由柠苹酸盐、柠康酸盐或2-氧代丁酸盐生产L-2-氨基丁酸盐

发明领域

本发明涉及利用基因工程菌株通过无细胞体系和生物转化的方法制备关键药物中间体L-2-氨基丁酸(L-2-ABA)及其成本有效的应用。

背景技术

L-2-ABA是一种非天然的4C脂族氨基酸，也称为L-高丙氨酸，并且是合成重要药物即抗癫痫药左乙拉西坦(levetiracetam)、布瓦西坦(brivaracetam)和抗结核药乙胺丁醇(ethambutol)的关键手性中间体。通过化学方法生产L-2-ABA；然而，这样的方法导致不期望的外消旋混合物。还通过葡萄糖的发酵生产L-2-ABA；但是这样的方法会导致5g/l的低生产率水平。

EP2539444公开了在添加了10g/L 2-酮丁酸盐的M9培养基中接种野生型大肠杆菌(E.coli)BW25113培养物，并在37℃下孵育24小时。24小时后，HPLC分析显示仅生产了182mg/L L-高丙氨酸。克隆了支链氨基酸氨基转移酶IlvE，并在BW25113中过表达，这使L-高丙氨酸的产量提高到1.2g/L。另外进料10g/L的氨基供体谷氨酸盐进一步将L-高丙氨酸滴度提高至3.2g/L。实验证明，转氨酶如IlvE可以将2-酮丁酸盐胺化为L-高丙氨酸。然而，由于转氨作用是可逆的反应过程，因此需要高浓度的谷氨酸盐来驱动反应平衡。即使在这样的极端条件下，将2-酮丁酸盐转氨为L-高丙氨酸的转化率也仅为32％。

CN109777788公开了用于表达亮氨酸脱氢酶的酶活性的一种亮氨酸脱氢酶突变体和重组细菌大肠杆菌BL21-pET28a-BtLDH007。大肠杆菌BL21-pET28a-BtLDH007用于转化2-酮丁酸盐，产生L-2-氨基丁酸。在1L转化体系中，将0.015-0.02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 8.0)溶解于2-酮丁酸80g/L，加入湿细胞群20g/L、甲酸铵浓度10g/L、NAD

CN107012178公开了借助于丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化2-酮丁酸以生产L-2-氨基丁酸。

EP0983372公开了一种制备L-2-氨基丁酸盐的方法，该方法包括：a)使L-苏氨酸与苏氨酸脱氨酶在适于产生2-酮丁酸盐的条件下反应；b)使2-酮丁酸盐、L-天冬氨酸盐和转氨酶在适于产生草酰乙酸盐和L-2-氨基丁酸盐的条件下反应；c)允许草酰乙酸盐形成丙酮酸盐；d)使丙酮酸盐与乙酰乳酸合酶在适于产生乙酰乳酸的条件下反应；e)允许乙酰乳酸形成乙偶姻；和f)分别回收乙偶姻和L-2-氨基丁酸盐。

CN105331650公开了一种通过级联甘油脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌共同生产α-氨基丁酸和二羟基丙酮的方法。该方法的特征在于，通过甘油脱氢酶基因和L-氨基酸脱氢酶基因建立重组共表达载体，并将其转化为基因工程大肠杆菌；同时，明确建立了表达L-苏氨酸脱氨酶的重组大肠杆菌；有效共表达的甘油脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶可促进大肠杆菌中辅因子的循环，不需要添加任何外源性辅因子，可以使用辅因子循环再生系统通过便宜的底物即L-苏氨酸脱氨酶和甘油来共生产高附加值的α-氨基丁酸和二羟基丙酮。在5L发酵罐中，α-氨基丁酸的产量达到41.2g/L。

注释：该专利提出利用甘油脱氢酶来循环辅因子NADH。由于必须添加另一种底物以使甘油脱氢酶循环辅因子，因此该方法的成本效率很低。

CN102517351、CN102212567B和CN109679978公开了由苏氨酸生产L-2-氨基丁酸的方法。

本发明解决了现有技术中面临的问题，其中通过无细胞体系和生物转化方法通过使用不太贵的底物通过使用酶促或重组的基于细胞的生产方法来生产L-2-ABA。由较便宜的底物生产高价值的关键药物中间体L-2-ABA具有很大的经济价值。

即使已经使用底物的酶促转化生产了L-2-ABA，但该方法效率低下，并且使用了昂贵的并且不易大量获得的起始材料。

因此，仍然需要一种有效的且成本不太昂贵的方法以高产量生产L-2-ABA。

因此，本发明人提供了一种使用无细胞体系和全细胞生物转化的可行技术，该技术利用较便宜的底物通过高效酶催化的氧化还原平衡途径来生产L-2-ABA。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种以高产量生产L-2-ABA的高效且成本有效的方法。

本发明的另一个目的是提供一种使用不太昂贵的底物如柠康酸盐或柠苹酸盐生产L-2-ABA的方法。

本发明的另一个目的是提供一种通过在无细胞体系中进行酶促生物转化而使用不太昂贵的底物(例如柠苹酸盐或柠康酸盐)来生产L-2-ABA的方法。

本发明的又一个目的是提供一种使用有效的酶来生产L-2-ABA的方法。

本发明的又一个目的是使用遗传修饰的菌株通过生物转化来制备关键药物中间体L-2-ABA。

本发明的又一个目的是提供一种生产L-2-ABA的方法，该方法容易放大至大规模生产和工业生产。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种在无细胞体系中通过酶促生物转化由选自柠苹酸盐或柠康酸盐的底物以高产量生产L-2-ABA的方法。

在另一方面，本发明提供了使用酶的方法，所述酶即异丙基苹果酸异构酶、异丙基苹果酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶/转氨酶B。

在又一方面，本发明提供了通过无细胞体系以高产量生产L-2-ABA的方法；其中，该方法包括以下步骤：

a)转化微生物宿主细胞以掺入leu B、leu CD和valDH以表达酶LeuCD、LeuB和ValDH；

b)收获、裂解宿主细胞以获得粗裂解物；

c)任选地从粗裂解物中分离和纯化和/或固定所述酶；

d)在7至9的pH值下使用粗裂解物或纯化的酶或固定化酶转化选自柠苹酸盐或柠康酸盐的底物。

在另一方面，本发明提供了通过无细胞体系以高产量生产L-2-ABA的方法；其中，该方法包括以下步骤：

a)转化微生物宿主细胞以掺入leu B、leu CD和ilvE以表达酶LeuCD、LeuB和IlvE；

b)收获、裂解宿主细胞以获得粗裂解物；

c)任选地从粗裂解物中分离和纯化和/或固定所述酶；

d)在7至9的pH值下使用粗裂解物或纯化的酶或固定化酶转化选自柠苹酸盐或柠康酸盐的底物。

在另一方面，本发明提供了一种通过在合适的宿主中通过全细胞生物转化以高产量从底物生产L-2-ABA的方法，其中所述底物选自柠苹酸盐、柠康酸盐或2-氧代丁酸盐。

在另一方面，本发明提供了一种通过在合适的宿主中通过全细胞生物转化以高产量从底物生产L-2-ABA的方法，其中所述底物选自柠苹酸盐、柠康酸盐或2-氧代丁酸盐，其是透性化细胞。

在另一方面，本发明提供了一种生产L-2-ABA的方法，该方法涉及在全细胞或透性化细胞中进行生物转化，其中该方法包括以下步骤：

a)转化微生物宿主以掺入valDH或ilvE；

b)任选地掺入leu B或leu CD，

b)添加选自柠苹酸盐或柠康酸盐或2-氧代丁酸盐的底物；和

c)在20℃至37℃的温度下培养宿主以在合适的培养基中表达所述酶以获得L-2-ABA。

在另一方面，本发明提供了一种通过在合适的宿主中通过酶促生物转化在全细胞或透性化细胞中以高产量从底物生产L-2-ABA的方法，其中所述底物选自柠苹酸盐、柠康酸盐或2-氧代丁酸盐，所述方法可以包括敲除ilvD和ilvIH。

在另一方面，本发明提供了一种通过在合适的宿主中通过酶促生物转化在全细胞或透性化细胞中以高产量从底物生产L-2-ABA的方法，其中所述底物选自柠苹酸盐、柠康酸盐或2-氧代丁酸盐，所述方法可以包括敲除ackA、tdcD和pta。

附图简要说明：

为了更全面地理解本发明，现在结合附图进行以下描述，其中：

图1示出了与由苏氨酸(a)制备L-2-氨基丁酸相比，通过替代的异亮氨酸生物合成途径(b)制备L-2-氨基丁酸的一个示例性实施方案。

图2示出了用于制备L-2-氨基丁酸的无细胞酶促生物转化的一个示例性实施方案。

图3示出了用于制备L-2-氨基丁酸的全细胞生物转化的一个示例性实施方案。

发明详述：

将理解，本公开不限于所描述的特定体系和方法，因为可以存在本公开中未明确示出的本公开的多个可能的实施方案。还应理解，说明书中使用的术语仅出于描述特定版本或实施方案的目的，而无意限制本公开的范围。

本发明涉及酶促途径的构建，该酶促途径实施一系列反应，将较便宜的底物如柠苹酸盐或柠康酸盐转化为较昂贵的产物(L-2-ABA)，这进而将为该方法提供增值。

在本发明中，从底物例如柠苹酸盐或柠康酸盐生产L-2-ABA的方法涉及从各种来源分离基因即leu B、leu CD、valDH或ilvE；以及将所述基因转化到合适的宿主细胞中以表达这些相应的酶。用于生物转化的宿主可以包括细菌和真核来源，例如大肠杆菌、乳酸菌和梭状芽胞杆菌(Clostridium sp)以及各种酵母。

在本发明中，产生L-2-ABA的多步合成途径是替代的异亮氨酸途径。在这一途径中，柠苹酸盐(2-甲基苹果酸盐)是由丙酮酸盐和乙酰辅酶A通过柠苹酸合酶(CimA)缩合而形成的。柠苹酸盐转化为柠康酸盐(2-甲基马来酸盐)，然后被异丙基苹果酸异构酶(Leu CD复合物)转化为D-赤式3-甲基苹果酸盐，然后被异丙基苹果酸脱氢酶(Leu B)进一步氧化为2-OB(2-氧代-丁酸盐)，这需要NAD

选择链霉菌(Streptomyces sp.)的缬氨酸脱氢酶(ValDH)和大肠杆菌和梭状芽胞杆菌(Clostridium sp.)的支链氨基转移酶(IlvE)进行2-OB到L-2ABA的转化。

从柠苹酸盐或柠康酸盐到L-2-ABA的途径在热力学上是有利的。Leu B催化的反应需要将NAD

本申请发明人惊奇地发现，通过构建涉及基因leu CD、leu B、valDH/ilvE的合成途径，可以将底物转化为L-2-ABA，所述基因具有高效率，k

在一个实施方案中，本发明涉及一种在无细胞体系中利用异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB)、异丙基苹果酸异构酶(Leu CD复合物)、缬氨酸脱氢酶(ValDH)制备L-2-ABA的方法。它也可以利用支链氨基转移酶(IlvE)代替缬氨酸脱氢酶(ValDH)。所述酶为粗制形式和固定化形式之一，连同所需的辅因子和其他组分一起实现所需的转化。

将携带基因的重组质粒即：pColaDuet-1LeuCD、pETDuet-1LeuB、pETDuet-1ValDH分别转化到宿主细胞中。在复合培养基中培养细胞，并通过IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导酶表达。提供培养条件，以获得最大的酶可溶性表达。收获细胞并将其裂解以释放酶。粗裂解物或纯化的酶用于转化过程。培养、收获、裂解和分离酶的技术是本领域技术人员已知的。

在所述实施方案中，生产L-2-ABA的方法包括以下步骤：

a)转化微生物宿主细胞以掺入leu B、leu CD、valDH和ilvE以表达酶LeuCD、LeuB和ValDH；

b)收获、裂解宿主细胞以获得粗裂解物；

c)任选地从粗裂解物中分离和纯化所述酶；

d)在7至9的pH下，使用粗裂解物或纯化的酶转化选自柠苹酸盐或柠康酸盐的底物。

它也可以利用支链氨基转移酶(IlvE)代替缬氨酸脱氢酶(ValDH)。在达到最大比活性的条件下，酶在重组表达宿主中过量产生。

还可以使用固定化酶来代替纯化的酶用于使用常规技能和技术转化底物。

底物的转化是在一体系中进行的，该体系包括有效转化所需的所有辅因子和组分。这样的辅因子和组分选自MnCl

使用粗制酶、纯化的酶或固定化酶的方法在12-18小时内产生至少80g/L或至少100g/L。

异丙基苹果酸异构酶可以从詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、大肠杆菌、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)获得。异丙基苹果酸脱氢酶已从詹氏甲烷球菌、嗜热菌(Thermophilus sp.)、大肠杆菌、氧化亚铁硫杆菌(Acidothiobacillusferroxidans)、硫化叶菌(sulfolobus sp.)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中筛选出来。氨基酸脱氢酶可以是从链霉菌、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、金霉素北里孢菌(Kitasatospora aureofaciens)中筛选出的缬氨酸脱氢酶或从芽孢杆菌(Bacillus sp.)中筛选出的亮氨酸脱氢酶。

在另一个实施方案中，可以通过携带用于表达该途径的三种酶即LeuCD、LeuB、ValDH的基因的细胞通过全细胞生物转化从柠苹酸盐或柠康酸盐生产L-2-ABA。这里使用的宿主细胞是大肠杆菌。将基因转化到宿主细胞中作为pCOlaDuet-1 BCD ValDH或pETDuet-1CD、pCOlaDuet-1LeuB ValDH。将柠苹酸盐或柠康酸盐添加到在含有辅因子和组分的合适培养基中生长的重组细胞中。培养基可以包含葡萄糖、KH

在另一个实施方案中，生产L-2-ABA的方法涉及在全细胞或透性化细胞中的生物转化。它包括以下步骤：

a)转化微生物宿主以掺入valDH或ilvE；

b)任选地掺入leu B或leu CD，

b)添加选自柠苹酸盐、柠康酸盐或2-氧代丁酸盐的底物；和

c)在20℃–37℃的温度下培养宿主以在合适的培养基中表达所述酶，以便获得L-2-ABA。

用于生物转化的宿主可以包含细菌和真核来源，例如大肠杆菌、乳酸菌和梭状芽胞杆菌以及各种酵母。

可以转化宿主以表达所有三种酶，即LeuCD、LeuB、ValDH。在替代实施方案中，可以掺入ilve以表达Ilve而不是valDH。

在一些实施方案中，宿主细胞可以含有LeuCD或LeuB作为天然酶。在这样的实施方案中，底物可以是2-氧代丁酸盐或柠苹酸盐或柠康酸盐。

异丙基苹果酸异构酶可以从詹氏甲烷球菌、大肠杆菌、粗糙脉孢菌获得。异丙基苹果酸脱氢酶已从詹氏甲烷球菌、嗜热菌、大肠杆菌、氧化亚铁硫杆菌、硫化叶菌、枯草芽孢杆菌中筛选出来。氨基酸脱氢酶可以是从链霉菌、粪产碱杆菌、金霉素北里孢菌中筛选出的缬氨酸脱氢酶或从芽孢杆菌中筛选出的亮氨酸脱氢酶。

本申请发明人还发现，应当阻断通向副产物异亮氨酸的途径，以使2-OB可用于L-2-ABA的形成，从而有利于以更高的产量生产L-2-ABA。因此，期望使用具有无功能性异亮氨酸途径的宿主，其中ilvD或ilvIH被敲除。或者期望使用AHAS复合物的抑制剂，例如缬氨酸、甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)、咪唑啉酮、三唑嘧啶类、嘧啶基氧代苯甲酸酯类、磺酰基氨基羰基三唑啉酮类。

为了进一步提高2-OB用于L-2-ABA形成的利用率，可以阻断通向丙酰CoA和丙酸的途径。因此，期望使用具有无功能性丙酰CoA和丙酸途径的宿主，其中乙酸激酶(ackA)、丙酸激酶(tdcD)、磷酸乙酰转移酶(pta)被敲除。

在全细胞或透性化细胞中生产L-2-ABA的方法导致生产20g/L或可以在15-20小时内生产至少40g/L。

现在将通过参考随附的实验来逐步描述通过构建含有来自各种来源的参与氨基酸生物合成的基因(即LeuB、Leu CD、ValDH)的合成途径从柠康酸盐生产L-2-ABA的完整生产方法，所述实验提供用于辅助对本发明示例性实施方案的全面理解。它包括该方法的各种特定细节以帮助理解，但是这些细节仅被认为是示例性的。假设本领域技术人员可以在其最宽的范围内利用以上描述。因此，优选的实施方案和实施例仅被认为是描述性的，而不是以任何方式限制本公开。

本申请发明人从Novogen获得了pETDuet-1和pCOLADuet-1载体。根据请求从IITMadras获得大肠杆菌菌株BL21DE3密码子加RP。

A.无细胞酶促生物转化实验

I.

实验1

设置无细胞酶促转化实验，以在酶LeuCD、LeuB和ValDH的催化下将10mM至2M柠康酸盐转化成10mM至2M L-2-ABA，所述酶作为粗细胞裂解物或者部分或完全纯化的酶使用。

将携带基因即pColaDuet-1LeuCD、pETDuet-1LeuB、pETDuet-1ValDH的重组质粒分别转化到大肠杆菌中。在复合培养基中培养细胞，并通过IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导酶表达。提供培养条件以获得最大的酶可溶性表达。收获细胞并裂解以释放酶。粗裂解物或纯化的酶用于转化过程。

在pH 7-pH 9的范围内进行柠苹酸盐向L-2-ABA的转化。将粗裂解物或纯化的酶添加到转化反应中，其中存在转化所需的其他组分。LeuCD将柠苹酸盐转化为D-赤型3-甲基苹果酸盐，然后通过LeuB将其转化为2-OB。通过LeuB酶进行的转化需要1至50mM的MnCl

实验2：

设置无细胞酶促转化实验，以在酶LeuCD、LeuB和IlvE的催化下将10mM至2M的柠康酸盐转化成10mM至2M的L-2-ABA，所述酶作为粗细胞裂解物或者部分或完全纯化的酶使用。

将携带基因即pColaDuet-1LeuCD、pETDuet-1LeuB、pETDuet-1IlvE的重组质粒分别转化到大肠杆菌或酵母中。在复合培养基中培养细胞并通过IPTG诱导酶表达。提供培养条件以使获得最大的酶可溶性表达。收获细胞并将其裂解以释放酶。粗裂解物或纯化的酶用于转化过程。

在pH 7-pH 9的范围内进行柠苹酸盐向L-2-ABA的转化。将粗裂解物或纯化的酶添加到转化反应中，其中存在转化所需的其他组分。LeuCD将柠苹酸盐转化为D-赤型3-甲基苹果酸盐，然后通过LeuB将其转化为2-OB。通过LeuB酶进行的转化需要1至50mM的MnCl

在25℃至37℃的温度下以10ml至5L规模的体积在生物反应器中进行转化。

B.通过使用重组细胞进行全细胞生物转化实验：

实验3：通过含有过表达的LeuB、LeuCD、ValDH的细胞进行柠康酸盐生物转化

可以通过携带用于表达该途径的三种酶即LeuCD、LeuB、ValDH的基因的细胞通过全细胞生物转化从柠苹酸盐或柠康酸盐生产L-2-ABA。这里使用的宿主细胞是大肠杆菌。将基因作为pCOlaDuet-1 BCD valDH或pETDuet-1 CD、pCOlaDuet-1 LeuB valDH转化到宿主细胞中。将量为1g至100g/L的柠苹酸盐或柠康酸盐添加到在确定成分培养基中生长的重组细胞中，所述确定成分培养基含有5–50g/L的葡萄糖、KH

实验4：含有过表达的LeuB、LeuCD、IlvE的细胞的柠康酸盐生物转化

可以通过携带用于表达该途径的三种酶即LeuCD、LeuB、ilvE的基因的细胞通过全细胞生物转化从柠苹酸盐或柠康酸盐来生产L-2-ABA。这里使用的宿主细胞是大肠杆菌。将基因作为pCOlaDuet-1 BCD IlvE或pETDuet-1 CD、pCOlaDuet-1 LeuBIlvE转化到宿主细胞中。将量为1g至100g/L的柠苹酸盐或柠康酸盐添加到在确定成分培养基中生长的重组细胞中，所述确定成分培养基含有5–50g/L的葡萄糖、KH

实验5：含有过表达的ValDH(天然LeuB和LeuCD)的细胞的柠康酸盐生物转化

可以通过携带valDH基因的细胞通过全细胞生物转化从柠苹酸盐或柠康酸盐生产L-2-ABA。通过宿主细胞中的天然酶LeuCD、LeuB进行底物向2-OB的转化。这里使用的宿主细胞是大肠杆菌。将该基因作为pCOlaDuet-1valDH或pETDuet-1valDH转化到宿主细胞中。将量为1g至100g/L的柠苹酸盐或柠康酸盐添加到在复合培养基(如葡萄糖酵母提取物)或确定成分培养基中生长的重组细胞中，所述确定成分培养基可以含有5-50g/L的葡萄糖、KH

实验6：含有天然/过表达的IlvE(天然LeuB和LeuCD)的细胞的柠康酸盐生物转化

可以通过含有天然LeuCD、LeuB和IlvE的宿主细胞对柠康酸盐或柠苹酸盐的全细胞生物转化来生产L-2-ABA(表2)。

还可以通过携带过表达的IlvE的细胞通过全细胞生物转化从柠康酸盐或柠康酸盐生产L-2-ABA。通过宿主中存在的天然酶LeuCD、LeuB进行底物向2-OB的转化。这里使用的宿主细胞是大肠杆菌。将该基因作为pCOlaDuet-1ilvE或pETDuet-1ilvE转化到宿主细胞中。将量为1g至100g/L的柠苹酸盐或柠康酸盐添加到在复合培养基(如葡萄糖酵母提取物)或确定成分培养基中生长的重组细胞中，所述确定成分培养基含有5-50g/L的葡萄糖、KH

实验7：含有过表达的ValDH(天然LeuB和LeuCD)的细胞的2-氧代丁酸盐生物转化

可以通过携带valDH基因的细胞通过全细胞生物转化从2-氧代丁酸盐来生产L-2-ABA。这里使用的宿主细胞是大肠杆菌。将基因作为pCOlaDuet-1valDH或pETDuet-1valDH转化到宿主细胞中。将量为1g至100g/L的2-氧代丁酸盐添加到在复合培养基(如葡萄糖酵母提取物)或确定成分培养基中生长的重组细胞，所述确定成分培养基含有5-50g/L的葡萄糖、KH

(表2)

表1：使用不同酶时L-2-ABA的产量

结果和讨论：

表1显示了在由LeuCD、LeuB、ValDH酶催化的无细胞体系中从柠康酸盐得到2-ABA的产量。在250mM柠康酸盐的情况下，转化率为99.6％。而在100mM和50mM柠康酸盐的情况下分别达到96％和86％

表2：利用宿主和克隆细胞进行的全细胞生物转化，通过提出的途径将各种底物转化为L-2-ABA的详细信息

表2显示在宿主细胞的天然酶即LeuCD、LeuB、IlvE催化的全细胞生物转化中从柠康酸盐得到2-ABA的产量。从24小时内被消耗的2.1g/L的柠康酸盐获得100mg/L的产物滴度。其余所消耗的柠康酸盐已被转移用于产生异亮氨酸和丙酸，可以通过在提出的敲除菌株(对异亮氨酸和丙酸产生途径酶的敲除)中进行相同的实验来减少异亮氨酸和丙酸的产生。

表2显示了在宿主中的天然ilvE和克隆中过表达的缬氨酸脱氢酶催化的全细胞生物转化中，从2-氧代丁酸盐得到2-ABA的产量。在24小时内在宿主和克隆中由10g/L 2-氧代丁酸盐分别获得0.25g/L和6g/L的产物滴度。其余所消耗的2-氧代丁酸盐已被转移用于产生异亮氨酸和丙酸，可以通过在提出的敲除菌株(对异亮氨酸和丙酸产生途径酶的敲除)中进行相同的实验来减少异亮氨酸和丙酸的产生。

本发明的优点：

本发明提供了以高产量生产L-2-ABA的替代方法。该方法是经济的，因为它利用了不太贵的底物，如柠苹酸盐或柠康酸盐。柠苹酸盐或柠康酸盐的价格为约每千克0.5美元至15美元。而当前可用的方法使用昂贵的底物，例如食品级和制药级。此外，饲料级苏氨酸使纯化过程困难。

此外，如上所述，本方法对氧化还原平衡的L-2-ABA制备途径进行工程化。而利用苏氨酸的方法不是氧化还原失衡的，因此需要额外的酶来循环辅因子NADH。

与苏氨酸方法中使用的酶相比，从柠康酸盐制备L-2-ABA中所用的酶具有高效率，k

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种通过选自柠苹酸盐或柠康酸盐的底物在无细胞体系中的酶促生物转化来生产L-2-氨基丁酸的方法，其中所述酶是异丙基苹果酸异构酶、异丙基苹果酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中提到的酶为粗制形式或纯化形式或固定化形式。

3.一种通过如权利要求1和2所述的酶促生物转化来生产L-2-氨基丁酸的方法；其中，所述方法包括以下步骤：

a)转化微生物宿主细胞以掺入leu B、leu CD和valDH，以表达酶LeuCD、LeuB和ValDH；

b)收获、裂解宿主细胞以获得粗裂解物；

c)任选地，从粗裂解物中分离和纯化和/或固定化所述酶；

d)在7至9的pH下使用粗裂解物或纯化的酶或固定化酶转化选自柠苹酸盐或柠康酸盐的底物。

4.根据权利要求1和3所述的方法，其中所述方法可以进一步包含辅因子例如MnCl

5.根据前述权利要求所述的方法，其中在12-18小时内L-2-氨基丁酸的产量为至少80g/L。

6.一种通过底物在合适的宿主的全细胞或透性化细胞内部的全细胞生物转化来生产L-2-氨基丁酸的方法，其中底物选自柠苹酸盐或柠康酸盐，其中酶是异丙基苹果酸异构酶、异丙基苹果酸脱氢酶，和氨基酸脱氢酶或转氨酶B。

7.根据权利要求6所述的方法，其中氨基酸脱氢酶选自缬氨酸脱氢酶。

8.通过权利要求6所述的在全细胞或透性化细胞内部的全细胞生物转化来生产L-2-氨基丁酸的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)转化微生物宿主以掺入valDH；

b)任选地，掺入leu B或leu CD或两者，

c)添加底物，所述底物选自柠苹酸盐或柠康酸盐；和

d)在合适的培养基中，在20℃-37℃的温度下培养宿主以表达所述酶，从而获得L-2-氨基丁酸。

9.根据权利要求6和8所述的方法，其中转化步骤还包括敲除ilvD和ilvIH。

10.根据权利要求6和8所述的方法，其中转化步骤还包括敲除ackA、tdcD和pta。

11.根据权利要求6和8所述的方法，其中合适的宿主是细菌和真核生物，例如大肠杆菌(E.coli)、乳酸菌和梭状芽胞杆菌(Clostridium sp.)以及酵母。

12.根据权利要求6所述的方法，其中在15-20小时内L-2-氨基丁酸的产量为至少20g/L或至少40g/L。