用于诱导软骨发生以治疗关节损害的6-羟基-8-氧杂三环3.2.1.02,4辛烷-2-甲酰胺衍生物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年12月6日提交的美国临时申请序列号62/776,271的权益，将其通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防由关节损伤和关节炎引起的关节损害或用于软骨修复的组合物和方法。

背景技术

骨关节炎(OA)代表最常见的肌肉骨骼障碍。目前大约有4000万美国人受到影响，且由于人口老龄化和预期寿命延长，预计在未来二十年内，这一数字将增加到6000万，使骨关节炎成为导致残疾的第四大原因。OA的特征在于关节的缓慢退行性破坏，所述关节包括关节软骨(含有细胞和基质，其为关节产生润滑和缓冲)和关节软骨下面的软骨下骨。OA可被认为是多种病因的结果。例如，骨关节炎可能由关节软骨或骨的异常生物力学应力或者遗传或后天异常引起。目前OA治疗包括使用口服NSAID或选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂、关节内(IA)注射药剂例如皮质类固醇和透明质酸、以及手术方法来缓解疼痛。

关节损害例如急性关节损伤(如半月板或韧带撕裂)或关节内骨折也可导致关节炎，例如创伤后关节炎。由于关节软骨的修复能力有限，所以即使很小的不可检测的损害通常也会随着时间的推移而恶化并导致OA。目前关节损伤的治疗可以包括手术和聚焦于使受伤关节再生的其他侵入性方法，以及用药剂治疗以减少疼痛和炎症。

间充质干细胞(MSC)存在于成人关节软骨中，并且在分离后可以在体外程序化以分化为软骨细胞和其他间充质细胞谱系，并且可以用于软骨再生。部分地，所述过程受生长因子(TGFβ、BMP)、血清条件和细胞间接触的调节。

WO 2011/008773描述了肽组合物及这些组合物用于治疗或预防关节炎和关节损伤的用途以及用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。此外，WO 2012/129562描述了小分子化合物、组合物及这些组合物用于改善关节炎和关节损伤的用途以及用于诱导间充质细胞分化为软骨细胞的用途。

尽管手术技术和再生技术已经在软骨恢复、延缓退化和改善关节损害的修复上取得了一些进展，但是仍持续需要改进用于有效软骨再生、治疗关节损害、和改善或预防OA的组合物和方法。

发明内容

本发明涉及用于治疗或预防由关节损伤和关节炎引起的关节损害或用于软骨修复的组合物和方法。

在一个方面，本发明提供了具有式(1)的化合物：

或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

W是苯基或吡啶基；

R

R

R

n是0-2。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的具有式(1)或其子式的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；以及一种或多种药学上可接受的载体。

在又另一方面，本发明提供了一种组合，特别是药物组合，所述组合包含治疗有效量的具有式(1)或其子式的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；以及一种或多种治疗活性剂。

本发明的化合物，单独或与一种或多种治疗活性剂组合，可用于治疗、改善或预防急性关节损害或损伤，例如关节炎(骨关节炎、创伤性关节炎、系统性类风湿性关节炎)或退行性椎间盘疾病。此外，本发明的化合物，单独或与一种或多种治疗活性剂组合，可用于诱导透明软骨产生。

具体实施方式

本发明提供了刺激受损关节中透明软骨产生的新型化合物。

在一个方面，本发明提供了用于修复软骨的新型化合物和组合物。还提供了通过向关节、软骨组织、或软骨邻近组织中、或全身性地施用本发明化合物或组合物来治疗、预防或改善关节炎或关节损伤的组合物和方法。进一步地，本发明提供用于诱导透明软骨产生的组合物和方法。

出于解释本说明书的目的，将应用下面的定义，并且在适宜的情况下，以单数形式使用的术语还包括复数形式，并且反之亦然。

如本文所用，术语“C

如本文所用，术语“C

如本文所用的“氨基”指基团-NH

如本文所用的“杂环基”或“杂环的”是指包含独立地选自氮、氧和硫的1、2或3个杂原子的稳定的5元或6元非芳族单环环基团。杂环基基团可以经由碳原子或杂原子键合。杂环基的实例包括但不限于吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、或吗啉基。

如本文所用，术语“杂芳基”是指包含1、2、3或4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元或6元芳族单环环基团。杂芳基基团可以经由碳原子或杂原子键合。杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基或吡啶基。

如本文所用的“IC

如本文所用的“卤基(halo)”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用的“卤基取代的C

如本文所用的“被保护的衍生物”是指抑制剂的衍生物，其中一个或多个反应部位被保护基阻断。被保护的衍生物可用于制备抑制剂，或者它们自身可以具有抑制剂的活性。被保护的基团的实例包括但不限于乙酰基、四氢吡喃、甲氧基甲基醚、β-甲氧基乙氧基甲基醚、对甲氧基苄基、甲基硫代甲基醚、新戊酰、甲硅烷基醚、苄氧羰基、苄基、叔丁氧羰基、对甲氧基苯基、9-芴基甲基氧基羰基、缩醛、缩酮、缩羰酯(acylal)、二噻烷、甲基酯、苄基酯、叔丁基酯和甲硅烷基酯。合适的保护基的详细清单可以在T.W.Greene,Protecting Groupsin Organic Synthesis[有机合成中的保护基],第3版,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司]1999中找到。

如本文所用，术语“软骨细胞(chondrocyte)”是指分化的软骨细胞(cartilagecell)。软骨细胞产生并维持由胶原蛋白和蛋白聚糖组成的软骨基质。软骨细胞源自软骨发生性祖细胞(CPC)的分化。分化是从不太专化的细胞类型形成专化细胞类型的过程，例如，从软骨发生性祖细胞(CPC)形成软骨细胞。

如本文所用，术语“软骨细胞分化剂”是指诱导软骨发生性祖细胞分化为成熟软骨细胞的试剂，成熟软骨细胞合成软骨细胞外基质(ECM)。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物、灵长类动物(例如，人(男性或女性))、狗、兔、豚鼠、猪、大鼠和小鼠。在某些实施例中，受试者为灵长类动物。在又其他的实施例中，受试者是人。

如本文所用，术语“抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病症、症状或障碍、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。

如本文使用的，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”是指缓解或改善疾病或障碍(即，减慢或阻止疾病或其至少一种临床症状的发展)；或缓解或改善与所述疾病或障碍相关的至少一种物理参数或生物标记，包括患者可能无法辨别的那些物理参数或生物标记。

如本文所用，术语任何疾病或障碍的“预防(prevent、preventing或prevention)”是指疾病或障碍的预防性治疗；或延迟疾病或障碍的发作或进展。

如本文所用，如果受试者将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中获益，则这样的受试者是“需要”这种治疗的。

如本文所用，术语本发明的化合物的“治疗有效量”是指将引起受试者的生物或医学响应(例如，酶或蛋白活性的减小或抑制，或改善症状、缓解病症、减慢或延迟疾病进展或预防疾病等)的本发明的化合物的量。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的如下量，当施用至有需要的受试者时，所述量有效地至少部分缓解、抑制、预防和/或改善关节损伤和关节炎引起的关节损害。在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明化合物的如下量，当施用至细胞、或组织、或非细胞生物学材料或介质时，所述量有效地促进软骨发生。

如本文所用，“施用”指对特定关节的施用。

如本文所用，术语“药物组合物”是指呈适于口服或肠胃外施用的形式的本发明化合物、或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体。

如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”是指可用于制备或使用药物组合物的物质，并且包括例如适合的稀释剂、溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、缓冲剂、乳化剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、染料及其组合，如本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践],第22版,PharmaceuticalPress[药物出版社],2013,第1049-1070页)。

如本文所用，术语“一个/种(a/an)”、“所述(the)”以及在本发明的上下文中使用的类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数两者，本文中除非另有说明或明确与上下文相矛盾。

本发明涉及用于治疗或预防由关节损伤和关节炎引起的关节损害或用于软骨修复的组合物和方法。

本文描述了本发明的各种列举的实施例。每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外实施例。

实施例1.一种具有式(1)的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐，如上所述。

实施例2.根据实施例1所述的具有式(1)的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例3.根据实施例1所述的具有式(1)的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例4.根据实施例1-3中任一项所述的具有式(1)的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

其中

实施例5.根据实施例1-3中任一项所述的具有式(1)的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

实施例6.根据实施例1-3中任一项所述的具有式(1)的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

实施例7.根据实施例1-6中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(2)：

或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

X是N、CH或CR

R

实施例8A.根据实施例7所述的化合物，其中所述化合物具有式(2A)：

或是其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

X是N、CH或CR

R

实施例8B.根据实施例7所述的化合物，其中所述化合物具有式(2B)：

或是其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中

X是N、CH或CR

R

实施例9.根据实施例1-7和8A-8B中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例10.根据实施例1-7和8A-8B中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例11A.根据实施例1-7、8A-8B和9-10中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例11B.根据实施例1-7、8A-8B和9-10中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例11C.根据实施例1-7、8A-8B和9-10中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例11D.根据实施例1-7、8A-8B和9-10中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例11E.根据实施例1-7、8A-8B和9-10中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例12.根据实施例1-7、8A-8B、9-10和11A-11E中任一项所述的化合物或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐；其中R

实施例13.根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物选自表2或表3中的化合物；或其对映异构体、对映异构体混合物或其药学上可接受的盐。

实施例14.根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有(1R,2R,3S,4R,5S)对映异构体的至少50％、至少75％、至少85％、或至少95％的对映异构体过量。

实施例15.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的化合物、以及一种或多种药学上可接受的载体。

实施例16.一种组合，所述组合包含根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的化合物、以及一种或多种治疗活性剂。

实施例17.根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的化合物，并且任选地与第二治疗剂组合，用于在有需要的受试者中治疗、改善或预防关节炎或关节损伤、或用于软骨修复。

实施例18.根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的化合物，并且任选地与第二治疗剂组合，在制造用于关节炎或关节损伤或用于软骨修复的药物中的用途。

实施例19.一种用于在有需要的受试者中治疗、改善或预防关节炎或关节损伤或用于软骨修复的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的、以及任选地与第二治疗剂组合的化合物；从而治疗、改善或预防所述受试者的关节炎或关节损伤，或修复软骨。

实施例20.根据实施例19所述的方法，其中所述化合物口服施用。

实施例21.根据实施例17所述的化合物、根据实施例18所述的用途或根据实施例19或20所述的方法，其中所述关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎或自身免疫性关节炎；并且任选地，其中所述关节炎是骨关节炎或类风湿性关节炎。

实施例22.一种诱导透明软骨产生的方法，所述方法包括使软骨发生性祖细胞与治疗有效量的根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的、以及任选地与第二治疗剂组合的化合物接触；从而诱导透明软骨细胞外基质。

实施例23.一种诱导软骨发生性祖细胞分化为成熟软骨细胞的方法，所述方法包括使软骨发生性祖细胞与治疗有效量的根据实施例1-7、8A-8B、9-10、11A-11E和12-14中任一项所述的、以及任选地与第二治疗剂组合的化合物接触；从而诱导软骨祖细胞分化为成熟软骨细胞。

实施例24.根据实施例22或实施例23所述的方法，其中所述接触步骤是在哺乳动物体外或体内进行的；并且当在体内进行时，所述软骨发生性祖细胞存在于哺乳动物中。

实施例25.根据实施例24所述的方法，其中所述接触步骤发生在细胞外基质或生物相容性支架中。

实施例26.根据实施例17所述的化合物、根据实施例18所述的用途或根据实施例19-25中任一项所述的实施例，其中所述第二治疗剂是软骨细胞分化剂。

实施例27.根据实施例17所述的化合物、根据实施例18所述的用途或根据实施例19-25中任一项所述的实施例，其中所述第二治疗剂选自血管生成素样3蛋白(ANGPTL3)、胰岛素生长因子(IGF1)、SM04690、Janus激酶抑制剂、口服鲑鱼降钙素、SD-6010、维生素D3、胶原蛋白水解物、骨形态发生蛋白7(BMP7)、醋酸卢沙拉肽(rusalatide acetate)、鳄梨大豆非皂化物(ASU)、类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、透明质酸、kartogenin、TPX-100、以及具有如WO 2015/175487中所述的式(I)或其子式的软骨细胞分化剂。

实施例28.根据实施例27所述的化合物、根据实施例27所述的用途或根据实施例27所述的实施例，其中所述第二治疗剂是选自以下的软骨细胞分化剂：

(1R,2S,3R,4S)-N-(3,4-二氯苯基)-3-(1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

(1S,2R,3R,4R)-N-(3,4-二氯苯基)-3-(吡啶-4-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

(1S,2S,3R,4R)-3-(2-氨基吡啶-4-基)-N-(3,4-二氯苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

(1R,2S,3S,4S)-N-(3,4-二氯苯基)-3-(吡啶-4-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

N-(2-氯-2'-氟-[1,1'-联苯基]-4-基)-3-(1H-吡唑-5-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-甲酰胺；

(1R,2R,3S,4S)-N-(3,4-二氯苯基)-3-(吡啶-4-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

(1S,2S,3R,4R)-N-(3,4-二氯苯基)-3-(吡啶-4-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

(1R,2R,3S,4S)-3-(2-氨基吡啶-4-基)-N-(3,4-二氯苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺；

(1R,2R,4S,5S)-N-(3,4-二氯苯基)-4-(吡啶-4-基)-8-氧杂三环[3.2.1.02,4]辛烷-2-甲酰胺；以及

N-(2,2'-二氟-[1,1'-联苯基]-4-基)-3-(吡嗪-2-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-甲酰胺；

或其药学上可接受的盐的对映异构体、对映异构体混合物。

除非另有指明，否则术语“本发明的化合物”是指具有式(1)及其子式(例如，式(2))的化合物及其对映异构体和盐，以及旋转异构体、互变异构体、同位素标记的化合物(包括氘取代)和固有形成的部分。

除非另有说明，否则本文中表示为单一对映异构体的化合物包括所示化合物的对映异构体和对映异构体的混合物，包括外消旋混合物。本发明的一种或多种化合物的任何非对称原子(例如，碳等)可以是外消旋或对映异构体富集的形式，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型。可以通过已知方法，例如通过手性色谱法，例如使用手性吸附剂的高压液相色谱法(HPLC)，将最终产物或中间体的任何所得外消旋物拆分成旋光对映体。

在某些实施例中，每个非对称原子具有至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量、或至少99％对映异构体过量的(R)-或(S)-构型。

本文给出的任何式也旨在表示化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有由本文给出的式描绘的结构，除了一个或多个原子被具有所选择的原子质量或质量数的原子替代。可以掺入本发明化合物中的同位素包括例如氢的同位素。

此外，掺入某些同位素，特别是氘(即

可以掺入本发明的化合物的同位素的其他实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如分别是

本发明的化合物是以游离形式、作为其盐形式获得的。如本文所用，术语“盐(salt或salts)”是指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和特性，并且典型地不是生物学上或其他方面不希望的盐。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。

可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。可以衍生出盐的无机酸包括，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生出盐的有机酸包括，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。

可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第I至XII列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代的胺(包括天然存在的取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。

在另一个方面，本发明提供了呈以下形式的本发明的化合物：乙酸盐、抗坏血酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、癸酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、乙醇酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、癸二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三苯乙酸盐(trifenatate)、三氟乙酸盐或昔萘酸盐形式。

在本文描述的所有方法能够以任何合适顺序进行，除非另外指明或另外与上下文明显相矛盾。

具有式(1)的化合物可以如方案1中总体说明的那样制备，其中R

中间体1b可以经由溴化和与呋喃的狄尔斯-阿德尔(Diels-Alder)反应，由商购获得的丙炔酸甲酯(1a)制备。可以经由中间体1b的硼氢化/氧化制备中间体1c。可以经由中间体1c的TBS保护来制备中间体1d。可以通过对中间体1d进行铃木偶联来制备中间体1e。将中间体1e环丙烷化，得到中间体1f。使用中间体1f、苯胺、和LiHMDS形成酰胺键，并且随后使用TBAF进行脱保护，得到具有式(1)的化合物。

本发明进一步包括本发明方法的任何变体；例如，其中将在其任何阶段可获得的中间体产物用作起始材料，并进行其余步骤；其中起始材料在反应条件下原位形成；或其中将反应组分以其盐或光学纯物质的形式使用。本发明的化合物及中间物还可根据本领域普通技术人员通常已知的方法彼此转化。

本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗、改善或预防关节炎或关节损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的化合物，其中所述受试者患有关节损害或关节炎或处于其风险中。本发明还提供了在人类患者中治疗、改善或预防关节炎或关节损伤的方法，所述方法包括：患者口服施用包含有效量的本发明化合物的组合物，从而在患者中治疗、改善或预防关节炎或关节损伤。在一些实施例中，患者患有关节炎或关节损伤。在一些实施例中，个体不患有关节炎或关节损伤，但有此风险。一些实施例中，关节炎是骨关节炎、创伤性关节炎、或自身免疫性关节炎。

本发明的化合物还可用于诱导透明软骨产生，包括使软骨发生性祖细胞(CPC)与治疗有效量的任选地与第二治疗剂组合的具有式(1)或其子式的化合物接触；从而诱导透明软骨产生。在一个非限制性实施例中，通过预防软骨祖细胞的软骨细胞肥大来诱导透明软骨产生。在另一个非限制性实施例中，通过诱导软骨发生性祖细胞分化为成熟软骨细胞，尤其是产生透明软骨细胞外基质的成熟软骨细胞，来诱导透明软骨产生。

CPC可以分化为不同类型的细胞，包括但不限于成骨细胞、透明软骨细胞和肥大软骨细胞。分化是从不太专化的细胞类型形成专化细胞类型的过程，例如，从软骨发生性祖细胞形成软骨细胞。在一些实施例中，所述方法是在体外进行的。在一些实施例中，所述方法在哺乳动物体内进行，并且祖细胞存在于哺乳动物中。

诱导软骨发生性祖细胞进行软骨细胞分化可以使用任何合适量的本发明化合物来完成。在一些实施例中，根据活性组分的特定应用和效力，本发明的化合物能以约0.1mg至约10000mg(例如1.0mg至1000mg，例如10mg至500mg)的量存在。在一些实施例中，本发明的化合物可以每天一次口服施用，剂量为1mg/kg至约300mg/kg。对于严重的骨关节炎，治疗持续时间从一周或更短至长期治疗不等。

预期本发明的化合物、组合物和方法可以用于治疗、改善或预防任何类型的关节软骨损害(例如，关节损害或损伤)，包括例如由创伤事件、或腱或韧带撕裂引起的损害。一些实施例中，例如在存在关节炎或关节损害或关节损伤的遗传史或家族史的情况下，或在关节手术之前或期间，施用本发明的化合物或组合物以预防或改善关节炎或关节损害。一些实施例中，使用化合物、组合物和方法治疗关节损害。在特定实施例中，所述关节损害是创伤性关节损伤。在其他实施例中，所述关节损害是由年龄或不活动引起的损害。在又其他实施例中，所述关节损害是由自身免疫障碍引起的损害。在其他实施例中，所述关节损害是由代谢障碍(例如糖尿病)引起的损害。在本发明的一些实施例中，本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗、改善或预防骨关节炎。一些实施例中，在有罹患或获得关节炎的风险的受试者中使用所述化合物、组合物和方法以改善或预防关节炎。一些实施例中，在有罹患或获得关节损害的风险的受试者中使用所述化合物、组合物和方法以改善或预防关节损害。

在一些实施例中，本发明的化合物、组合物和方法可用于刺激例如已经由于创伤性损伤或软骨病受损的软骨组织中的透明软骨产生。在特定实施例中，本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗关节中例如在关节连接面(例如脊柱、肩膀、肘、腕、手指关节、臀、膝盖、踝和脚关节)处的软骨损害。可受益于治疗的疾病或障碍的实例包括骨关节炎、类风湿性关节炎、其他自身免疫疾病或分离性骨软骨炎。此外，软骨损坏或破坏可以因一些遗传或代谢性病症引起，软骨畸形常常以侏儒症的形式见于人类中，和/或软骨损坏或破坏常常可以因重建手术引起；因此，化合物、组合物和方法在这些患者中可以是有用的疗法，其可以单独或组合其他方法使用。

进一步预期本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗、改善或预防各种软骨障碍和/或此类病症的相关症状或影响。用本发明的化合物、组合物和方法治疗、改善和/或预防的示例性病症或障碍包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、骨关节炎、退行性椎间盘疾病、脊柱关节病、埃勒斯-当洛斯(Ehlers Danlos)综合征、系统性硬化病(硬皮病)或腱疾病。可能会受益于化合物的治疗以改善相关影响的其他病症或障碍包括特发性炎症性肌病(皮肌炎、多肌炎)，舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性睡眠性血红蛋白尿症)，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少)，甲状腺炎(格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、幼年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)，糖尿病，免疫介导的肾脏疾病(肾小球性肾炎、肾小管间质性肾炎)，中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrsyndrome)和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，肝胆疾病如传染性肝炎(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎和其他非嗜肝病毒型肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎，炎症性肠病(溃疡性结肠炎：克罗恩病)，谷蛋白敏感性肠病和惠普耳氏病，自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、牛皮癣，过敏性疾病例如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹，肺部免疫性疾病例如嗜酸性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，移植相关的疾病包括移植排斥和移植物抗宿主疾病。

预期本发明的化合物和/或组合物可以促进人皮肤成纤维细胞中胶原蛋白的表达。胶原蛋白是真皮的主要结构组分。胶原蛋白对皮肤健康至关重要，并且已被广泛用于皮肤皱纹处理和皮肤老化，并作为烧伤患者的治愈辅助剂。胶原蛋白是在成纤维细胞中产生的，且人和牛胶原蛋白都被广泛使用。因此，本发明提供了一种在成纤维细胞中增加胶原蛋白的产生的方法，所述方法通过使成纤维细胞与本发明的化合物或组合物接触，从而增加成纤维细胞中胶原蛋白的产生。可以通过在待治疗区域中直接注射所述化合物来在体内进行所述接触。可以在体外在成纤维细胞群中进行所述接触。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在另一个实施例中，组合物包含至少两种药学上可接受的载体，例如本文所述的那些。药物组合物可以配制用于特定的施用途径，诸如口服施用、肠胃外施用(例如通过注射、输注、透皮或局部施用)，和直肠施用。局部施用也可以涉及吸入或鼻内应用。本发明的药物组合物可以以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)、或以液体形式(包括但不限于溶液、混悬液或乳液)制成。片剂可根据本领域已知的方法添加薄膜包衣或肠溶包衣。典型地，药物组合物是包含活性成分及以下中的一种或多种的片剂或明胶胶囊：

a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；

b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬酯酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包含

c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮；如果希望的话

d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；以及

e)吸附剂、着色剂、调味剂及甜味剂。

一般而言，本发明的化合物将以治疗有效量经由本领域中已知的任何常用且可接受的模式单独或与一或多种治疗剂组合施用。在一些实施例中，通过直接注射到关节滑液中、系统性施用(口服或静脉内施用)或直接施用在软骨缺损中而应用本发明的化合物和组合物，单独或与合适的载体复合以延长化合物的释放。一些实施例中，化合物或组合物在生物相容性基质或支架中施用。

本发明的化合物、组合物和方法也可以与在受累及的关节处的外科手术一起使用。本发明的化合物或组合物的施用可以是在外科手术之前进行、期间或一起进行和/或之后进行。例如，本发明的化合物、组合物和方法可以用于扩增培养的软骨细胞群以用于自体或同种异体软骨细胞植入(ACI)。可以移植软骨细胞，任选地伴随与由施用本发明化合物和组合物组成的并行治疗。在这些程序中，例如可以从受损关节的未损伤的小负荷区域通过关节镜收获软骨细胞，并且可以在体外培养，任选地在本发明的化合物和组合物和/或其他生长因子的存在下培养以在移植前增加细胞数。然后任选地将扩增的培养物与本发明的化合物和组合物混合和/或置于关节空间中或直接置于缺损中。在某些实施例中，将扩增的培养物(任选地具有本发明的化合物)置于悬浮在基质或膜中的关节空间中。

在其他实施例中，本发明的化合物和组合物可以与一个或多个骨膜移植物或软骨膜移植物组合使用，所述骨膜移植物或软骨膜移植物含有软骨形成细胞和/或有助于将移植的软骨细胞或软骨细胞前体细胞保持在适当位置。在一些实施例中，本发明的化合物和组合物与其他程序联用以修复软骨损害，所述其他程序包括但不限于关节的灌洗、骨髓的刺激、磨削成形术、软骨下骨钻孔术或近端软骨下骨的微骨折。任选地，在本发明的化合物和组合物的施用以及软骨的生长之后，另外的手术治疗可以有利于适当地勾画新形成的一个或多个软骨表面。

本发明化合物可以与一种或多种其他的治疗剂同时施用、或在其之前或之后施用。本发明化合物可以通过与其他药剂相同或不同的施用途径分开施用，或在相同的药物组合物中一起施用。治疗剂是例如化学化合物、肽、抗体、抗体片段或核酸，当将所述治疗剂与本发明的化合物组合施用患者时，所述治疗剂具有治疗活性或增强治疗活性。

在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含具有式(1)或其子式的化合物和一种或多种第二治疗剂。所述第二药剂可以是一种或多种另外的软骨细胞分化剂。软骨细胞分化剂的实例包括但不限于血管生成素样3蛋白(ANGPTL3)、胰岛素生长因子(IGF1)、SM04690(Wnt抑制剂)、Janus激酶抑制剂(如鲁索替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)、巴瑞替尼(baricitinib))、口服鲑鱼降钙素、SD-6010(iNOS抑制剂)、维生素D3(胆钙化醇)、胶原蛋白水解物、骨形态发生蛋白7(BMP7)、醋酸卢沙拉肽、鳄梨大豆非皂化物(ASU)、类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)、或透明质酸、kartogenin、TPX-100、以及具有如WO 2015/175487中所述的式(I)或其子式的软骨细胞分化剂。化合物式(1)或其子式和另一种治疗剂可以在同一药物组合物中一起提供，或以分开的形式例如以试剂盒的形式提供，用于同时、分开或顺序地在治疗中使用。在一个实施例中，所述疗法是治疗由关节损伤或关节炎引起的关节损害。

任选地，所述药物组合物可以包含如上所述的药学上可接受的载体。对于约50-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以处于单位剂量为约1-1000mg一种或多种活性成分，或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg，或约1-50mg的活性成分。化合物、药物组合物、或其组合的治疗有效剂量取决于受试者的物种、体重、年龄和所治疗的个体病症、障碍或疾病或其严重程度。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制障碍或疾病进展所必需的每种活性成分的有效量。

使用有利的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)或其分离的器官、组织和制品在体外和体内测试中证明上述剂量特性。本发明化合物可以以溶液(例如水溶液)的形式体外应用，和例如以混悬剂或以水溶液的形式肠内、肠胃外(有利地，静脉内)体内应用。

在一个实施例中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含两种或更多种分开的药物组合物，其中至少一种药物组合物含有具有式(1)或其子式的化合物。在一个实施例中，所述试剂盒包含用于分别保留所述组合物的装置(例如容器、分开的瓶子、或分开的箔包)。这种试剂盒的实例是泡罩包装，如典型地用于片剂、胶囊及类似物的包装。

本发明的试剂盒可以用于施用不同剂型(例如，口服和肠胃外)，用于以不同剂量间隔施用单独组合物或用于相对在彼此滴定单独组合物。为了有助于依从性，本发明的试剂盒典型地包含用于施用的用法说明书。

在本发明的组合疗法中，本发明的化合物和其他治疗剂可以由相同或不同的制造商制造和/或配制。此外，可以以下述方式将本发明化合物和其他治疗剂一起形成组合疗法：(i)在将组合产品发放给医师之前(例如在包含本发明化合物和其他治疗剂的试剂盒的情况下)进行；(ii)在施用前不久，由医师自己(或在医师的指导下)进行；(iii)由患者自己、例如在依次施用本发明的化合物和其他治疗剂期间进行。

实例

温度以摄氏度给出。终产物、中间体和起始物质的结构通过标准分析方法(例如，微量分析和光谱特征(例如，MS、IR、NMR))确认。使用的缩写是本领域常规的缩写。

用于合成本发明的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购获得的或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产(Houben-Weyl第4版1952,Methods of Organic Synthesis[有机合成方法],Thieme[蒂梅出版社],第21卷)。除非另有说明，起始材料通常可从商业来源获得，例如但不限于TCI精细化学品公司(TCI Fine Chemicals)(日本)、奥罗拉精细化学品公司(Aurora FineChemicals LLC)(圣地亚哥，加利福尼亚州)、FCH集团(FCH Group)(乌克兰)、奥德里奇化学公司(Aldrich Chemicals Co.)(密尔沃基，威斯康星州)、阿克洛斯有机公司(AcrosOrganics)(费尔劳恩，新泽西州)、美桥化工有限公司(Maybridge Chemical Company,Ltd.)(康沃尔，英格兰)、美奇丝科学公司(Matrix Scientific)(美国)、安娜敏公司(Enamine Ltd)(乌克兰)、Combi-Blocks公司(Combi-Blocks,Inc.)(圣地亚哥，美国)、奥克伍德公司(Oakwood Products,Inc.)(美国)、阿波罗科学公司(Apollo Scientific Ltd.)(英国)。

以下实例仅是说明本发明并且不限制另外要求保护的本发明的范围。此外，本发明的化合物可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产，如以下实例所示。在需要时，可以根据标准实践，使用常规保护基来保护反应性官能团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts,“Protective Groups in Organic Chemistry[有机化学中的保护基]”,John Wiley and Sons[约翰·威利父子公司],1991。

如本文所用的缩写定义如下：“1x”表示一次，“2x”表示两次，“3x”表示三次，“℃”表示摄氏度，“aq”表示水性，“FCC”表示快速柱色谱法，“eq”表示当量(equivalent或equivalents)，“g”表示克(gram或grams)，“mg”表示毫克(milligram或milligrams)，“L”表示升(liter或liters)，“mL”表示毫升(milliliter或milliliters)，“μL”表示微升(microliter或microliters)，“N”表示正常，“M”表示摩尔，“nM”表示纳摩尔，“mol”表示摩尔(mole或moles)，“mmol”表示毫摩尔(millimole或millimoles)，“min”表示分钟(minute或minutes)，“h”或“hrs”表示小时(hour或hours)，“RT”表示室温，“ON”表示过夜，“atm”表示大气压，“psi”表示每平方英寸磅数，“conc.”表示浓度，“sat”或“sat'd”表示饱和的，“MW”表示分子量，“mw”或“μwave”表示微波，“mp”表示熔点，“Wt”表示重量，“MS”或“MassSpec”表示质谱分析法，“ESI”表示电喷雾电离质谱，“HR”表示高分辨率，“HRMS”表示高分辨质谱法，“LCMS”或“LC-MS”表示液相色谱质谱，“HPLC”表示高压液相色谱，“RP HPLC”表示反相HPLC，“TLC”或“tlc”表示薄层色谱，“NMR”表示核磁共振光谱，“nOe”表示核欧沃豪斯效应谱，“

本文使用的以下缩写具有对应的含义：

Δ 加热

AcOH 乙酸

AgNO

app 明显的

ATP 5'-三磷酸腺苷

BINAP 外消旋2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘

BOC 叔丁基羧基

BSA 牛血清白蛋白

CDCl

CO

dd 双二重峰

DCM 二氯甲烷

DMEM 杜尔贝科改良伊格尔培养基

DMSO 二甲亚砜

EDTA 乙二胺四乙酸

ESI 电喷雾电离

EtOAc 乙酸乙酯

EtOH 乙醇

FBS 胎牛血清

K

LiHMDS 双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂

Me

MeOH 甲醇

MgSO

MHz 兆赫

m/z 质荷比

NaHCO

Na

NBS N-溴代琥珀酰亚胺

NH

PBS 磷酸盐缓冲盐水

PE 石油醚

ppm 百万分率

rac 外消旋的

Rt 保留时间

SFC 超临界流体色谱法

TBAF 四丁基氟化铵

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

Tris·HCl 氨基三(羟基甲基)甲烷盐酸盐

UV 紫外线

已经使用本文披露的方法制备、分离和表征了以下实例。下列实例说明了本披露的部分范围，并不意味着限制本披露的范围。

除非另有说明，起始材料通常可从非排他性商业来源获得，例如但不限于TCI精细化学品公司(TCI Fine Chemicals)(日本)、奥罗拉精细化学品公司(Aurora FineChemicals LLC)(圣地亚哥，加利福尼亚州)、FCH集团(FCH Group)(乌克兰)、奥德里奇化学公司(Aldrich Chemicals Co.)(密尔沃基，威斯康星州)、阿克洛斯有机公司(AcrosOrganics)(费尔劳恩，新泽西州)、美桥化工有限公司(Maybridge Chemical Company,Ltd.)(康沃尔，英格兰)、美奇丝科学公司(Matrix Scientific)(美国)、安娜敏公司(Enamine Ltd)(乌克兰)、Combi-Blocks公司(Combi-Blocks,Inc.)(圣地亚哥，美国)、奥克伍德公司(Oakwood Products,Inc.)(美国)、阿波罗科学公司(Apollo Scientific Ltd.)(英国)。

在使用ChemStation软件的Agilent系统上和Waters Acquity UPLC仪器上进行分析型LC/MS。Agilent系统由以下组成：

·Agilent G1312二元泵

·Agilent G1367孔板自动进样器

·Agilent G1316恒温柱温箱

·Agilent G1315二极管阵列检测器

·Agilent 6140/6150质谱仪

·SOFTA蒸发光散射检测器

典型的方法条件如下：

·流速：0.9mL/min

·柱：1.8μm 2.1x50 mm Waters Acquity HSS T3 C18柱

·流动相A：水+0.05％TFA

·流动相B：乙腈+0.035％TFA

·运行时间：2.25分钟

·方法A：系统在1.35分钟内运行从10％B到90％B的梯度。所述梯度后，在100％B下进行0.6分钟的洗涤。所述方法的剩余持续时间将系统恢复到初始条件。除非另有说明，否则提供的实例使用方法A进行表征。

所述系统Waters系统由以下组成：

·带有脱气器的Acquity二元梯度管理器

·Acquity FTN样品管理器

·设定为50℃的Acquity柱管理器

·Acquity光二极管阵列检测器(PDA)

·Acquity蒸发光散射检测器(ELSD)

·Acquity QDa质谱仪

典型的方法条件如下：

·流速：1.0mL/min

·柱：1.8μm 2.1x30 mm Waters Acquity HSS T3 C18

·流动相A：水+0.1％甲酸

·流动相B：乙腈+0.1％甲酸

·运行时间：2.5分钟

·方法B：系统在1.9分钟内运行从5％B到100％B的梯度。所述梯度后，在100％B下进行0.4分钟的洗涤。所述方法的剩余持续时间将系统恢复到初始条件。

·方法C：系统在0.7分钟内运行从5％B到100％B的梯度。所述梯度后，在100％B下进行0.3分钟的洗涤。所述方法的剩余持续时间将系统恢复到初始条件。

除非另有说明，否则质子光谱是在带有5mm QNP低温探头的Bruker AVANCE II400MHz或带有5mm QNP探头的Bruker AVANCE III 500MHz上记录的。化学位移以相对于二甲亚砜(δ2.50)、氯仿(δ7.26)、甲醇(δ3.34)、二氯甲烷(δ5.32)、丙酮(δ2.05)或乙腈(δ1.94)的ppm报告。将少量干燥样品(2-5mg)溶于适当的氘代溶剂(0.6mL)中。

ISCO快速色谱是在装有预填的二氧化硅

SFC手性筛选在与Waters ZQ质谱仪连接的Thar仪器制备型观察仪(TharInstruments Prep Investigator)系统上进行。Thar制备型观察仪系统由以下组成：

·Leap HTC PAL自动进样器

·Thar流体递送模块(0至10mL/min)

·Thar SFC 10位柱箱

·Waters 2996PDA

·Jasco CD-2095手性检测器

·Thar自动背压调节器

所有的Thar组件都是SuperPure Discovery系列产品线的一部分。所述系统以2mL/min(对于WhelkO-1柱，为4mL/min)流动，并保持在30摄氏度。系统背压设置为125巴。通过具有十一个3μm柱的组对每个样品进行筛选：

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak AD

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak OD

·3μm 4.6x50 mm Chiralcel OJ

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak IA

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak IB

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak IC

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak IF

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak IG

·3μm 4.6x250 mm Whelk O-1

·3μm 4.6x50 mm ChiralPak AS

·3μm 4.6x50 mm Lux-Cellulose-2

所述系统在5分钟内运行从5％助溶剂到50％助溶剂的梯度，然后在50％助溶剂下保持0.5分钟，切换回5％助溶剂并在初始条件下保持0.25分钟。在每个梯度之间有4分钟的平衡方法，使5％助溶剂流过下一个有待筛选的柱。筛选的典型溶剂为MeOH、MeOH+20mMNH

一旦使用这些梯度方法之一检测到分离，就可以开发出等度方法，并在必要时扩大规模，以在Thar Prep80系统上进行纯化。

步骤A：向丙炔酸甲酯(1a，200g，2.38mol，198mL)在丙酮(2.50L)中的搅拌溶液中添加AgNO

在0℃下，通过使氮气穿过反应容器2min来使3-溴丙炔酸甲酯(200g，1.23mol)和呋喃(419g，6.15mol，445mL)在甲苯(2.50L)中的溶液脱气，然后将反应混合物温热至90℃保持72小时以给出黑色溶液。将反应混合物浓缩，并将残余物通过快速柱色谱法(2％-5％EtOAc/PE)纯化，以给出甲基3-溴-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2,5-二烯-2-甲酸酯。分别纯化四批料并合并以得到呈黄色油状物的甲基3-溴-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2,5-二烯-2-甲酸酯(1b)。

步骤B：将甲基3-溴-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2,5-二烯-2-甲酸酯(1b，130g，563mmol，1.00eq)在THF(800mL)中的溶液用BH

步骤C：在-78℃，将中间体1c(29.8g，120mmol)和三乙胺(50.1ml，359mmol)在无水THF(265ml)中的溶液用叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸(33.0ml，144mmol)逐滴处理。将反应混合物在该温度搅拌20min，然后允许反应混合物缓慢温热至室温并且搅拌1h。将反应混合物用Et

实例

使用方案1中的步骤D-F，从甲基(1R,4S,5S)-3-溴-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-甲酸酯(中间体1d)制备标题化合物。

步骤D：将甲基(1R,4S,5S)-3-溴-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-甲酸酯(1d，4g，11.0mmol)、(2-氟吡啶-4-基)硼酸(1.71g，12.1mmol)、Na

步骤E：将三甲基碘化亚砜(1390mg，6.31mmol)在DMSO(21mL)中的溶液用NaH(252mg，6.31mmol)处理并且在室温搅拌30min。逐滴添加在DMSO(21mL)中的甲基(1R,4R,5S)-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3-(2-氟吡啶-4-基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-甲酸酯(798mg，2.10mmol)并且将所得混合物在50℃温热5min。将反应混合物用EtOAc稀释，用水(3x)和盐水洗涤，干燥(Na

步骤F：在RT，将甲基(1R,2R,4S,5R,6S)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-(2-氟吡啶-4-基)-8-氧杂三环[3.2.1.02,4]辛烷-2-甲酸酯(15mg，0.038mmol)和4-(三氟甲基)吡啶-2-胺(6.8mg，0.042mmol)在THF(0.4mL)中的溶液用在THF中的1M LiHMDS(76μl，0.076mmol)处理并且在RT搅拌14h。添加在THF中的1M TBAF(95μl，0.095mmol)并且将反应在60℃温热2h。将反应混合物冷却至RT并且加载到柱上并且直接通过FCC(0-100％EtOAc/庚烷)纯化，以得到外消旋-(1R,2R,4S,5R,6S)-4-(2-氟吡啶-4-基)-6-羟基-N-(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)-8-氧杂三环[3.2.1.02,4]辛烷-2-甲酰胺。LC-MS：Rt＝1.29min；MS m/z[M+H]

根据实例1所述的方案，使用甲基(1R,4S,5S)-3-溴-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-甲酸酯(中间体1d)和步骤D中的各种硼酸/酯以及步骤F中的各种苯胺，合成下文描述的实例2-82。

LC-MS：Rt＝1.42min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.48min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.46min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.42min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.51min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.38min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.52min；MS m/z[M+H]

方法C：LC-MS：Rt＝0.56min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.35min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.43min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.44min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.37min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.34min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.41min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.44min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.34min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.45min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.49min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.90min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.14min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.05min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.15min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.00min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.16min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.04min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.97min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.06min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.13min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.98min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.97min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.00min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.01min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.00min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.09min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.09min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.24min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.02min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.95min；MS m/z[M+H]

使用以下条件通过SFC手性分离外消旋-(1R,2R,4S,5R,6S)-N-(2-氰基-5-(三氟甲基)苯基)-6-羟基-4-(2-甲氧基吡啶-4-基)-8-氧杂三环[3.2.1.02,4]辛烷-2-甲酰胺得到下文所列出的化合物。

柱：21x250mm Chiralpak IG@35℃

流动相：85％CO

检测：UV@214nm

流速：80mL/min

峰1：SFC保留时间＝1.20min。方法B：LC-MS：Rt＝1.11min；MS m/z[M+H]

Peak 2:SFC保留时间＝1.89min。方法B：LC-MS：Rt＝1.11min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.59min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.55min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.51min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.47min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.58min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.56min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.64min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.53min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.65min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.50min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.49min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.56min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.57min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.52min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.49min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.52min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.57min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.51min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.59min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.62min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.48min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.54min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.57min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.66min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.52min；MS m/z[M+H]

LC-MS：Rt＝1.56min；MS m/z[M+H]

方法C：LC-MS：Rt＝0.61min；MS m/z[M+H]

方法C：LC-MS：Rt＝0.66min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.13min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.01min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.16min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.19min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.04min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.12min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.18min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.12min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.98min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.05min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝0.94min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.26min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.15min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.27min；MS m/z[M+H]

方法B：LC-MS：Rt＝1.24min；MS m/z[M+H]

在碱性磷酸酶(ALP)活性测定中评估了本发明的化合物，以确定所述化合物预防正常人关节软骨细胞(NHAC)中软骨细胞肥大的能力。表1中列出了所使用的试剂。

正常人关节软骨细胞(NHAC)购自PromoCell公司(海德堡，德国)，并使其在软骨细胞生长培养基(CGM；龙沙公司(Lonza)，沃克斯维尔，马里兰州)中生长。

在来自龙沙公司(Lonza)的软骨细胞生长培养基(CGM)中扩增NHAC，直至其达到60％-80％汇合。为了引发分化，将7,500个细胞以每孔指定的测试化合物剂量铺板在具有DMEM(SH30022-HyClone公司)的384孔Cell Carrier Ultra板(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中，所述DMEM含有10％FBS(35-015-CV-康宁公司(Corning))、1％Pen/Strep抗生素(SV30010-HyClone公司)和1％Normocin(50mg/mL-InvivoGen公司)。将细胞与测试化合物在37℃、5％CO2下一起孵育5小时，然后以最终浓度10ng/mL添加人IL-1β(AF-200-1B-派普泰克公司(Peprotech))至每个孔中，并且在37℃、5％CO2下孵育12天。

为了检测肥大细胞的存在，将NHAC用4％多聚甲醛和Hoechst 33342(英杰公司(Invitrogen))染料固定30分钟，在PBS中漂洗，然后用具有萘酚AS-MX磷酸盐碱性溶液(0.25％，855-西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))的固蓝RR盐(F0500-西格玛公司)染色。在37℃大约3小时后，一旦观察到细胞变蓝，将其用PBS洗涤三次。

将染色通过荧光显微术、使用561nm波长进行成像，和/或通过使用ImageXpressConfocal(美谷分子仪器公司(Molecular Devices)，森尼维耳市，加利福尼亚州)的高含量成像进行定量。使用定制的多波长细胞评分应用程序进行数据分析。表2总结了本发明的化合物在ALP测定中的活性。

应理解，本文描述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利、和专利申请都通过引用特此并入。