一种益生菌体系及其应用

技术领域

本发明涉及益生菌，尤其涉及可用于医疗目的的益生菌体系，特别涉及可用于恶性肿瘤治疗的益生菌体系。

背景技术

益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。主要有乳酸菌、双歧杆菌，放线菌，酵母菌等。它们通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用。益生菌对人体通常被认为具备多种益处，包括：提高机体免疫力、维持肠道菌群结构平衡、提高机体抗氧化水平、抑制肠道炎症、保护肠道粘膜屏障。

已有一些报道指出，肠道益生菌也对肿瘤生长具有抑制作用，对恶性肿瘤的治疗具有明显效果。例如，根据Gopalakrishnan等人于2018年的研究，益生菌的抗肿瘤功效与免疫激活有关。肿瘤患者肠道菌群异于健康人群，在健康人群中双歧杆菌为优势菌群，但在部分患癌人群中双歧杆菌显著减少。

双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、杆状、端部有时呈分叉状的厌氧益生菌，其广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔内。双歧杆菌能够与人体免疫细胞互相作用，调节先天性及适应性免疫相关的特定信号通路，促进Th1型免疫反应。双歧杆菌具有增强肿瘤微环境中的树突细胞的功能及CD8

然而，为了重塑肠道微生物群，让益生菌在人体内产生积极效果，需要改变肠道微生物群的组成。目前已报道的改变肠道微生物群组成的方法主要是，粪便微生物移植(fecal microbial transplantation)以及服用益生菌。粪便微生物移植成本高、操作复杂，还存在较大的病原体感染风险，因此并不是一项优选的治疗方案。同时，目前的各类实践与尝试均表明，直接口服益生菌的效果微乎其微，服用益生菌仅能在短时间内临时性地改变肠道微生物群组成，这个时间短到这些益生菌无法发挥功效。造成这种现象的原因在于，外源细菌在宿主肠道中的栖息能力很差，无法形成稳定的聚集和自我保护体系，因此非常容易被胃肠环境直接清除。

因此，本发明希望发明一种体系，该体系一方面具备使益生菌稳定繁殖的能力，另一方面该体系能够帮助外源益生菌在宿主内形成稳定的微环境，能够通过类似口服这样的简单方式进行施用，能够起到改变肠道微生物群组成的效果，最终在恶性肿瘤治疗过程中发挥积极作用。

发明内容

为了解决背景技术中提到的问题，发明人创造性地提出了利用无机材料体系为外源益生菌在生物体内形成长期稳定菌群的系统的设想，并且通过一系列的研究形成并优化了该体系，该体系具有较大的医学应用潜力和价值。

本发明公开了一种具有医学意义的益生菌体系，所述体系包括益生菌和无机材料。其中，益生菌可以是单一菌种，也可以是混合菌种；无机材料可以是天然矿物材料，也可以是经加工的天然材料，还可以是人工制备的材料。

优选地，组成益生菌体系的益生菌是在生长繁殖过程中能产生酸性环境的益生菌，此处所述能产生酸性环境的益生菌指的是益生菌在新陈代谢过程中在菌落周围形成酸性环境。

更优选地，组成益生菌体系的益生菌是乳酸菌。

最优选地，组成益生菌体系的益生菌是乳杆菌，双歧杆菌，丁酸梭菌或粪肠球菌中的一种或几种。

优选地，组成益生菌体系的无机材料是具有阳离子交换能力和高表面积的材料，这些材料可选自各类具有微孔结构的阳离子交换树脂，萤石，双八面体蒙脱石(Dioctahedral Smectites)亚族中的任一种，例如贝得石(Beidellite)、蒙脱石(Montmorillonite)、绿脱石(Nontronite)；三八面体蒙脱石(Trioctahedral Smectites)亚族中的任一种，例如皂石(Saponite)、锌蒙脱石(Sauconite)、水辉石(Hectorite)、斯蒂文石(Stevensite)；硅藻土，高岭土，凹凸棒土，伊利石，绿泥石，海泡石，沸石，滑石。

更优选地，组成益生菌体系的无机材料是在酸性环境中表面带正电荷的材料。

最优选地，组成益生菌体系的无机材料是在中性或碱性环境中表面不带正电荷，而在酸性环境中表面带正电荷的材料。人工材料可以是介孔二氧化硅，孔径在2-50nm；或者是金属有机骨架化合物，所述金属有机骨架化合物选择ZIF-67，UiO-66(Zr)，MOF-74-Mg，Co-MOF-74，MIL-53(Fe)，MIL-101，MOF-74-Ni，Cu-BTC，MOF-74-Fe，ZIF-8(BasoliteZ1200)，RMOF-1，MIL-100(Cr)，MOF-5，Ce-BTC，MgDOBDC，MIL-53(Al)中的某一种。

在一些实施例中，组成益生菌体系的无机材料选择了来自蒙皂石(smectite)族天然的或者经过一定人工处理的，矿物材料。更具体地说，选择了来自蒙脱石(montmorillonite)亚族的，天然的或者经过一定人工处理的，矿物材料。

在其他一些实施例中，组成益生菌体系的无机材料还选择了硅藻土、高岭土或凹凸棒土中的一种。

在其他一些实施例中，组成益生菌体系的无机材料还选择了人工制备的，在酸性环境中表面带正电荷的材料。

为了让益生菌与无机材料形成稳定可用的体系，发明人将益生菌培养液与无机材料悬液混合后继续培养一定时间，随后得到稳定可用的混合体系。

为了形成稳定可用的益生菌无机材料体系。可以按照以下步骤制备：

S1：益生菌的活化及培养扩增：25-40℃，0-200rpm条件下厌氧培养10min-4h

S2：无机材料的活化：无机材料在等渗缓冲液中搅拌10min-1h；

S3：益生菌在无机材料表面的吸附及益生菌生物被膜的形成及稳定：无机材料与益生菌以10：1-1：10的比例混合，25-40℃，0-200rpm条件下厌氧培养4h-48h；

S4：成品分离并纯化后冻干并于4摄氏度的环境下保存。

为了后期施用的方便，为施用方式提供多种选择，本发明所述的益生菌体系的形态为可冲泡的固体形态、可咀嚼的固体形态、可注射的注射液、可口服的口服液和可吸入的气态中的一种。要获得上述这些形态，只需通过已知的常规加工工艺对通过上述方法形成的稳定的益生菌体系进行加工即可获得。

通过实验证明，采用本发明公开的方法获得的益生菌体系能够让外源益生菌稳定、快速、长期地定居到宿主体内，从而在宿主体内重建、优化肠道微生物组成，因此可以理所当然地预见，只要在宿主体内重建、优化肠道微生物组成能够治疗或缓解这些疾病，那么本发明公开的益生菌体系必然能够用于这些疾病的治疗。这些疾病至少包括：腹泻、便秘、消化不良、高血压、乳糖酶缺乏、乳糖不耐受、阴道感染、肝硬化、腹腔炎症、肠源性内毒素血症、特应性皮炎、过敏、肠易激综合征、牙周炎、精神类疾病、溃疡性结肠炎、多囊卵巢综合症。

另外，通过一系列的实验证明，本发明所述的益生菌体系对恶性肿瘤有着广泛的治疗效果以及肿瘤生长抑制效果。这些恶性肿瘤至少包括：恶性黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌。

本发明所述的益生菌体系可以作为药物在治疗各类恶性肿瘤时使用，也可以作为目前现有治疗体系的辅助发挥作用，一方面本发明所述的益生菌体系可以作为化疗或免疫疗法过程中帮助患者恢复、重建肠道微生物群落组成的保健品使用；另一方面也可以作为化疗及免疫疗法的辅助治疗药物使用。实验证明，本发明所述的益生菌体系能够显著提高目前已知化疗及免疫疗法的效果。

本发明创造性地将生物体内的益生菌在体外与无机材料系统结合，通过混合培养的方式，能够形成“细菌-无机材料-生物被膜”这样的复合微球，该微球能够很好地解决背景技术中提到的问题，即外源细菌在宿主肠道中的栖息能力很差，非常容易被胃肠环境直接清除。该微球能够很好地吸附在宿主的肠道内表面，并且为益生菌的稳定生长于繁殖提供安全可靠的环境，而不被宿主自身的消化系统所清除。因此，可以预见到的是，凡是重建或优化人体肠道益生菌具有一定治疗效果的疾病，本发明所述的技术方案均能起到一定的效果。

除了创造性地提出这样的设计思路，发明人还进行了大量的研究，发现了益生菌与无机材料体系稳定结合并最终能够形成“细菌-无机材料-生物被膜”复合微球的机理，从而总结出了适于为益生菌提供稳定生长环境的无机材料的特点。这样的无机材料应当具有阳离子交换能力，并且具有高表面积，更为关键的是，这种材料应当自身带有正电荷，更佳的选择是这种材料在中性或碱性环境下不带正电荷，而在酸性环境中带有正电荷。

另外，发明人还发现，利用最优选的无机材料，可以选择性地促进特定益生菌生长和繁殖，例如，乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)正属于被选择性促进的益生菌。

乳杆菌和双歧杆菌是革兰氏阳性菌，其细胞壁中的茶酸可通过Toll样受体2(TLR2)识别。这些在肠道中形成的乳杆菌和双歧杆菌通过TLR2与树突状细胞相互作用，激活树突状细胞并驱动它们进入肿瘤。同时，活化的树突状细胞作为关键抗原提呈细胞(APC)，在启动T细胞的过程中起着核心作用。发明人进一步的研究表面，细胞毒性T细胞(CD8

附图说明

图1为双歧杆菌蒙脱石表面形成生物被膜的电镜照片。

图2为乳杆菌蒙脱石表面形成生物被膜的电镜照片。

图3为大肠杆菌在APTES处理后的蒙脱石表面形成生物被膜的电镜照片。

具体实施方式

结合下列实施例，将可以更好地理解本发明。

益生菌+无机材料体系功效实验的准备：

(1)微生物的培养与准备。

为了进行有效的对比，共选择双歧杆菌(A)、乳杆菌(B)、大肠杆菌(阴性对照)(C)。这三种微生物均来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，按下表所述方式进行厌氧培育，待后续实验使用。

(2)无机材料的准备。

若干种无机材料的准备。为了进行有效的对比，共准备了以下无机材料进行实验：包括蒙脱石(1)，硅藻土(2)、高岭土(3)、凹凸棒土(4)、介孔二氧化硅(5)、金属骨架二氧化硅MOF-5(6)、蒙脱石与硅藻土混合物(7)蒙脱石和凹凸棒土混合物(8)、蒙脱石和金属骨架二氧化硅混合物(9)，这些材料的准备过程分别为：

将经过无菌处理的无机材料颗粒与磷酸盐缓冲液(PBS)混和，搅拌混匀，制得所需矿物材料悬液。无机材料的无菌处理采用紫外照射方法。

其中，蒙脱石(1)购于先声药业，硅藻土(2)、高岭土(3)、凹凸棒土(4)购于阿里巴巴，介孔二氧化硅(5)、金属骨架二氧化硅MOF-5(6)购自美国西格玛公司。

无机材料的颗粒大小控制在300-600目，大约为20～50微米，各种材料体系的浓度及比例如下表所示。

(3)微生物与无机材料混合体系的准备

微生物按(1)微生物的准备中的方法培养一段时间后，将无机材料悬液按一定比例加入培养液中，在37摄氏度混合培养一定时间即可。具体的比例以及混合培养时间如下表所示。

(4)成品分离并纯化

用离心方式将微生物与无机材料的结合体与液体分离，离心条件为1000rpm，5min。用步骤(2)中所使用的等渗缓冲液冲洗离心获得的沉淀物，获得纯化的微生物与无机材料的结合体。

将微生物与无机材料的结合体在缓冲液中重悬，获得0.01g/ml浓度的悬混液备用。

图1和图2分别为双歧杆菌蒙脱石表面形成生物被膜的电镜照片和乳杆菌蒙脱石表面形成生物被膜的电镜照片。说明通过上述方式获得了预想中的微生物与无机材料结合体。

(5)小鼠实验

为了验证本发明的效果，准备了多种病症模型小鼠，实验其效果的对象包括：纯PBS、纯微生物培养液双歧杆菌(下表中以A表示)、乳杆菌(下表中以B表示)、大肠杆菌(下表中以C表示)、纯无机材料悬液：蒙脱石(下表中以1表示)、硅藻土(下表中以2表示)、高岭土(下表中以3表示)、凹凸棒土(下表中以4表示)、人工制备的微孔及金属骨架二氧化硅MOF-5(下表中以5、6表示)、蒙脱石+硅藻土(下表中以7表示)、蒙脱石+凹凸棒土(下表中以8表示)、蒙脱石+金属骨架二氧化硅混合物(下表中以9表示)、微生物培养液与无机材料悬液刚刚混合之后获得的混合液下表中以FA+(1)——(9)、FB+(1)——(9)、FC+(1)——(9)表示，微生物培养液与无机材料悬液混合培养之后获得的混合液SA+(1)——(9)、SB+(1)——(9)、SC+(1)——(9)。

另外，由于益生菌混合体系的作用是通过生物体消化道系统为基础产生作用的，因此无法采用细胞实验进行效果验证，必须采用生物活体实验。因此本发明采用了常见的小鼠实验对效果进行验证。具体地说，采用对照组和治疗组之间肿瘤瘤重的变化来评估对肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤的瘤重-治疗组肿瘤的瘤重)÷对照组肿瘤的瘤重×100％，个别情况下，治疗组测试的对象是无效的，会出现负的肿瘤抑制率，为方便数据处理，约定出现负数的情况以及肿瘤抑制率低于3％的统一用0来表示。这些情况下表示该治疗组测试的对象无效果。

另外，每个实验对象设置10个重复(即每个体系均用10只小鼠)，用瘤重的平均值来作为计算的基础。

另外，为了验证各类对象与现行常见的化疗药以及免疫治疗制剂的联合使用效果，发明团队还设置了两组实验，分别是将SA+(1)——(9)、SB+(1)——(9)、SC+(1)——(9)与阿霉素(ADM)联用，用以及将SA+(1)——(9)、SB+(1)——(9)、SC+(1)——(9)与PD1联用。其中，阿霉素的使用条件如下：18-20g小鼠，腹腔注射阿霉素，剂量为3mg/kg，植瘤后第四天开始，每两天注射一次。

PD1的使用条件如下：18-20g小鼠，尾静脉注射PD1抗体，剂量为10mg/kg，植瘤后第四天开始，每两天注射一次。

实施例1：黑色素瘤小鼠实验

B16-F10细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，B16-F10肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例2：乳腺癌小鼠实验

4T1细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的BALB/c小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入BALB/c小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，4T1肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例3：结肠癌小鼠实验

MC38细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，MC38肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例4：骨肉瘤小鼠实验

S180细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，S180肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例5：肝癌小鼠实验

heps细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，heps肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例6：肺癌小鼠实验

LLC细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，LLC肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例7：宫颈癌小鼠实验

Hela细胞，来源于中国科学院上海生科院细胞资源中心；体重18-20克的SPF级的BALB/c Nude小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

将上述实验对象通过灌胃给药的方式注入BALB/c Nude小鼠胃内，每只小鼠按0.01g矿物材料的量计算给药量，每两天一次，共灌胃两周。在第十五天时，Hela肿瘤细胞通过红细胞计数板计数活细胞，然后把细胞调整为5×10

实施例8：腹泻小鼠实验

体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

小鼠空腹4h后，每间隔12h给药(番泻叶浸出液)0.5ml，连续给药四天，观察到小鼠明显腹泻症状后停止给药。将制备好的需实验的对象灌服液通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.05g矿物材料的量计算给药量，每天2次，共灌胃2天。3天后统计治疗效果，如果在最后一天小鼠不再腹泻，则视为治愈。

实施例9：溃疡性结肠炎小鼠模型

体重18-20克的SPF级的C57BL/6J小鼠，购买于扬州大学动物实验中心。

C57BL/6J小鼠饮用3％DSS水溶液7天后，观察到小鼠明显体重减轻，腹泻，便血症状。将制备好的需实验的对象灌服液通过灌胃给药的方式注入C57BL/6J小鼠胃内，每只小鼠按0.05g矿物材料的量计算给药量，每天1次，共灌胃7天。7天后统计治疗效果，如果在最后一天小鼠不再腹泻便血，体重恢复，则视为治愈。

实施例10：微生物在不同条件处理后蒙脱石表面形成被膜的实验

使用3-三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐(TESSA)修饰蒙脱石，步骤如下：取蒙脱石1g，分散于100mL ddH2O，温和振荡30分钟后，加入1mL TESSA。将混合液置于回流装置中60℃加热搅拌24h。之后，使用乙醇和dd H2O清洗产物，得到TESSA-MMT。TESSA，化学式：C

使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰蒙脱石，步骤如下：取蒙脱石1g，分散于100mL ddH2O，温和振荡30分钟后，加入1.6mL APTES。将混合液置于回流装置中60℃加热搅拌24h。之后，使用乙醇和dd H2O清洗产物，得到APTES-MMT。APTES，化学式：H

这样就获得了三种蒙脱石，其表面电荷性质如下：未处理的蒙脱石表面在酸性环境带正电荷、经APTES处理的蒙脱石表面一直带正电荷，经TESSA处理的蒙脱石表面始终不带正电荷。

将培养基pH调至7附近，将嗜酸乳杆菌与未经处理的蒙脱石一起培养，发现嗜酸乳杆菌无法在蒙脱石颗粒上形成生物被膜。而在将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌培养基的pH调至低于5.5时，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌能够在未经处理的蒙脱石颗粒上形成生物被膜。

经TESSA处理的蒙脱石能够在pH5.5时保持负电性，当将嗜酸乳杆菌与TESSA-MMT共培养时，嗜酸乳杆菌未在颗粒表面形成生物被膜。

经APTES处理的蒙脱石表面一直带正电荷，嗜酸乳杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等均能够在APTES-MMT表面形成生物被膜。图3就是大肠杆菌在APTES处理后的蒙脱石表面形成生物被膜的电镜照片，而大肠杆菌、枯草芽孢杆菌是不能在未经修饰的蒙脱石表面形成生物被膜的。

以上实验结果表明，颗粒表面的正电性在生物被膜形成过程中具有关键作用。蒙脱石选择性地支持产酸微生物在其表面形成生物被膜的潜在机制可能是由于特定产酸微生物产生的酸性环境，使其相应地转变成表面正电荷。

以上结合具体实施方式(包括实施例和实例)详细描述了本发明的概念、原理和思想。本领域技术人员应理解，本发明的实施方式不止上文给出的这几种形式，本领域技术人员在阅读本申请文件以后，可以对上述实施方式中的步骤、方法、装置、部件做出任何可能的改进、替换和等同形式，这些改进、替换和等同形式应视为落入本发明的范围内。本发明的保护范围仅以权利要求书为准。