一种丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的检测方法

技术领域

本发明属于药物质量控制领域，具体涉及一种丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的检测方法。

背景技术

癫痫是常见病，多发病。这种疾病可以追溯上千年的历史，它的流行病学也较为复杂，任何人或者任何年龄都可能罹患癫痫，全球大约有5千万癫痫患者，但这种疾病的机制至今依然是个谜，有关于癫痫的流行病学调查研究表明，癫痫的早期诊疗是影响预后的关键。癫痫患者经过正规、合理的癫痫药物治疗，有70％左右的患者癫痫发作得到控制。因此癫痫用药的研究与开发显得尤为重要，在众多治疗癫痫的药物中，丙戊酸钠注射液在抗癫痫药市场上占据主导地位。

丙戊酸钠注射液的有效成分丙戊酸于1881年首次被合成，于1962年被发现有良好的抗癫痫作用，1964年，George Carraz及其同事发表了首篇关于丙戊酸钠治疗癫的临床研究。至20世纪70年代初，丙戊酸用于治疗失神发作、肌阵挛发作和强直-阵挛发作(特别是特发性全面性癫)的疗效得到肯定，其药代动力学机制也研究得十分清楚，从而推荐作为一线抗癫药物。现今，丙戊酸钠注射液在临床上已经成为必不可少的药物，其质量的控制至关重要，而EDTA-2Na(依地酸二钠)，是国家药品监管局公布的丙戊酸钠注射液参比制剂说明书中明确标明的药物辅料，因此注射液中EDTA-2Na的含量，也应作为质量控制的一部分。

目前关于丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na含量的检测方法没有相关专利，文献也十分匮乏，现行的中国药典中对丙戊酸钠注射液未有收载，其他各主流国家的药典中，仅美国药典收录了丙戊酸钠注射液，但未涉及对EDTA-2Na的检验，这一部分的空白导致多数研究者对该药物的研究不够充分，给临床用药带来隐患，为了严格控制该药品的质量，有必要对丙戊酸钠注射液中的EDTA-2Na含量进行检测。

针对药物中EDTA-2Na含量检测，目前常用的是高效液相色谱法。专利“CN110118842A测定硫酸特布他林雾化液中EDTA-2Na含量的方法”公开了硫酸特布他林雾化液中EDTA-2Na含量的方法，包括直接向样品中加入络合剂后进行液相色谱的测试。文献“HPLC法测定维生素C注射液中EDTA-2Na的含量，中国药师，2013年第16卷第10期”公开了一种测定维生素C注射液中的EDTA-2Na含量的方法，其将维生素C中加入络合剂后直接注入高效液相色谱仪，并采用合适的色谱条件进行测试。

现有技术的检验方法均需要使用金属络合剂，丙戊酸钠注射液中的原料丙戊酸钠与金属络合剂发生反应，影响EDTA-2Na的检测。因此，采用上述现有技术中已公开的样品前处理条件和色谱条件，测试得到的色谱图中峰的分离度和峰形均不够理想，且测试的重复性差，多次重复测试得到的结果不稳定，无法完成丙戊酸钠中EDTA-2Na含量的准确测定。

发明内容

针对上述现有技术中丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na含量测定的困难，本发明提供一种丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的检测方法，其目的在于：建立一种能够得到分离度和峰形均较好的色谱峰，且检测结果重复性好，测试结果稳定，从而实现丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na含量准确检测的方法。

一种丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的检测方法，包括如下步骤：(1)将丙戊酸钠注射液加酸酸化，加入金属离子络合剂进行络合，过滤、取续滤液，即得供试品溶液；(2)以0.01mol/L～0.10mol/L乙酸铵缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，将供试品溶液进行高效液相色谱检测，测定EDTA-2Na的含量。

优选地，步骤(1)中，酸化后、络合前溶液的pH为2.0～4.0。

优选地，步骤(1)中，丙戊酸钠注射液的浓度为50mg/mL～200mg/mL。

优选地，步骤(1)中，酸为浓度为4.0％～6.0％(V/V)的稀硫酸。

优选地，步骤(1)中，酸与丙戊酸钠注射液的体积比为(0.2～1)：1。

优选地，步骤(1)中，金属离子络合剂为硫酸铁溶液或硫酸铜溶液；金属离子络合剂的浓度为0.01mol/L～0.15mol/L；丙戊酸钠注射液与金属离子络合剂的体积比为(1～8)：1。

优选地，步骤(1)中，加入金属离子络合剂后，静置10min～30min后再进行过滤；过滤时弃去初滤液，初滤液为溶液体积总量的5％～25％。

优选地，步骤(2)中，调节流动相A的pH至2.3～3.5；和/或，色谱柱以酰胺基键合硅胶为填充剂；和/或，检测波长为255nm～265nm；和/或，柱温为20℃～40℃；和/或，流速为每分钟0.8mL～1.5mL。

优选地，步骤(2)中，调节流动相A的pH至2.3～3.0；色谱柱以酰胺基键合硅胶为填充剂；检测波长为258nm～262nm；柱温为25℃～35℃；流速为每分钟0.9mL～1.1mL。

优选地，步骤(2)中，洗脱程序如表1所示。

表1洗脱程序

本发明提供了一种丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的检测方法，具有准确性高、耐用性好、稳定性好和重复性好的优点，填补了丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na检验的技术空白。通过对EDTA-2Na的定量，实现了对丙戊酸钠注射液的质量控制，对丙戊酸钠的临床安全用药具有重要意义。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图；

图2为实施例2中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图；

图3为实施例3中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图；

图4为对比例1中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图；

图5为对比例2中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图；

图6为对比例3中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图；

图7为对比例4中对照品溶液连续进样5针所得色谱曲线的叠加图。

具体实施方式

实施例1

本实施例检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液：称取依地酸二钠对照品43.32mg(南京化学试剂股份有限公司，纯度为90.2％，下同)，精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品贮备液。取丙戊酸钠原料药(旭富制药科技有限公司)205.43mg置20mL量瓶中，加入1mL对照品储备液，加入浓度为6.0％(V/V)的稀硫酸0.9mL酸化后，加入0.15mol/L的硫酸铜溶液0.3mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置30min后，过滤，弃去初滤液5mL，取续滤液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取1mL浓度为200mg/mL的丙戊酸钠注射液(海南倍特药业有限公司)置于20mL容量瓶，加入浓度为6.0％(V/V)的稀硫酸0.9mL酸化后，加入0.15mol/L的硫酸铜溶液0.3mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置30min后，过滤，弃去初滤液5mL，取续滤液，作为供试品溶液。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图1。

色谱条件为：以0.01mol/L乙酸铵缓冲液(用冰乙酸调节pH至2.3)为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱程序如表2，使用酰胺基键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长260nm，柱温25℃，流速为每分钟1.1mL。

表2实施例1中洗脱程序

实施例2

本实施例检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液：称取依地酸二钠对照品21.66mg精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品贮备液。取丙戊酸钠原料药205.43mg置20mL量瓶中，加入2mL对照品储备液，加入浓度为5.4％(V/V)的稀硫酸1mL酸化后，加入0.08mol/L的硫酸铁溶液0.36mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置28min后，过滤，弃去初滤液4mL，取续滤液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取2mL浓度为100mg/mL的丙戊酸钠注射液置于20mL容量瓶，加入浓度为5.4％(V/V)的稀硫酸1mL酸化后，加入0.08mol/L的硫酸铁溶液0.36mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置28min后，过滤，弃去初滤液4mL，取续滤液，作为供试品溶液。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图2。

色谱条件为：以0.01mol/L乙酸铵缓冲液(用冰乙酸调节pH至3.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱程序如表2，使用酰胺基键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长260nm，柱温35℃，流速为每分钟0.9mL。

实施例3

本实施例检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液：称取依地酸二钠对照品10.83mg精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品贮备液。取丙戊酸钠原料药205.43mg置20mL量瓶中，加入4mL对照品储备液，加入浓度为4.0％(V/V)的稀硫酸1.4mL酸化后，加入0.04mol/L的硫酸铁溶液0.72mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置络合20min后，过滤，弃去初滤液2mL，取续滤液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取4mL浓度为50mg/mL的丙戊酸钠注射液置于20mL容量瓶，加入浓度为4.0％(V/V)的稀硫酸1.4mL酸化后，加入0.04mol/L的硫酸铁溶液0.72mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置络合20min后，过滤，弃去初滤液2mL，取续滤液，作为供试品溶液。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图3。

色谱条件为：以0.01mol/L乙酸铵缓冲液(用冰乙酸调节pH至3.0)为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱程序如表2，使用酰胺基键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长260nm，柱温30℃，流速为每分钟1.0mL。

实施例4

在实施例1的基础上，改变单一的色谱条件进行测试，测试条件和测试结果如表3所示。结果表明各实验条件在一定范围内变化后，EDTA-2Na含量的RSD均小于2.0％，表明本发明提供的丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法耐用性好。

表3色谱条件耐用性实验数据

对比例1

本对比例不加入酸进行酸化，检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液：称取依地酸二钠对照品21.66mg精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品贮备液。取丙戊酸钠原料药205.43mg置20mL量瓶中，加入2mL对照品储备液，再加入0.08mol/L的硫酸铁溶液0.36mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置28min后，过滤，弃去初滤液4mL，取续滤液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取2mL浓度为100mg/mL的丙戊酸钠注射液置于20mL容量瓶，加入0.08mol/L的硫酸铁溶液0.36mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置28min后，过滤，弃去初滤液4mL，取续滤液，作为供试品溶液。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图4。

本对比例色谱条件与实施例3相同。

对比例2

本对比例加入少量酸进行酸化，检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液：称取依地酸二钠对照品21.66mg精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品贮备液。取丙戊酸钠原料药205.43mg置20mL量瓶中，加入2mL对照品储备液，加入浓度为5.4％(V/V)的稀硫酸0.1mL酸化后，加入0.08mol/L的硫酸铁溶液0.36mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置28min后，过滤，弃去初滤液4mL，取续滤液，作为供试品溶液。

供试品溶液：取2mL浓度为100mg/mL的丙戊酸钠注射液置于20mL容量瓶，加入浓度为5.4％(V/V)的稀硫酸0.1mL酸化后，加入0.08mol/L的硫酸铁溶液0.36mL，混合均匀，加水稀释至刻度，静置28min后，过滤，弃去初滤液4mL，取续滤液，作为供试品溶液。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图5。

本对比例色谱条件与实施例3相同。

对比例3

本实施例检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液、供试品溶液均同实施例3。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图6。

本对比例中洗脱程序如表4所示，其余色谱条件同实施例3。

表4洗脱程序

对比例4

本实施例检测丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的方法如下：

1溶液配制

对照品溶液、供试品溶液均同实施例3。

2进样分析

进样量为10μl/针。对照品溶液连续进样5针，供试品溶液进样1针，按外标法以峰面积计算EDTA-2Na的含量。检测结果数据见表6，连续5针对照品溶液色谱曲线叠加图见图7。

本对比例中洗脱程序如表5所示，其余色谱条件同实施例3。

表5洗脱程序

实施例1～3和对比例1～4的测试结果数据如表6所示：

表6实施例与对比例实验数据表

注：表6中“/”表示无法计算，或不适用。具体地，对比例2和对比例4中，由于连续5针对照品溶液峰面积RSD超过2.0％，不具有分析供试品含量RSD价值；对比例3中，连续5针对照品溶液，其中一针未检测出主峰，未进行供试品进样。

结合表6和图1～7可以看出，实施例1～3得到的含量结果平行，理论塔板数高，拖尾因子小，峰面积稳定，连续5针对照品溶液峰面积RSD不超过2.0％，回收率在98％～102％之间，说明本专利的检测方法非常适用于丙戊酸钠注射液中的EDTA-2Na含量测定和对丙戊酸钠注射液的质量控制。

而对比例1～2及4所得到的检验数据不平行，含量结果不稳定，准确度差，连续5针对照品溶液峰面积的RSD均大于2.0％，不符合标准，无法准确定量丙戊酸钠注射液中的EDTA-2Na。另外，对比例3中峰形差，并且其中一针对照品溶液未检测出主峰，该方法不可用。由此可见，对比例1～4中提供的检测方法不适用于丙戊酸钠注射液中的EDTA-2Na含量测定和对丙戊酸钠注射液的质量控制。

综上所述，通过实施例和对比例的结果可以看到，本发明提供了一种准确性高，耐用性好、稳定性好以及重复性好的丙戊酸钠注射液中EDTA-2Na的检测方法，对丙戊酸钠注射液中的EDTA-2Na含量测定以及丙戊酸钠注射液的质量控制具有重要意义。