件可以有所不同。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并非旨在是限制性的，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限定。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种”和“所述”包含复数个指代物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“所述方法”的指代包含对于本领域技术人员在阅读本公开等之后将变得显而易见的本文描述的类型的一种或多种方法和/或步骤。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地并单独地指出以通过引用并入一样。

除非另有限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是将理解，在本公开的精神和范围内涵盖各种修改和变型。现在描述优选的方法和材料。

在一个实施例中，本发明提供了一种经修饰的反义寡核苷酸(AON)，其包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)，其中所述AON结合到Foxp3 mRNA。

如本文使用，“经修饰的反义寡核苷酸”是指含有经修饰的糖的合成反义寡核苷酸(AON)。AON是单链寡核苷酸，其经由瓦特生-克里克碱基配对识别核酸序列并引起转录前或转录后基因沉默。AON结合到其靶mRNA，并形成由核糖核酸酶H识别的双链体，这进而诱导了mRNA的裂解、翻译机制的空间阻断或阻止了必要的RNA相互作用。

糖修饰的寡核苷酸在本领域中是熟知的(例如，参见美国专利第8,178,348号和美国专利申请号2005/0233455、2009/015467和2005/0142535)。这些抗核酸酶的寡核苷酸可以与DNA和RNA序列形成双链体，并且从而抑制基因表达。已经描述了几种类型的类似物，其中评定例如糖、糖主链或核苷酸间键的变化作为调节酶稳定性、双链体形成能力或核糖核酸酶H募集的方式，旨在设计能够形成核糖核酸酶H对其具有很强亲和力的更稳定的复合物的临床相关分子，从而导致更有效的基因沉默。

在所述类似物中，已经描述并合成了混合主链寡核苷酸(MBO)，其包含磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸，以使其更适合作为核糖核酸酶H的底物；含有六吡喃糖而不是戊呋喃酶的寡核苷酸，例如包含无环主链并且通常酶稳定性提高但双链形成能力降低的肽核酸(PNA)；和本文所用和下文进一步描述的阿拉伯核苷。

此外，还已经描述了嵌合体寡核苷酸，其包括与未经修饰的核苷交替的经修饰的核苷，并且已知其对细胞和生物体中的基因表达有强烈影响。

已知改善核苷酸稳定性的化学策略，其包含修饰核糖糖部分、磷酸二酯主链和碱基。特别地，磷酸二酯主链通常被硫代磷酸酯(PS)主链代替。当主链中的非桥联原子中的一个被硫取代时，即制得PS主链。例如，如本文使用，对核糖的2′位进行的修饰产生阿拉伯核苷，例如2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA)修饰的核苷酸。

Foxp3，也称为叉头框P3或scurfin，是一种参与免疫系统应答的蛋白质。作为FOX蛋白家族的成员，Foxp3似乎在调节性T细胞的发育和功能中起着调节途径的主要调节剂的作用。尽管尚未建立精确的控制机制，但FOX蛋白属于转录调节子的叉头/翼状螺旋家族，并且被认为在转录期间经由相似的DNA结合相互作用而施加控制。在调节性T细胞模型系统中，FOXP3转录因子占用了调节性T细胞功能相关基因的启动子，并且可能在刺激T细胞受体之后抑制关键基因的转录。

Foxp3是天然T调节细胞(nTreg)(一种T细胞和适应性/诱导性T调节细胞(a/iTreg)谱系)的特异性标记，其也可通过其它特异性较低的标志物(例如，CD25或CD45RB)进行标识。在动物研究中，表达Foxp3的Treg对免疫耐受(尤其是自身耐受)的转移至关重要。

在各个方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。

在某些实施例中，本发明的经修饰的AON包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸。在各个实施例中，所述经修饰的AON包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个2′-FANA修饰的核苷酸。在其它实施例中，本发明的经修饰的AON包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个2′-FANA修饰的核苷酸。

“天然存在的核苷酸”或“未经修饰的核苷酸”含有易于被核酸酶降解的正常存在的糖(D-核糖和D-2-脱氧核糖)和磷酸二酯主链。如本文使用，未经修饰的核苷酸被称为脱氧核糖核苷酸。

如本文使用，“2′-FANA修饰的AON”或“2′-FANA AON”或“Foxp3 FANA”等是指靶向Foxp3 mRNA的一部分的AON。2′-FANA AON被设计成靶向Foxp3 mRNA表达的一部分。2′-FANAAON是由于将至少一个2′-FANA修饰的核苷酸掺入反义寡核苷酸而产生的。本文所述的经修饰的合成寡核苷酸包含具有2′-FANA修饰的至少一个核苷酸，2′-FANA寡核苷酸(2′-FANAAON或2′-FANA ASO)也是如此。这些经修饰的合成寡核苷酸可以包含硫代磷酸酯主链。它们还可以包含其它主链修饰，这将在本公开中稍后进行讨论。2′-FANA核苷酸的掺入赋予了对于靶标的高稳定性、特异性和亲和力。2′-FANA ASO还能够进行自身递送，这便无需递送剂。递送剂的缺少降低了各种模型中的毒性。因此，在一些实施例中，2′-FANA AON的至少一部分与对应于Foxp3基因的mRNA序列的一部分互补。2′-FANA AON可以被设计成靶向并结合到Foxp3 mRNA的全部或部分。在一些实施例中，根据本文描述的任何实施例的包括2′-FANA修饰的序列的合成AON抑制Foxp3的表达。在某些实施例中，本文所述的2′FANA修饰的AON通过结合到mRNA的一部分并触发核糖核酸酶H进行的裂解来抑制Foxp3细胞的表达。

2′FANA寡核苷酸的化学性质和结构已在别处进行了详细描述(参见例如美国专利第8,278,103号和第9,902,953号，其各自具体地通过引用整体并入本文)。本文公开的2′-FANA AON及其使用方法考虑了本领域已知的任何FANA化学性质。在一些实施例中，2′-FANAAON包括包括磷酸酯的核苷间键，从而是寡核苷酸。在一些实施例中，糖修饰的核苷和/或2′-脱氧核苷包括磷酸酯，从而是糖修饰的核苷酸和/或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，2′-FANA AON包括包括硫代磷酸酯的核苷间键。在一些实施例中，所述核苷间键选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、Rp-硫代磷酸酯、Sp-硫代磷酸酯。在一些实施例中，2′-FANA AON包括选自由以下组成的群组的一个或多个核苷酸间键：(a)磷酸二酯；(b)磷酸三酯；(c)硫代磷酸酯；(d)二硫代磷酸酯；(e)Rp-硫代磷酸酯；(f)Sp-硫代磷酸酯；(g)硼烷磷酸酯；(h)亚甲基(甲基亚氨基)(3′CH2-N(CH3)-O5′)；(i)3′-硫代甲缩醛(3′S-CH2-O5′)；(j)酰胺(3′CH2-C(O)NH-5′)；(k)甲基膦酸酯；(l)氨基磷酸酯(3′-OP(O2)-N5′)；和(m)(a)到(l)的任何组合。

在一些实施例中，利用了包括糖修饰的核苷酸(例如，阿拉伯核苷酸类似物[例如，2′-FANA])和2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)的交替片段或单元的2′-FANA AON。在一些实施例中，本文公开的2′-FANA AON包括糖修饰的核苷酸和2′-脱氧核苷酸片段中的每一种的至少2个，从而总体上具有至少4个交替的片段。每个交替的片段或单元可以独立地含有1个或多个核苷酸。在一些实施例中，每个交替的片段或单元可以独立地含有1个或2个核苷酸。在一些实施例中，所述片段各自包括1个核苷酸。在一些实施例中，所述片段各自包括2个核苷酸。在一些实施例中，所述多个核苷酸可以由2、3、4、5或6个核苷酸组成。2′-FANA AON可以含有奇数或偶数个交替的片段或单元，并且可以以含有糖修饰的核苷酸残基或DNA残基的片段开始和/或终止。因此，2′-FANA AON可以表示如下：

A1-D1-A2-D2-A3-D3...Az-Dz，

其中A1、A2等各自表示一个或多个(例如，1个或2个)糖修饰的核苷酸残基(例如，2′-FANA)的单元，而D1、D2等各自表示一个或多个(例如，1个或2个)DNA残基的单元。每个单元内的残基的数量可以是彼此间相同或不同的。寡核苷酸可以具有奇数或偶数个单元。寡核苷酸可以以含有糖修饰的核苷酸的单元(例如，含有2′-FANA的单元)或含有DNA的单元开始(即在其5′端)。寡核苷酸可以以含有糖修饰的核苷酸的单元或含有DNA的单元终止(即在其3′端)。单元的总数可以少至4个(即每种类型至少2个)。

在一些实施例中，本文公开的2′-FANA AON包括阿拉伯核苷酸和2′-脱氧核苷酸的交替片段或单元，其中所述片段或单元各自分别独立地包括至少一个阿拉伯核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，所述片段各自独立地包括1到2个阿拉伯核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，所述片段各自独立地包括2到5个或3到4个阿拉伯核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，本文公开的2′-FANA AON包括阿拉伯核苷酸和2′-脱氧核苷酸的交替片段或单元，其中所述片段或单元各自分别包括一个阿拉伯糖核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，所述片段各自独立地包括约3个阿拉伯核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，本文公开的2′-FANA AON包括阿拉伯核苷酸和2′-脱氧核苷酸的交替片段或单元，其中所述片段或单元各自分别包括一个阿拉伯糖核苷酸或2′-脱氧核苷酸。在一些实施例中，本文公开的2′-FANA AON包括阿拉伯核苷酸和2′-脱氧核苷酸的交替片段或单元，其中所述片段或单元各自分别包括两个阿拉伯核苷酸或2′-脱氧核苷酸。

在一些实施例中，本文公开的2′-FANA AON具有选自由以下组成的群组的结构：

a)(Ax-Dy)n I

b)(Dy-Ax)n II

c)(Ax-Dy)m-Ax-Dy-Ax III

d)(Dy-Ax)m-Dy-Ax-Dy IV

其中m、x和y各自独立地为大于或等于1的整数，n为大于或等于2的整数，A为糖修饰的核苷酸，并且D为2′-脱氧核糖核苷酸。

例如，本文公开的2′-FANA AON具有结构I，其中x＝1，y＝1且n＝10，从而具有以下结构：

A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构II，其中x＝1，y＝1且n＝10，从而具有以下结构：

D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构III，其中x＝1，y＝1且n＝9，从而具有以下结构：

A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构IV，其中x＝1，y＝1且n＝9，从而具有以下结构：

D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D-A-D

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构I，其中x＝2，y＝2且n＝5，从而具有以下结构：

A-D-D-D-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-D-A-A-D-D

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构II，其中x＝2，y＝2且n＝5，从而具有以下结构：

D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-D-A-A

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构III，其中x＝2，y＝2且m＝4，从而具有以下结构：

A-D-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-D-A-A-D-D-A-A

在另一个实例中，本文公开的2′-FANA AON具有结构IV，其中x＝2，y＝2且m＝4，从而具有以下结构：

D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D-A-A-D-D

在各个方面中，2′-FANA修饰的核苷酸根据式1-16中的任一个进行定位。在一个方面中，2′-FANA修饰的核苷酸根据式6进行定位。

经修饰的2′-FANA AON序列可以包含序列中所有或仅部分核苷酸的经修饰的糖部分。在一些实施例中，所述AON可以在序列中具有所有经修饰的糖部分核苷酸。在一些实施例中，所述AON的长度可以在1和60个核苷酸之间。在一些实施例中，所述AON可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上未经修饰的核苷酸。

在一些实施例中，至少一个未经修饰的核苷酸位于具有经修饰的糖部分的核苷酸串之间的AON中。例如，经修饰的AON可以具有一串至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个2′-FANA修饰的核苷酸，随后是一串至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个未经修饰的核苷酸，再随后是另一串至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个2′-FANA修饰的核苷酸。在某些实施例中，当一个或多个未经修饰的核苷酸侧接有2′FANA-修饰的核苷酸时，所述未经修饰的核苷酸部分可以被称为“核苷酸缺口序列”。所述缺口序列可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上未经修饰的核苷酸组成。在一些实施例中，所述AON可以在同一分子中具有单个缺口序列或可以具有一个以上的核苷酸缺口序列。所述未经修饰的核苷酸缺口序列的每一侧上的2′-FANA修饰的核苷酸串可以具有相同或不同的长度。例如，所述AON可以具有8个2′-FANA修饰的核苷酸，随后是7个未经修饰的核苷酸，再随后是第二串2′-FANA修饰的核苷酸，其2′-FANA修饰的核苷酸的数量与第一修饰串相同或不同。在某些实施例中，所述AON由2′-FANA糖修饰的核苷酸序列组成，其侧接在未经修饰的核苷酸的缺口序列上。例如，所述AON包括长度为1至10个核苷酸的2′-FANA修饰序列，然后是长度为1至10个核苷酸的未经修饰的核苷酸序列，随后是长度为1至10个核苷酸的另一个2′-FANA修饰序列，其中这种经修饰和未经修饰的核苷酸的模式可以任选地重复。表1示出了21长寡核苷酸中的未经修饰的核苷酸和2′-FANA修饰的核苷酸的示例性布置。

表1：在21聚体2′-FANA AON中的示例性2′-FANA核苷位置

表1中示出的式可以应用于SEQ ID No:1-9、31-138、11-19、139-192或其部分的任何序列，其中X表示核苷酸(A、C、G、T或U)，而加粗和加下划线的核苷酸表示2′-FANA修饰的核苷酸。

在某些方面中，所述2′-FANA修饰的核苷酸的核苷酸之间的核苷酸间键是磷酸二酯键、磷酸三酯键、硫代磷酸酯键(5′O-P(S)O-3O-、5′S-P(O)O-3′-O-和5′O-P(O)O-3′S-)、二硫代磷酸酯键、Rp-硫代磷酸酯键、Sp-硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键、亚甲基键(甲基亚氨基)、酰胺键(3′-CH2-CO-NH-5′和3′-CH2-NH-CO-5′)、甲基膦酸酯键、3′-硫代甲缩醛键、(3′S-CH2-O5′)、酰胺键(3′CH2-C(O)NH-5′)、氨基磷酸酯基团及其组合。

在一些方面中，所述2′-FANA AON包含5′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸和3′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸，其侧接在包含约0到约20个脱氧核糖核苷酸残基的序列上。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ IDNO:31-138、SEQ ID NO:139-192、SEQ ID NO:193-302、来自表2的任何序列或与其互补的序列的连续核苷酸。

本发明的2′-FANA AON包括至少5个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ IDNO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302的连续核苷酸。在一些实施例中，所述多个核苷酸包括SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302(表2)或其中每一个的等同物的核苷酸序列中的任何一个。为了本公开的目的，在相同位置处具有胸腺嘧啶或尿嘧啶的分子被认为是以下序列的等同物。在一些实施例中，所述经修饰的合成2′-FANA AON与SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302中的任何一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。

表2：2′-FANA寡核苷酸序列

[FANA A、U、C、G]：FANA修饰的碱基；A、T、G、C：未经修饰的DNA碱基；*-硫代磷酸酯键

根据本文所述的实施例的经修饰的AON的非限制性实例可以包含但不限于表1中的式中列出的任何配置的序列SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQID:31-138\SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302中的任何一个。

在另一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包含经修饰的反义寡核苷酸(AON)，所述经修饰的反义寡核苷酸包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)和药学上可接受的载体，其中所述AON结合到Foxp3 mRNA。

“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与调配物的其它成分相容并且对其接受者无害。例如，所述载体、稀释剂或赋形剂或其组合物可能不会引起任何不期望的生物学作用或以不期望的方式与其所含有的药物组合物的任何其它组分相互作用。

在各个方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在一些方面中，所述2′-FANA AON包含5′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸和3′端的约0到约20个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸，其侧接在包含约0到约20个脱氧核糖核苷酸残基的序列上。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在另一个实施例中，本发明提供了一种降低细胞中的Foxp3基因的表达水平的方法，其包含使所述细胞与至少一个反义寡核苷酸(AON)接触，其中所述AON结合到Foxp3mRNA，并且其中所述AON包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)。

如本文使用，“至少一个”是指施用一个或多个2′-FANA AON以提高和/或增强期望作用。为了达到这种作用，可以向同一受试者施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的2′-FANA AON，以协同作用。所述至少一个2′-FANA AON(也被称为“多个2′-FANA AON”)可以一次一个、一次多个或一次全部施用，这取决于所寻求的转归、受试者的身体状态或可能影响施用方案的任何其它参数(例如，进化或进展或疾病状态)。

在一个方面中，使2、3、4、5、6、7、8、9或10个AON与细胞接触。

所述合成AON可以以任何合适的方式递送以允许细胞接触和摄取AON，并且可以这样做而无需递送媒剂或转染剂。在一些实施例中，递送方法包含转染技术，包含但不限于电穿孔或显微注射。在其它实施例中，递送方法是自主式的(gymnotic)。可以使细胞与AON以及转染剂或递送媒剂或其它转染方法接触。转染试剂和方法的非限制性实例包含：基因枪、电穿孔、纳米颗粒递送(例如，PEG包被的纳米颗粒)、阳离子脂质和/或聚合物、两性离子脂质和/或聚合物、中性脂质和/或聚合物。具体实例包含：体内jetPEI、X-tremeGENE试剂、DOPC中性脂质体、含环糊精的聚合物CAL101和脂质纳米颗粒。

在一个实施例中，所述细胞是体外培养细胞群中的一个。在另一个实施例中，所述细胞是活宿主或受试者中的细胞群的一部分。例如，出于沉默细胞的FOXP3基因表达的目的，可以在体内环境中将AON递送到细胞。另外，可以将AON递送到培养细胞，以便研究其对所讨论的细胞类型的作用。

如本文使用，“降低Foxp3基因的表达水平”是指低于细胞与AON接触之前的表达水平的Foxp3基因的表达水平的任何变化。短语“Foxp3的表达水平”旨在无区别地指蛋白质和mRNA表达水平。

在一个方面中，所述细胞是调节性T细胞(Treg)。

术语“Treg”与“调节性T细胞”或“抑制性T细胞”互换使用。它在本领域中具有一般意义，并且是指调节免疫系统，维持对自身抗原的耐受性和预防自身免疫性疾病的T辅助细胞的子集。Treg是免疫抑制性细胞，并且通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg表达生物标志物CD4、FOXP3和CD25，并且被认为与初始CD4细胞源于同一谱系。

免疫系统必须能够区分自身和非自身。当自身/非自身区分失败时，免疫系统可能破坏人体的细胞和组织(这导致自身免疫性疾病)，或者无法破坏异常细胞(例如，癌细胞)(这导致抗肿瘤免疫力抑制)。

调节性T细胞主动地抑制免疫系统的激活并预防病理性自身反应(即自身免疫性疾病)。调节性T细胞在免疫系统内发挥的关键作用由调节性T细胞的遗传缺陷导致的严重自身免疫性综合征以及所观察到的调节性T细胞活性过高可阻止免疫系统破坏癌细胞所证明。确实，Treg在患有癌症的个体中往往会上调，并且它们似乎被募集到许多肿瘤的部位。在人类和动物模型中的研究都已表明，肿瘤微环境中的大量的Treg指示预后不良，并且Treg被认为抑制肿瘤免疫力，从而阻碍了人体控制癌细胞生长的先天能力。

调节性T细胞可以产生颗粒酶B，而颗粒酶B可以诱导效应T细胞的凋亡。调节性T细胞进行抑制的另一主要机制是通过CTLA-4分子的作用，防止通过在效应T细胞的表面表达的CD28受体的共刺激。

在各个方面中，所述Treg表达细胞标志物CD4和CD25。

短语“分子标志物”与短语“细胞标志物”、“细胞表面标志物”或“细胞表面蛋白”交替使用，是指在细胞的表面处表达的任何蛋白质，并且可以例如用于将一种细胞类型与另一种细胞类型进行区分。

“多肽”或“蛋白质”是指由经由肽键连接的氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。合成多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。术语“蛋白质”通常是指通常超过100个氨基酸的大多肽。术语“肽”通常是指通常少于100个氨基酸的短多肽。

在其它方面中，所述AON是包括包含一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在各个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在另一个实施例中，本发明提供了一种提高有需要的受试者中的抗肿瘤免疫力的方法，其包含向所述受试者施用至少一个反义寡核苷酸(AON)，其中所述AON结合到Foxp3mRNA，并且其中所述AON包含至少一个2′-脱氧2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)。在一个方面中，向所述受试者施用2、3、4、5、6、7、8、9或10个AON。

如本文使用，“抗肿瘤免疫力”是指具有抗肿瘤作用(即靶向肿瘤/癌细胞以帮助身体对抗癌症)的免疫应答。抗肿瘤免疫力依赖于先天性免疫和获得性免疫。

术语“免疫应答”是指对抗原的整体身体应答，并且优选地是指细胞免疫应答或细胞以及体液免疫应答。所述免疫应答可以是保护性/防止性/预防性和/或治疗性的。

细胞应答涉及被称为用作“辅助细胞”或“杀伤细胞”的T细胞或T淋巴细胞的细胞。辅助T细胞(也被称为CD4

本发明的AON被设计成靶向Treg细胞中的Foxp3 mRNA表达的一部分，以降低Treg功能并提高抗肿瘤免疫力。抗肿瘤免疫力的这种提高可以有助于治疗患者。因此，在一些实施例中，所述2′-FANA AON的至少一部分与对应于Foxp3基因的mRNA序列的一部分互补。所述2′-FANA AON可以被设计成靶向并结合到Foxp3 mRNA的全部或部分。

如本文使用，术语“受试者”是指对其进行主题方法的任何个人或患者。通常，所述受试者是人类，但如本领域技术人员将理解，所述受试者可以是动物。因此，其它动物，包含脊椎动物，例如啮齿动物(包含小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子，农场动物(包含牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡等)以及灵长类动物(包含猴子、黑猩猩、红毛猩猩和大猩猩)包含在受试者的定义内。

术语“施用(administration of/administering)”应被理解为是指向有需要的受试者提供治疗有效量的药物组合物，以实现期望的转归。

在一个方面中，所述AON降低调节性T细胞(Treg)的活性。在一些方面中，所述Treg表达细胞标志物CD4和CD25。在各个方面中，所述AON诱导Treg细胞凋亡。

在另一方面中，所述AON提高免疫细胞的活性。在某些方面中，所述免疫细胞是CD8

在本发明的上下文中，术语“免疫反应性细胞”、“免疫细胞”或“免疫效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。“免疫细胞”优选地能够结合抗原或表征为抗原或源于抗原的抗原肽的呈递的细胞并介导免疫应答。例如，此类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，分泌抗体，识别癌细胞，并可选地消除此类细胞。例如，免疫细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。

在各个方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，其中所述AON是2′-FANA AON。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在又一个实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包含向所述受试者施用至少一个反义寡核苷酸(AON)，其中所述AON结合到Foxp3mRNA，并且其中所述AON包含至少一个2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(2′-FANA修饰的核苷酸)。在一个方面中，向所述受试者施用2、3、4、5、6、7、8、9或10个AON。

术语“治疗”在本文中与术语“治疗性方法”可互换使用，并且是指1)治愈、减慢、减轻所诊断的病状或病症的症状和/或中止其进展的治疗性治疗或措施，以及2)预防性/防止性措施。需要治疗的人可以包含已经患有特定医学病症的个体以及最终可能患有所述病症的个体(即需要防止性措施的个体)。如本文使用，术语“治疗”疾病是指降低疾病或病症的频率，降低受试者所经历的疾病或病症的一种或多种症状的一种症状的频率。

术语“治疗有效量”、“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“有效量”等是指研究人员、兽医、医生或其它临床医生正在寻找的引起组织、系统、动物或人类的生物学或医学应答的主题化合物的量。通常，所述应答是患者中的症状的改善或期望的生物学转归。此量应足以对施用所述化合物的受试者产生有益作用。所述有效量可以如本文所述确定。如本文使用，“治疗有效量”是足以向施用细胞的受试者提供有益作用的细胞量。

术语“施用”应被理解为是指向需要治疗的受试者提供治疗有效量的药物组合物。施用途径没有具体限制，并且可以包含口服、静脉内、肌肉内、输注、鞘内、皮内、皮下、舌下、颊、直肠、阴道、眼、耳道、鼻腔、吸入、雾化、皮肤、局部、透皮、腹膜内或肿瘤内施用。

术语“癌症”是指一组疾病，其表征为从一个部位(原发部位)开始的异常且不受控制的细胞增殖，并且有可能侵入并扩散到其它部位(继发部位，转移)(由此区分癌症(恶性肿瘤)和良性肿瘤)。几乎所有器官都可能受到影响，从而导致可能影响人类的100多种癌症。癌症可能由多种原因引起，包含遗传易感性、病毒感染、暴露于电离辐射、暴露于环境污染物、吸烟和酗酒、肥胖、饮食不良、缺乏体育活动或其任何组合。“癌细胞”或“肿瘤细胞”以及语法上的等同词是指源于肿瘤或癌前病变的总细胞群，包含包括肿瘤群的大部分的非致瘤细胞和致瘤干细胞(癌症干细胞)。

示例性癌症包含但不限于：成人急性成淋巴细胞性白血病；儿童急性成淋巴细胞性白血病；成人急性髓细胞性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；AIDS相关性淋巴瘤；AIDS相关性恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑肿瘤，脑干胶质瘤；儿童脑肿瘤，小脑星形细胞瘤；儿童脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；儿童脑肿瘤，室管膜瘤；儿童脑肿瘤，髓母细胞瘤；儿童脑肿瘤，幕上原始神经外胚叶肿瘤；儿童脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤；儿童(其它)脑肿瘤；乳腺癌；妊娠期乳腺癌；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌：儿童类癌瘤；胃肠道类癌瘤；肾上腺皮质癌；胰岛细胞癌；未知原发性癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增生性病症；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结肠直肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食道癌；儿童食道癌；尤文氏家族肿瘤；儿童颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(Gastric/Stomach)癌；儿童胃癌；胃肠道类癌瘤；儿童颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金氏淋巴瘤；儿童霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西氏肉瘤；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性成淋巴细胞性白血病；儿童急性成淋巴细胞性白血病；成人急性髓细胞性白血病；儿童急性髓细胞性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性成淋巴细胞性白血病；儿童急性成淋巴细胞性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；AIDS相关性淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；成人霍奇金氏淋巴瘤；儿童霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童髓母细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；梅克尔细胞癌；恶性间皮瘤；原发性隐匿性转移性鳞状颈癌；儿童多发性内分泌肿瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；蕈样真菌病；骨髓增生异常综合征；慢性骨髓性白血病；儿童急性髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生异常；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；神经母细胞瘤；成人非霍奇金氏淋巴瘤；儿童非霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低度恶性潜能肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；胰岛细胞胰腺癌；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚叶肿瘤；垂体瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠期乳腺癌；妊娠期霍奇金氏淋巴瘤；妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；肉瘤，尤文氏家族肿瘤；卡波西氏肉瘤；肉瘤(骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童肉瘤，横纹肌肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；赛扎里氏综合征；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；梅克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；转移性原发性隐匿性鳞状颈癌；胃癌；儿童胃癌；儿童幕上原始神经外胚叶肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；未知原发部位，儿童癌；儿童罕见癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；华氏巨球蛋白血症；和威尔姆氏瘤。

在某些方面中，所述癌症是乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、黑素瘤或胶质母细胞瘤。

在一个方面中，所述癌症是肺癌。

如本文使用，“肺癌”是指包含但不限于在所有进展阶段的所有类型的肺癌，其涵盖肺癌；转移性肺癌；非小细胞肺癌(NSCLC)的三种主要形式，即肺腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌；小细胞肺癌(SCLC)和间皮瘤。

在各个方面中，所述AON降低Foxp3基因的表达水平。在一些方面中，所述AON是包含至少一个2′-FANA修饰的核苷酸和至少一个未经修饰的脱氧核糖核苷酸的杂合嵌合体AON，并且其中所述AON是2′-FANA AON。在一个方面中，所述2′-FANA AON包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:11-19、SEQ ID NO:21-29、SEQ ID NO:31-138、SEQ ID NO:139-192或SEQ ID NO:193-302或与其互补的序列的连续核苷酸。

在各个方面中，所述2′-FANA AON提高所述受试者中的抗肿瘤免疫力。在某些方面中，所述2′-FANA AON降低调节性T细胞(Treg)的活性和/或提高免疫细胞的活性。

在某些方面中，所述AON进一步包含药学上可接受的载体。在其它方面中，进一步施用免疫治疗剂和/或化学治疗剂。

如本文使用，术语“免疫调节剂”或“免疫治疗剂”是指调节免疫系统的任何治疗剂。免疫调节剂的实例包含类二十烷酸、细胞因子、前列腺素、白介素、趋化因子、检查点调节剂、TNF超家族成员、TNF受体超家族成员和干扰素。免疫调节剂的具体实例包含PGI2、PGE2、PGF2、CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CCL26、CXCL7、CXCL10、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL15、IL17、IL17、INF-α、INF-β、INF-ε、INF-γ、G-CSF、TNF-α、CTLA、CD20、PD1、PD1L1、PD1L2、ICOS、咪喹莫特、CD200、CD52、LTα、LTαβ、LIGHT、CD27L、41BBL、FasL、Ox40L、April、TL1A、CD30L、TRAIL、RANKL、BAFF、TWEAK、CD40L、EDA1、EDA2、APP、NGF、TNFR1、TNFR2、LTβR、HVEM、CD27、4-1BB、Fas、Ox40、AITR、DR3、CD30、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、BAFFR、TACI、BCMA、Fn14、CD40、EDAR XEDAR、DR6、DcR3、NGFR-p75和Taj。免疫调节剂的其它实例包含特异性抗体，例如Actemra(托西珠单抗)、Cimzia(CDP870)、Enbrel(依那西普)、Kineret、阿巴西普(Orencia)、Remicade(英夫利昔单抗)、Rituxan(利妥昔单抗)、Simponi(戈利木单抗)、Avonex、Rebifif、ReciGen、Plegridy、Betaseron、Copaxone、Novatrone、Tysabri(那他珠单抗)、Gilenya(芬戈莫德)、Aubagio(特立氟胺)、BG12、Tecfidera、Campath、Lemtrada(阿仑单抗)、帕尼单抗，Erbitux(西妥昔单抗)、马妥珠单抗、IMC-IIF 8、TheraCIM hR3、地诺单抗、Avastin(贝伐珠单抗)、Humira(阿达木单抗)、Herceptin(曲妥珠单抗)、Remicade(英夫利昔单抗)、利妥昔单抗、Synagis(帕利珠单抗)、Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星)、Raptiva(依法利珠单抗)、Tysabri(那他珠单抗)、Zenapax(达昔单抗)，NeutroSpec(锝(99mTc)法诺索单抗)、托西珠单抗、ProstaScint(铟-Ill标记卡罗单抗喷地肽)、Bexxar(托西莫单抗)、Zevalin(缀合到钇90的替伊莫单抗(IDEC-Y2B8))、Xolair(奥马珠单抗)、MabThera(利妥昔单抗)、ReoPro(阿昔单抗)、MabCampath(阿仑单抗)、Simulect(巴利昔单抗)、LeukoScan(硫索单抗)、CEA-Scan(阿西莫单抗)、Verluma(诺非妥莫单抗)、Panorex(依决洛单抗)、阿仑单抗、CDP 870、那他珠单抗、Gilitrif(阿法替尼)、Lynparza(奥拉帕尼)、Perjeta(帕妥珠单抗)、Otdivo(纳武单抗)、Bosulif(伯舒替尼)、Cabometyx(卡博替尼)、Ogivri(曲妥珠单抗)、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Adcetris(本妥昔单抗)、Alecensa(艾乐替尼)、Calquence(阿卡替尼)、Yescarta(希罗赛尔)、Verzenio(阿贝西利)、Keytruda(派姆单抗)、Aliqopa(科潘利西)、Nerlynx(来那替尼)、Imfinzi(得瓦鲁单抗)、Darzalex(达雷木单抗)、Tecentriq(阿特珠单抗)、阿维鲁单抗(Bavencio)、得瓦鲁单抗(Imfinzi)、易普利单抗(Yervoy)和Tarceva(厄洛替尼)。

如本文使用，术语“化学治疗剂”是指用于治疗癌症的具有抗肿瘤作用的任何治疗剂。化学治疗剂和抗肿瘤剂是熟知的细胞毒性剂，并且包含：(i)抗微管剂，包括长春花生物碱(长春花碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛和长春瑞滨)、紫杉烷(卡巴他赛、多西他赛、拉洛他赛、奥他赛、紫杉醇和特西他赛)、埃博霉素(伊沙匹隆)和鬼臼毒素(依托泊苷和替尼泊苷)；(ii)抗代谢剂，包括抗叶酸剂(氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、普拉曲沙和雷替曲塞)和脱氧核苷类似物(阿扎胞苷、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、地西他滨、去氧氟尿苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、奈拉滨、喷司他丁、替加氟和硫鸟嘌呤)；(iii)拓扑异构酶抑制剂，包括拓扑异构酶I抑制剂(贝洛替康、喜树碱、科西替康、吉马替康、依沙替康、伊立替康、勒托替康、西拉替康、拓扑替康和鲁比替康)和拓扑异构酶II抑制剂(阿柔比星、氨柔比星、道诺霉素、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、依达比星、美巴龙、米托蒽醌、新生霉素、吡柔比星、替尼泊苷、戊柔比星和佐柔比星)；(iv)烷基化剂，包括氮芥(苯达莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、磷酸雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、泼尼莫司汀、曲洛磷胺和乌拉莫司汀)、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)、福莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、N-亚硝基N-甲基脲(MNU)、尼莫斯汀、雷莫司汀、司莫司汀(MeCCNU)和链脲佐菌素)、铂基(顺铂、卡铂、双环铂、奈达铂、奥沙利铂和沙铂)、氮丙啶(卡波醌、噻替派、丝裂霉素、地吖醌(AZQ)、三亚胺醌和三亚乙基蜜胺)、烷基磺酸盐(白消安、甘露舒凡和曲奥舒凡)、非经典烷基化剂(肼、丙卡巴肼、三嗪、六甲蜜胺、六甲嘧胺、二溴甘露醇和哌泊溴烷)、四嗪(达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺)(v)蒽环剂，包括多柔比星和道诺霉素。这些化合物的衍生物包含表柔比星和伊达比星；吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌、博来霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌和放线菌素；(vi)酶抑制剂，包括FI抑制剂(替吡法尼)、CDK抑制剂(阿贝西利、阿伐西地、帕博西利、雷博西利和塞利西利)、PrI抑制剂(硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米)、PhI抑制剂(阿那格雷)、IMPDI抑制剂(噻唑呋林)、LI抑制剂(马索罗酚)、PARP抑制剂(尼拉帕利、奥拉帕尼、卢卡帕尼)、HDAC抑制剂(贝利司他、帕比司他、罗米地辛、伏立诺他)和PIKI抑制剂(艾代拉里斯)；(vii)受体拮抗剂，包括ERA受体拮抗剂(阿曲生坦)、维甲酸X受体拮抗剂(贝沙罗汀)、性类固醇受体拮抗剂(睾内酯)；(viii)未分组的试剂，包括安吖啶、曲贝替定、维甲酸(阿利维A酸维A酸)、三氧化二砷、天冬酰胺耗竭剂(天冬酰胺酶/培门冬酶)，塞来昔布、地美可辛伊利司莫、依沙芦星、依托格鲁、氯尼达明、甲硫蒽酮、米托胍腙、米托坦、奥利默森、高三尖杉酯碱和艾日布林。

在某些方面中，所述免疫治疗剂和/或化学治疗剂是检查点抑制剂、疫苗、嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法、抗PD-1抗体(纳武单抗或派姆单抗)、抗PD-L1抗体(阿特珠单抗、阿维鲁单抗或得瓦鲁单抗)或其组合。

“检查点抑制剂”是指用于使用影响免疫系统功能的免疫检查点进行癌症治疗的疗法。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。肿瘤可以使用这些检查点来保护自己免受免疫系统攻击。检查点疗法可以阻断抑制性检查点，从而恢复免疫系统功能。检查点蛋白质包含程序性细胞死亡1蛋白(PDCD1，PD-1；也被称为CD279)及其配体，PD-1配体1(PD-L1，CD274)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、A2AR(腺苷A2A受体)、B7-H3(或CD276)、B7-H4(或VTCN1)、BTLA(B和T淋巴细胞弱化子或CD272)、IDO(吲哚胺2,3-二加氧酶)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞激活基因-3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)和VISTA(T细胞激活的V结构域Ig抑制剂)。

程序性细胞死亡蛋白1，也被称为PD-1和CD279(分化簇279)，是一种在下调免疫系统和通过抑制T细胞炎性活动促进自身耐受性方面起着重要作用的细胞表面受体。PD-1是一种免疫检查点，并且通过促进淋巴结中的抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)的双重机制来防止自身免疫，同时减少调节性T细胞(抗炎抑制性T细胞)的凋亡。纳武单抗和派姆单抗是FDA批准用于癌症治疗的两种商业化抗PD-1抗体。

PD-1具有两个配体PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。PD-L1蛋白响应于LPS和GM-CSF处理在巨噬细胞和树突细胞(DC)上上调，并且在TCR和B细胞受体信号转导时在T-细胞和B细胞上上调，而在静息小鼠中，可以在心脏、肺、胸腺、脾脏和肾脏中检测到PD-L1mRNA。经IFN-γ处理后，PD-L1在几乎所有鼠肿瘤细胞系中表达，包含PA1骨髓瘤、P815肥大细胞瘤和B16黑素瘤。PD-L2表达受到更多限制，并且主要由DC和一些肿瘤细胞系表达。阿特珠单抗、阿维鲁单抗和得瓦鲁单抗是FDA批准用于癌症治疗的三种商业化抗PD-L1抗体。

术语“疫苗”是指提供针对特定疾病的主动获得性免疫的生物制剂。疫苗通常含有与致病剂相似的试剂，并且通常由其弱化或杀灭形式、其毒素或其表面蛋白中的一种制成。疫苗刺激免疫系统将所述试剂识别为威胁，破坏它并在将来进一步识别和破坏它。疫苗可以是预防性的或治疗性的(例如，癌症疫苗)。术语“癌症疫苗”是指能够用作接种材料或用作接种材料的一部分的任何制剂，其将针对癌症和/或肿瘤生长提供治疗，对其进行抑制和/或向其传递免疫力。疫苗可以是肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。

免疫疗法包含使用经遗传改造的T细胞(其经修饰以特异性地识别和消除癌细胞)的过继转移。可以对T细胞进行遗传修饰，以在其表面嵌合抗原受体(CAR)上稳定表达。CAR是包括信号转导内域的合成蛋白质，其由细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域组成。在与表达抗原的靶癌细胞相互作用时，嵌合抗原受体触发细胞内信号传导，从而导致T细胞激活和针对肿瘤细胞的细胞毒性免疫应答。已经发现此些疗法也可以结合，并且已经表现出对复发/难治性疾病有效。另外，CAR-T细胞可以被改造成包含增强T细胞介导的细胞毒性活性的共刺激受体。此外，CAR-T细胞可以被改造成在肿瘤微环境中产生和递送目标蛋白质。

在其它方面中，所述免疫治疗剂和/或化学治疗剂在施用所述AON之前、同时或之后施用。

在某些方面中，进一步施用放射疗法。在某些方面中，所述放射疗法在施用所述AON之前、同时或之后施用。

几种癌症治疗可以在“组合疗法”中或“组合”使用。短语“组合疗法”、“与……组合”等是指同时使用一种以上药物或治疗以提高应答。本发明的AON可以例如与其它药物或治疗组合使用以用于治疗癌症。具体地，向受试者施用AON可以与例如化学疗法、放射或治疗性抗体的施用组合。此些疗法可以在施用本发明的AON之前、同时或之后施用。

以下呈现了讨论被考虑用于所讨论的应用的杂合嵌合体反义寡核苷酸的实例，所述杂合嵌合体反义寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸和和2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸并且其结合到Foxp3 mRNA。提供了以下实例以进一步说明本发明的实施例，但其并非旨在限制本发明的范围。尽管它们是可以使用的典型程序、方法或技术，但也可以替代地使用本领域技术人员已知的其它程序、方法或技术。

实例

抗体和流式细胞术。使用市售的缀合单克隆抗体(mAb)进行流式细胞术(BDPharmingen)。抗Foxp3 mAb是FJK-16s(eBioscience)，并且β-肌动蛋白抗体是兔mAb(CellSignaling)。在Cyan流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行流式细胞术，并使用FlowJo 8软件(Tree-Star)分析数据。使用FACS Aria细胞分选仪(BD Bioscience，UPenn细胞分选设施)从年龄和性别匹配的Foxp3YFP-cre小鼠中分选出CD4

收获脾脏和周围淋巴结并处理成淋巴细胞的单细胞悬液。使用磁珠(MiltenyiBiotec，圣地亚哥，加利福尼亚州)分离常规的T细胞(Tconv，CD4

研究Foxp3表达(区分Foxp3

Foxp3 mRNA表达的qPCR。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)获得来自Foxp3

Treg抑制测定。使用CD4

简而言之，通过磁珠(Miltenyi Biotec)分离CD4

小鼠给药方案。进行了三种不同的体内实验。在一些实验中，用10mg/kg FANA处理小鼠三次。在其它实验中，每天用50mg/kg FANA处理小鼠，持续一周。在又一些其它实验中，使用TC1肿瘤模型，小鼠每天接受50mg/kg FANA，持续两周。

细胞系和肿瘤模型。TC1细胞源于小鼠肺上皮细胞，所述细胞用HPV-16E6和E7永生化，并用c-Ha-RAS致癌基因转化。为了进行肿瘤研究，将每只小鼠的右侧腹剃毛，并皮下注射1.2x 10

体内TC1肿瘤模型实验。给C57BL/6小鼠(杰克逊实验室)接种TC1肿瘤细胞，并将小鼠在7天时分为3组(每组10个)。第1组：杂乱对照50mg/kg；第2组：AUM-FANA-5 50mg/kg；第3组：AUM-FANA-6 50mg/kg。将寡核苷酸溶解在PBS(10mg/ml)中，每天腹膜内给予0.1ml(1mg)，持续14天。使用卡尺测量肿瘤大小，每周两次计算肿瘤体积，并且在实验结束时，收获肿瘤、引流淋巴结和脾脏进行进一步分析。

FOXP3 FANA对FOXP3

通过流式细胞术评估Foxp3 FANA对Foxp3表达细胞的数量的作用。

脾细胞在体外用CD3 mAb和不同的FANA序列处理3天。如图1中所示，杂乱对照FANA指示，当FANA浓度为2.5μM时，从脾脏分离的细胞群中有14.8％的Foxp3表达细胞，而当浓度为5μM时，有9.57％的Foxp3表达。用Foxp3 FANA序列的处理减少了Foxp3表达细胞的数量。例如，使用AUM-FANA-6，细胞的百分比分别降低至2.5μM下的4.63％和5μM下的2.97％。

在10U/ml IL-2和几个FANA序列的存在下，用CD3/CD28磁珠在体外独立地处理纯化的Treg细胞群三天。如图2中所示，杂乱对照FANA指示，在2.5μM剂量的情况下，67.5％的Treg是Foxp3表达细胞，而在5μM剂量的情况下，则为67％。通过用FANA处理，与杂乱对照序列相比，Foxp3表达呈阳性的细胞百分比的降低是Foxp3沉默的指示。许多序列降低了Foxp3表达细胞的数量。

还在体内评定了Foxp3 FANA对Foxp3表达细胞的数量的作用。小鼠接受三个10mg/kg剂量的FANA(300μg注入30g小鼠)，并在最终剂量后24小时收获相关的淋巴组织。

如图3中所示，三个剂量的10mg/kg适度地减少了体内Foxp3表达细胞的数量。本剂量(10mg/kg)比肿瘤模型中使用的剂量(50mg/kg)低得多，但被包含在内以确定范围。在本剂量下，AUM-FANA-6以及可能的FANA-8表现出的YFP和/或Foxp3检测降低了少量(2.6-3％)。

在将10mg/kg荧光(APC)标记的杂乱寡核苷酸注射入小鼠后24小时，评估了FANA的体内摄取。从脾脏、淋巴结和血液收获细胞，并通过流式细胞术进行分析。

通过跟踪细胞的CD8和APC表达，分析了CD8

使用表达了用黄色荧光蛋白(YFP)标记的Foxp3的小鼠模型，将非Treg细胞作为YFP

使用表达Foxp3标记的YFP的这种相同的小鼠模型，将Treg细胞作为YFP

还通过共聚焦显微术评估了体外FANA摄取。如图7中所示，在Foxp3表达Treg中检测到标记FANA，从而表明Treg细胞摄取。在细胞的细胞核(N)中检测到由白色箭头标记的Foxp3和由黑星标记的FANA。Foxp3和FANA在细胞核中的共定位指示了靶Foxp3表达Treg细胞成功摄取FANA。

FOXP3 FANA对FOXP3

经由蛋白质印迹评估Foxp3 FANA对Foxp3蛋白表达水平的作用，以评定Foxp3FANA在蛋白质水平上抑制Foxp3表达的能力。

在用5μM几个FANA处理细胞72小时后，评估Foxp3 FANA的体外作用。如图8A-B中所示，测量了Foxp3表达以及作为上样对照的α-微管蛋白表达(其用于归一化Foxp3表达)。与杂乱对照相比，大多数FANA诱导Foxp3的表达的降低。

还评估了Foxp3 FANA的体内作用。用三个剂量的10mg/kg靶向Foxp3的FANA处理小鼠。在最后一次注射后24小时，收获细胞。如图9A-B中所示，测量了Foxp3蛋白并将其与作为对照的肌动蛋白进行比较。与杂乱FANA和对照相比，FANA 5、6、8和9降低了Foxp3表达。

FOXP3 FANA对TREG免疫

通过流式细胞术评定了Treg细胞的免疫抑制功能，其中在Treg免疫抑制测定中测量了Foxp3 FANA处理的Treg对T效应细胞的作用。

在用5μM FANA处理Treg之后，评估了Foxp3 FANA的体外作用。然后，评估Foxp3FANA处理的Treg和T效应细胞的各种比例，并通过评估T效应细胞的数量测量了Treg细胞免疫抑制T效应子的能力。高效的Foxp3 FANA通过其降低T效应细胞的Treg免疫抑制的能力而被标识。在图10中(其中每列指示Treg细胞与T效应细胞(TE，它们是正常的细胞毒性免疫细胞)的比例)，当样品中的Treg细胞的百分比增加时，预期TE细胞的增殖会减少，因为Treg抑制了免疫激活/增殖。如杂乱对照中所示，在没有Treg参与的情况下，T效应细胞增殖并占群体的90.5％。随着Treg细胞数量的增加和初始群体接近相等数量的Treg和TE细胞(比例为1:1)，TE细胞的增殖减少到只有38.3％构成TE细胞。用FANA处理细胞并评估那些相同的百分比允许标识处能够预防Treg免疫抑制的FANA。如由突出显示的百分比所示，AUM-FANA-5和AUM-FANA-6均防止Treg对T效应细胞的免疫抑制。在图10中，即使向系统中加入了越来越多的Treg，当用AUM-FANA-5或AUM-FANA-6处理Treg时，TE功能和活性得以保留，这可能是由于Treg细胞中的Foxp3沉默和其抑制作用的阻断。

通过评定几个参数(例如，对Treg细胞的免疫抑制功能的影响以及对Foxp3的蛋白表达水平的影响)，在体内评估了更高剂量的50mg/kg Foxp3 FANA寡核苷酸的作用。

每天一次向小鼠腹膜内注射50mg/kg剂量的AUM-FANA-5或AUM-FANA-6(这是根据先前呈现的数据建立的两种最有效的Foxp3 FANA)，持续7天。最后一次注射后24小时，收集它们的脾脏和淋巴结(LN)，并对Treg进行列举和估计。

通过通过流式细胞术评估T效应细胞的数量来测量Treg免疫抑制T效应细胞的能力。对Treg进行Treg抑制测定，其中将越来越多的Treg细胞与正常的细胞毒性免疫细胞(T效应(TE)细胞)一起孵育。随着样品中的Treg细胞百分比的增加，由于Treg抑制了免疫激活，预期TE细胞的增殖会降低。如图11中的对照行中所示，在没有Treg参与的情况下，TE细胞增殖并占群体的97.3％。随着Treg细胞的增加和初始群体接近相等数量的Treg和TE细胞，TE细胞的增殖减少到只有35.4％构成TE细胞。发现用AUM-FANA-5和AUM-FANA-6处理细胞均防止Treg介导的T效应细胞的抑制(具有星形的流式细胞术图)，因为测量的T效应细胞的百分比高于在特定比例的Treg存在下的对照样品中存在的百分比。本剂量是有效的，而10mg/kg剂量三次不太有效。体内50mg/kg的每日剂量降低了Treg介导的免疫抑制并恢复了免疫系统效应功能。

此外，如图12A-B中所示，测量了Foxp3蛋白并将其与作为对照的β-肌动蛋白进行比较。蛋白质印迹显示，与杂乱对照相比，AUM-FANA-5和AUM-FANA-6均降低了体内Foxp3蛋白表达。体内50mg/kg FANA的每日剂量降低了Foxp3的蛋白质表达。

用FOXP3

如实例1中所述，使用TC1肿瘤模型在体内评估所选择的Foxp3 FANA AUM-FANA-5(SEQ ID NO:25)和AUM-FANA-6(SEQ ID NO:26)对肿瘤生长的作用。通过流式细胞术评估AUM-FANA-5和AUM-FANA-6对瘤内和脾内Foxp3

在第0天，将TC1细胞注射入小鼠，并使肿瘤生长直到第7天。在第7天，随机分为多组，每组10只小鼠，并每天腹膜内注射50mg/kg杂乱对照、AUM-FANA-5或AUM-FANA-6来处理每只小鼠，持续14天。每天测量肿瘤大小并作图。

如图13中所示，在第20天，与AUM-FANA-5和杂乱对照相比，发现AUM-FANA-6能够显著减小肿瘤大小。

如在图14A-C中进一步详述，发现Foxp3 ASO疗法损害了在同基因C57BL/6小鼠中生长的TC1肺肿瘤的生长。如图14B中所示，其中每条线表示不同的小鼠，发现在10只AUM-FANA-6处理的小鼠中，有5只肿瘤完全消退并消失，而在另几只中则减慢了速度。每日剂量50mg/kg FANA持续两周大大减少体内肿瘤大小，并且AUM-FANA-6能够在10只处理小鼠中的5只中诱导完全肿瘤消退。

此外，通过流式细胞术测量肿瘤内Foxp3表达细胞的数量。在实验的最终终点之后，并且在处死动物之后，收获并分析肿瘤内细胞。如图15A-B中所示，发现50mg/kg剂量FANA(尤其是AUM-FANA-6)减少了处理小鼠的肿瘤中的Foxp3表达细胞的数量，从而表明Foxp3敲除是成功的，并且有助于在半数AUM-FANA-6处理小鼠中排斥肿瘤。

另外，通过流式细胞术测量脾内Foxp3表达细胞的数量。在实验的最终终点之后，并且在处死动物之后，收获并分析肿瘤内细胞。如图16A-B中所示，发现50mg/kg剂量FANA减少了处理小鼠的脾脏中的Foxp3表达细胞的数量，从而表明Foxp3敲除是成功的。

用低剂量

使用较低剂量的寡核苷酸在体内和体外评估所选择的Foxp3 FANA的作用。

如图17中所示，表明了AUM-FANA-6(SEQ ID NO:26)可有效诱导体外Foxp3敲低。此外，通过用CD3 mAb处理的鼠脾细胞上的流式细胞术数据评估了用2.5或5μM寡核苷酸下的各种FANA处理后的Foxp3+脾细胞的数量的评估。如图18中所示，抗Foxp3 AUM-FANA-5(SEQID NO:25)和AUM-FANA-6(SEQ ID NO:26)减少了鼠脾细胞中的Foxp3+TREG群体的数量。另外，在用AUM-FANA-5或AUM-FANA-6处理细胞之后，在体外评估了Treg抑制功能。如图19A-B中所示，与未处理细胞(处理的FANA最终浓度为1μM)相比，AUM-FANA-5或AUM-FANA-6损害了鼠T

如实例1中所述，首先使用TC1肿瘤模型在荷瘤小鼠的引流淋巴结中评估较低剂量FANA寡核苷酸的体内分析。在第0天，将TC1细胞注射入小鼠，并使肿瘤生长。随机分为两组，每组4只小鼠，并每天腹膜内注射杂乱对照或AUM-FANA-6B(SEQ ID NO:304)来处理每只小鼠。在第21天，收集荷瘤小鼠的引流淋巴结，并通过蛋白质印迹评估Foxp3表达。如图20中所示，与杂乱对照相比，AUM-FANA-6B可有效降低引流淋巴结中的Foxp3表达。

此外，如实例1所述，使用TC1肿瘤模型在体内评估了FANA AUM-FANA-6B对肿瘤生长和抗肿瘤免疫力的作用。在第0天，将TC1细胞注射入小鼠，并使肿瘤生长直到第7天。在第7天，随机分为多组，每组8只小鼠，并每天腹膜内注射25mg/kg杂乱对照或AUM-FANA-6B来处理每只小鼠，持续14天。每天测量肿瘤大小并作图。如图21A-B中所示，在第21天，与杂乱对照相比，发现25mg/kg/天AUM-FANA-6B能够显著减小肿瘤大小，从而表明Foxp3 AUM-FANA-6B损害了肺肿瘤的生长。

在淋巴组织中和肿瘤部位处评估了CD4

尽管已经参考以上实例描述了本发明，但是将理解，修改和变型涵盖在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由以下权利要求书限制。