固相标记物及其制备方法、固相载体多通道多肽或糖肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及固相标记物及其制备方法、固相载体多通道多肽或糖肽标记和定量的方法。

背景技术

生物标志物作为疾病诊断、监测和预后等广泛应用于各种疾病临床和研究中。而基于蛋白的生物标志物，近年来得到越来越多的关注。众所周知，仅依据基因生物标志物往往不能满足应用需求，尤其对于早期标志物而言，疾病产生初期在基因水平可能未有可观测的变化，然而蛋白水平经常出现特异性改变。这包括蛋白表达丰度的变化、蛋白糖基化改变、磷酸化位点的增减等。因此定性定量分析蛋白和蛋白转率修饰结构和位点成为疾病筛查的热点和难点。迄今为止，基于质谱同位素定量的试剂和方法得到广泛发展，高通量多样本的同时定量得到长足进步，然而这些方法都需要在溶液中将同位素标记物与多肽或糖肽反应，得到的产物必须采用固相萃取柱纯化才能用于质谱分析。

因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。

发明内容

本发明目的是提供一种固相标记物及其制备方法，一种固相载体多通道多肽或糖肽及其制备方法，以解决现有技术中固相载体多通道多肽或糖肽标记和定量的难题。

本发明的技术方案是：一种固相标记物，包括如下结构式：

其中，

(A)为固相连接基团、(B)为可控光裂解基团、(C)为平衡基团、(D)为肽胺基连接基团、(E)为报告基团。

上述固相标记物的制备方法包括如下步骤：

(a)使用多孔材料作为固相载体；

(b)活化所述固相载体的固相表面，耦合形成胺基基团，获得胺基固相载体(2)；

(c)通过化学合成在固相表面形成可与多肽或糖肽反应的固相标记物，所述固相标记物由固相连接基团(A)、可控光裂解基团(B)、平衡基团(C)、肽胺基连接基团(D)、报告基团(E)逐步耦合到固相上；

(d)洗脱所述固相标记物，去除杂质。

进一步的，在步骤(a)中，所述多孔材料的外径为40-120微米，孔径为60-300埃，所述多孔材料的材质为硅胶、琼胶或磁珠。

进一步的，在步骤(c)中，通过化学合成在固相表面形成可与多肽或糖肽反应的固相标记物，所述固相标记物由固相连接基团(A)、可控光裂解基团(B)、平衡基团(C)、肽胺基连接基团(D)、报告基团(E)逐步耦合到固相上的具体步骤为：

将化合物(1)与胺基固相材料(2)混合，加入水、EDC和体积比为36-38％的浓盐酸，并用EDC或36-38％浓盐酸调节pH值至4-6之间，在室温下反应4-8小时，获得化合物(3)；

将所述化合物(3)与含有反应物(4)、HBot、HBTU和DIPEA的DMF溶液混合，于室温反应2-4小时，获得产物(5)；

将所述产物(5)与含有体积百分比为15～25％PIP的DMF溶液混合，于室温下反应0.5-1小时，与含有反应物(6)、HBot、HBTU、DIPEA的DMF溶液混合，反应2-4小时，所得产物在1～2M盐酸处理30-60分钟，得到固相标记产物(7)。

进一步的，在步骤(d)中，所述洗脱所述固相标记物具体为：用1毫升/1M NaCl洗脱所述固相标记物三次，再用1毫升DI水洗脱三次。

本发明的另一技术方案是：一种固相载体多通道多肽或糖肽，包括如下结构式：

上述固相载体多通道多肽或糖肽的制备方法包括如下步骤：

(e)纯化固相标记产物(7)；

(f)通过还原胺化反应，将多肽或糖肽共价结合到固相标记产物(7)的表面，使用含有有机溶液的缓冲液液相将固相表面的非共价结合试剂、化合物和其它杂质洗脱去除，获得产物(8)；

(g)通过特定波长光对产物(8)表面偶联的标记多肽或糖肽照射使多肽或糖肽从可控光裂解基团(B)处分解，洗脱收集溶液，得到带有标记的多肽或糖肽(9)；

(h)液相色谱-质谱联用得到标记多肽或糖肽结构和含量。

进一步的，在步骤(f)中所述多肽或糖肽的制备方法为：

用蛋白酶酶解糖蛋白形成多肽或糖肽，其中，所述糖蛋白与蛋白酶的重量比为1：20至1：100之间；

用疏水C18萃取柱纯化多肽或糖肽；

干燥多肽或糖肽后，重新溶解到1×PBS缓冲液中，调节pH值至7-8之间。

进一步的，在步骤(f)中，所述通过还原胺化反应，将多肽或糖肽共价结合到固相标记产物(7)的表面具体为：在固相标记产物(7)中加入1×PBS、0.8-1.2M NaCNBH

在步骤(f)中，所述使用含有有机溶液的缓冲液液相将固相表面的非共价结合试剂、化合物和其它杂质洗脱去除具体为：在3000-4000rpm的转速下离心10-15分钟，移除上清液，加入500-1000微升体积比为10％的ACN，混合1-2分钟并在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，去除上清液，重复本步骤2-4次；加入500-1000微升体积比为10％的甲酸，混合1-2分钟并在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，去除上清液，重复本步骤2-4次；加入500-1000微升HPLC水，混合1-2分钟并在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，去除上清液，重复本步骤2-4次。

进一步的，在步骤(g)中，所述通过特定波长光对产物(8)表面偶联的标记多肽或糖肽照射使多肽或糖肽从可控光裂解基团(B)处分解具体为：加入500-1000微升HPLC水，用365nm紫外照射30-60分钟，在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，收集上清液；

在步骤(g)中，所述洗脱收集溶液，得到带有标记的多肽或糖肽(9)具体为：加入300-400微升HPLC水，混合1-2分钟，并在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，收集上清液，重复本步骤2次，将所有上清液合并，在温度为20-50℃条件下真空干燥。

本发明提供了固相标记物及其制备方法、固相载体多通道多肽或糖肽及其制备方法，在固相上合成同位素标记物，将需要分析的多肽或糖肽偶联到固相上，纯化直接在固相上进行，通过洗脱即可实现，而标记后的多肽或糖肽则用光照从固相上裂解。其优点是：

1)高通量固相标记；

2)裂解多肽或糖肽无需后处理；

3)裂解基团可采用灵活方法，包括并不仅限于光照、酸性水解等，在下列各种场景(但不仅限于这些场景)有广泛应用；

4)将光源设计在液相色谱中，可线上实时裂解标记多肽或糖肽。使用酸解基团替代光解基团，则可通过调节液相色谱溶液的pH，在酸性条件将标记多肽或糖肽裂解；

5)固相可集成在液相色谱系统，与液相色谱-质谱无缝结合；

6)方便定量两种以上不同细胞中的蛋白和糖蛋白；

7)任何含有胺基的化合物在多种样本中的含量也可使用本方法定量分析。

附图说明

图1为本发明所述的固相载体多通道多肽或糖肽的制备方法的示意图，分别由114、115、116和117标记。

具体实施方式

本发明公开了一种固相标记物，包括如下结构式：

其中，

(A)为固相连接基团、(B)为可控光裂解基团、(C)为平衡基团、(D)为肽胺基连接基团、(E)为报告基团。上述固相上合成的分子，是一个完整的分子结构，该分子有几个部分，A端左侧与固相表面结合，可控光裂解基团(B)在光照(比如远红外、紫外或激光等)裂解；平衡基团(C)采用同位素改变分子的分子量；肽胺基连接基团(D)可与带有胺基的分子反应；报告基团(E)在二级质谱中可以看到其丰度。

上述固相标记物的制备方法包括如下步骤：

(a)使用多孔材料作为固相载体，其中，多孔材料的外径为40-120微米，孔径为60-300埃，多孔材料的材质为硅胶或琼胶。

(b)活化所述固相载体的固相表面，耦合形成胺基基团，获得胺基固相载体(2)。

(c)通过化学合成在固相表面形成可与多肽或糖肽反应的固相标记物，所述固相标记物由固相连接基团(A)、可控光裂解基团(B)、平衡基团(C)、肽胺基连接基团(D)、报告基团(E)逐步耦合到固相上，具体步骤为：

将230mg-460mg化合物(1)与250mg-350mg胺基固相材料(2)混合在容积为1000ml的容器中，加入500-1000微升水、50-100微升EDC、20-30微升体积百分比36-38％浓盐酸，测试pH值在4-6之间。如pH值低于4，逐滴加入EDC直至pH值高于4；如pH值高于6，则逐滴加入浓盐酸直至pH值低于6；反应在室温下进行4-8小时，得到化合物(3)；

将所述化合物(3)与含有反应物(4)，HBot、HBTU、DIPEA的DMF溶液混合，于室温反应2-4小时，获得产物(5)；

将所述产物(5)与含有体积百分比15～25％Piperdine(哌啶)的DMF溶液混合，于室温反应0.5-1小时，除去产物(5)上的Fmoc基团，与含有反应物(6)、HBot、HBTU、DIPEA的DMF溶液混合，于室温反应2-4小时，最后用1～2M盐酸处理30-60分钟，最终得到固相标记产物(7)，逐步耦合到固相上。

(d)用1毫升/1M NaCl洗脱所述固相标记物三次，再用1毫升DI水洗脱三次。

在得到固相标记产物(7)后，可以制备一种固相载体多通道多肽或糖肽，包括如下结构式：

上述固相载体多通道多肽或糖肽的制备方法包括如下步骤：

(e)用500-1000微升DI水清洗3-5遍固相标记产物(7)，再用500-1000微升1×PBS清洗3-5遍，得到纯化后的固相标记产物(7)；

(f)用蛋白酶酶解糖蛋白形成多肽或糖肽，其中，所述糖蛋白与蛋白酶的重量比为1：20至1：100之间，用疏水C18萃取柱纯化多肽或糖肽，干燥所述多肽或糖肽后，重新溶解到1×PBS缓冲液中，调节pH值至7-8之间，在固相标记产物(7)中加入500-1000微升1×PBS、50-100微升0.8-1.2M NaCNBH

(g)通过特定波长光对产物(8)表面偶联的标记多肽或糖肽照射使多肽或糖肽从可控光裂解基团(B)处分解，即加入500-1000微升HPLC水，用365nm紫外照射30-60分钟，在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，收集上清液，加入300-400微升HPLC水，混合1-2分钟，并在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，收集上清液，重复本步骤2次，将所有上清液合并，在温度为20-50℃条件下真空干燥，得到带有标记的多肽或糖肽(9)；

(h)将干燥的带有标记的多肽或糖肽(9)样本溶解在40-60微升体积百分比为0.2％的甲酸，2-3分钟盆浴超声，将样本在3000-4000rpm的转速下，离心10-15分钟，收集上清液。取1-2微升样本测量多肽或糖肽浓度。根据所测浓度，取0.8-1.2微克样本，用LC-MS/MS检测多肽或糖肽结构，并根据二级质谱报告离子在质谱谱图中的高度得到该多肽或糖肽的相对含量。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

本实施案例按如下步骤展示一种基于固相载体多通道多肽或糖肽标记和定量，所述方法包括如下步骤：

步骤一：在固相上合成同位素可与胺基反应的标记化合物：

将化合物(1)(250mg)与胺基固相材料(2)(200mg)通过碳二亚胺偶联，反应条件是1M化合物(1)，用EDC和盐酸调节溶液pH在4-6之间，反应4-8小时；

将得到的化合物(3)与含有反应物(4)、190mg HBTU、80mg HBot、625微升DIPEA的3毫升DMF(二甲基甲酰胺)中，室温反应2-4小时，获得产物(5)；

将得到的产物(5)与含有体积百分比15～25％Piperdine(哌啶)的DMF溶液混合，于室温反应0.5-1小时，再与含有反应物(6)、840微升DIPEA、体积百分比为15～25％的哌啶、HBot、HBTU的3毫升DMF中，反应2～4小时得到产物，将得到的产物用400-500微升1～2M盐酸，室温下处理2～4小时，最终得到固相标记产物(7)。

步骤二：糖蛋白酶解；

将200微克糖蛋白溶于90微升HPLC水和10微升10倍变性试剂(可用NEB的10xdenaturing buffer)；

将混合的样本90℃加热10分钟；

待样本冷却至室温，加入350微升HPLC水和50微升1M的碳酸氢铵溶液；

加入4微克胰蛋白酶，在37度酶解12-16小时；

在样本中加入20-30微升体积比为100％的甲酸，调节pH3-4之间；

采用C18纯化酶解后的多肽或糖肽；

将肽在真空中干燥并存储在-20℃待用。

步骤三：多生物样本多肽或糖肽的标记和分析：

本步骤以4通道生物样本制备为例，采用合成的四种固相同位素标记物与生物样本反应；

将多肽或糖肽溶于1×PBS缓冲液(475微升)；

将样本与100毫克树脂混合；

加入25微升1M NaCNBH3,混合均匀，如图1所示，四种生物样本分别于①114，②115，③116和④117固相同位素标记物混合；

反应在室温下进行10-20小时；

反应完全后，将树脂用500微升NaCl(3遍)、500微升体积比为10％的ACN(3遍)、500微升HPLC水(3遍)；

将所有树脂混合在1mL HPLC水中；

使用365nm紫外照射30-60分钟，收集上清液；

干燥上清液，重新溶于100微升体积比为0.2％的甲酸；

取1微克标记的多肽或糖肽液相质谱分析。

本发明所述的一种固相载体多通道多肽或糖肽的制备方法，可避免同位素标记后纯化步骤，提高多肽或糖肽产率1-2倍，线上标记和分析多肽或糖肽，减少样本处理时间50％～60％，固相高比表面积，减少同位素试剂用量40％～60％。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。