一种用于筛查和定量分析复方甘草片中防腐剂成分的测定方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种用于筛查和定量分析复方甘草片中防腐剂成分的检测方法。

背景技术

复方甘草片一种复方制剂，具有良好的镇咳祛痰功效。其质量标准收载于《中国药典》2020年版二部，处方中有甘草浸膏粉、阿片粉或罂粟果提取物粉、八角茴香油、樟脑、苯甲酸钠等。现代药理学研究表明，甘草浸膏为保护性镇咳祛痰剂，罂粟果提取物粉有较强镇咳功效，八角茴香油和樟脑，挥发性极强，能刺激呼吸道平滑肌，促进痰液排出，起到化痰的作用；苯甲酸钠为防腐剂。

复方甘草片成分大部分由甘草浸膏构成，味甜、易吸潮，在生产和使用过程中极易受微生物污染，故处方中加入一定量苯甲酸钠达到抑菌效果。药品制剂中常用的防腐剂除苯甲酸外，还有山梨酸、羟苯酯类等；过量使用防腐剂，会对人体脏器代谢产生一定危害。《中国药典》对其用量也作了明确要求，规定山梨酸和苯甲酸的用量不得大于0.3%，羟苯酯类的用量不得过0.05%；但药典标准并未收载相关的检测方法。对复方甘草片的质量控制，现行标准仅以甘草酸和吗啡为主，未收载苯甲酸钠的含量测定方法和限度要求；已报道文献中，也未见针对复方甘草片中防腐剂成分筛查和检测的方法。因此对于制剂生产过程中，是否存在违规过量添加或添加标准以外的防腐剂成分，无法实现全面控制。

现有技术中虽有针对不同制剂中防腐剂成分的检测方法，但由于复方甘草片成分较为复杂，检测过程中易受各组分的干扰，已有方法的提取方式和检测条件等并不适用于复方甘草片制剂中各防腐剂成分的检测。例如，黄科等公开了一种同时测定凝胶剂中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和二丁基羟基甲苯的方法（CN 104374843 B）；采用Agilent ZORBAX SB-C

为更加全面控制复方甘草片质量，防止制剂生产过程中过量或违规添加防腐剂成分，建立合适的检测方法，用于测定复方甘草片中苯甲酸钠含量，并可同时筛查其它几种防腐剂成分是否违规添加，具有非常重要的意义。

发明内容

为解决现有技术中，缺少针对复方甘草片中防腐剂的检测方法，本发明提供了一种反相液相高效色谱法用于筛查和定量分析复方甘草片中防腐剂成分，该方法既实现了复方甘草片处方中苯甲酸钠的含量测定，同时可对是否违规添加山梨酸及羟苯酯类防腐剂进行筛查和定量分析。

本发明提供了一种用于筛查和定量分析复方甘草片中防腐剂成分的测定方法，包括以下步骤：

1、供试品溶液制备：取复方甘草片10片，精密称定，研细，再精密称取0.15g（每片片重约为0.15g），置50mL量瓶中，加稀释液20~30mL，超声，放冷，用稀释液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2、对照品溶液制备，具体步骤为：

1）取苯甲酸钠、山梨酸钾（以山梨酸计）对照品各适量，精密称定，分别用稀释液溶解并定量稀释，分别制成含苯甲酸钠、山梨酸约为4.0mg·mL

2）取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯各适量，精密称定，分别用稀释液溶解并定量稀释，分别制成含羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯约为0.5 mg·mL

3）分别精密量取上述对照品溶液各5mL，置于50mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液，备用。

4）精密量取对照品贮备溶液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5mL、8mL分别置10mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为系列不同浓度的对照品溶液。

3、反相高效液相色谱法测定：

HPLC色谱条件如下：

色谱柱： C

优选的，1步骤中所述的稀释液为乙醇-水-冰醋酸按体积比45:50:5制成的混合溶液。

优选的，1步骤中的超声时间为30分钟，超声功率1500W。

优选的，3步骤中所述的C

优选的，3步骤中所述的梯度洗脱，步骤如下：0min，96%B；10min，90%B；25min，65%B；35min，45%B；40min，35%B；60min，35%B；61min，96%B；71min，96%B。

优选的，3步骤中所述的色谱条件，色谱柱温为35℃。

优选的，3步骤中所述的检测波长：双波长检测，具体为254nm（羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯）、240nm（苯甲酸钠、山梨酸）。

有益效果：

本发明提出的一种用于筛查和定量分析复方甘草片中防腐剂成分的测定方法，以乙醇-水-冰醋酸（45:50:5）溶液为复方甘草片的提取溶剂，采用反相高效液相色谱法，以C

在方法开发中，提取溶剂和流动相体系选择及梯度洗脱的设定对方法的准确性和专属性起着至关重要的作用。本发明人通过多次实验，分别对比了不同溶剂的提取效果，并多次对色谱条件和洗脱程序进行筛选和优化，最终克服了溶剂提取效果不佳和各组分对测定成分干扰等因素，获得了一种专属性强、灵敏度高、操作简单，适用于复方甘草片中各防腐剂成分筛查和定量分析的方法，为更加全面评价复方甘草片质量，控制防腐剂使用，提供了方法依据。

附图说明

图1为 对照品（254nm）的HPLC图谱，其中1.苯甲酸钠；2. 山梨酸；3. 羟苯甲酯；4.甘草酸；5. 羟苯乙酯； 6. 羟苯丙酯；

图2为对照品（240nm）的HPLC图谱；

图3为供试品（254nm）的HPLC图谱；

图4为供试品（240nm）的HPLC图谱；

图5为阴性样品（254nm）的HPLC图谱；

图6为阴性样品（240nm）的HPLC图谱。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一、仪器与试剂

Agilent1260 Ⅱ高效液相色谱仪（配制四元泵、在线脱气机、DAD检测器、自动进样器、Open LAB CDS 2.X化学工作站）、XS205DU电子分析天平（Mettler Toledo公司）、超声仪。

甲醇、乙腈、乙醇、甲酸为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯，水为超纯水。对照品苯甲酸钠(100433-201702，99.7%)、山梨酸钾（以山梨酸计，101075-201602， 99.7%）、羟苯甲酯（100278-201705，100%）、羟苯乙酯（100847-201604，99.9%）、羟苯丙酯（100444-201804，99.60%）、羟苯丁酯（190010-201001，99.70%）均购于中国食品药品检定研究院。复方甘草片来自于3个不同厂家的不同批次共6批。

二、分析方法

1、稀释液的制备

量取乙醇、水、冰醋酸各适量，制成乙醇-水-冰醋酸体积比为45:50:5的混合溶液，备用。

2、供试品溶液的制备

取复方甘草片10片，精密称定，研细，再精密称取0.1532g（平均片重0.1502g），置50mL量瓶中，加稀释液25mL，超声30min，超声功率1500W，放冷，用稀释液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

1）取苯甲酸钠、山梨酸钾（以山梨酸计）对照品各适量，精密称定，分别用稀释液溶解并定量稀释，分别制成含苯甲酸钠、山梨酸约为4.0mg·mL

2）取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯各适量，精密称定，分别用稀释液溶解并定量稀释，分别制成含羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯约为0.5 mg·mL

3）分别精密量取上述1）、2）步对照品溶液各5mL，置于50mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液，备用。

4）精密量取对照品贮备液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5mL、8mL分别置10mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为系列不同浓度的对照品溶液。

3、阴性样品溶液的制备

按照复方甘草片的处方比例制备不添加苯甲酸钠的阴性样品，按照上述“步骤1”下方法制备，即得阴性样品溶液。

4、色谱条件及系统适用性试验

Agilent1260 Ⅱ高效液相色谱系统，采用二极管阵列检测器，色谱柱为Shim-packGIST C

表1 梯度洗脱程序

5、线性范围、检出限及定量限试验

精密吸取对照品溶液各10 μL，按上述色谱条件，进行测定。以各化合物的峰面积为纵坐标，浓度（mg·mL

山梨酸及羟苯酯类化合物作为处方外非法添加成分筛查目标物，需对其检出限和定量限作进一步说明。取阴性样品作为空白基质进行低浓度水平的添加，逐级稀释并进样测定，以信噪比（S/N）为3时计算检出限（LOD），以信噪比（S/N）为10时计算定量限（LOQ），结果详见表2。

表2：各成分线性关系及检出限和定量限

6、精密度试验

精密吸取同一对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，连续重复进样6次，计算各化合物的峰面积。结果苯甲酸钠、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的峰面积的RSD分别为1. 3% 、 0.9%、1. 2% 、1. 4% 、1. 4% 、1. 5%。

7、回收率试验

精密称取含有量已知的样品6份（含苯甲酸钠0.21mg/片，不含其它防腐剂），每份各约0.5片量，精密称定，于50mL容量瓶中，各精密加入对照品贮备溶液2mL，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果：苯甲酸钠、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的加样回收率（n=6）分别为99.6%、95.8%、99.6%、98.9%、100.5%、98.4%；RSD分别为2.0%、2.0%、1.2%、2.3%、2.0%、1.9%。

8、稳定性试验

取同一回收率试验供试溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24小时测定各化合物峰面积，苯甲酸钠、山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的峰面积的RSD分别为1. 5% 、1.7%、1. 2% 、1. 8% 、2.0% 、1. 5%。

9、样品测定

取来自3个不同厂家的共6批复方甘草片样品，按步骤2，每批样品各制备3份平行供试品溶液，按上述色谱条件，进行6个防腐剂成分的分析和筛查，6批样品中山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯均未检出，说明这3个厂家的6批产品均无违法添加使用防腐剂现象，以外标法计算苯甲酸钠含量，结果见表3。

表3 样品分析结果（mg/片）（n=3）

实施例二：不同溶剂对阳性样品提取效果的考察

1、阳性样品的制备

按照复方甘草片处方比例，再分别加入一定量的山梨酸钾（按山梨酸计）、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯，制备成含各防腐剂量已知的阳性样品（含苯甲酸钠、山梨酸钾（按山梨酸计）、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯分别为2.02mg/片、0.45mg/片、0.075 mg/片、0.076 mg/片、0.074 mg/片、0.075mg/片）。

2、其他条件同实施例一，分别考察不同溶剂稀释液对阳性样品的提取效果，见表4.1~4.4。

表4.1 甲醇的提取效果

表4.2 乙醇的提取效果

表4.3 乙醇-水（1:1）的提取效果

表4.4 乙醇-水-冰醋酸（45:50:5）的提取效果

结果表明乙醇-水-冰醋酸（45:50:5）作为提取溶剂，提取效果最佳。

实施例三：色谱条件中，检测波长的选择

其它条件同实施例一，对对照品溶液进行色谱分析，采用DAD检测器，得到各化合物的紫外光吸收图谱，其中苯甲酸的最大吸收波长为224nm，山梨酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯均在254nm波长处有最大吸收，综合考虑复方甘草片各成分干扰和待测物检测灵敏度，最终选择羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的检测波长为254nm，苯甲酸钠和山梨酸的检测波长为240nm。

实施例四：不同流动相组成的考察

其它条件同实施例一，分别选用甲醇-0.02 mol·L

结果表明，复方甘草片中甘草酸的出峰顺序与苯甲酸和山梨酸较为接近，前三种流动相体系中这三种成分均达不到分离要求，在乙腈-0.02 mol·L

实施例五：梯度淋洗程序中流动相组成配比的选择

其它条件同实施例一，按表5进行梯度洗脱；结果，供试品溶液中羟苯酯类成分受相邻杂质峰干扰，分离度达不到分析要求。

表5 梯度洗脱程序