激活基因表达以及蛋白质生产的核酸

技术领域

本发明涉及通过使用包括具有特定核苷酸序列的核酸的组合物来提高重组蛋白质生产效率的方法，该核酸用于在斑马鱼、果蝇或其他模式生物以及哺乳动物或人类细胞中并入基因构建体或基因表达载体的序列中，以增强蛋白质生产，并有利地用作在生物技术和/或生物制药应用中提高蛋白质产率的新工具。因此，本发明属于化学、生物化学、分子生物学、微生物的基因工程、重组DNA技术的技术领域。

背景技术

重组蛋白质生产的效率是大多数生物制药和生物技术行业中的重要瓶颈，并且提高生产率的策略通常依赖于宿主细胞生长培养基组合物的改善(如文件US2017218328和WO9429435中所公开的)或通过诱导或增强来控制细胞生长过程(分别如文件US5089397和US2018135008中所述)；或通过用于扩大规模培养的逐步过程。解决该问题的另一种策略考虑使用更有效的表达载体，其通过添加数种类型的表达增强子元件，例如在文件CN107090441、CN107653266、KR20170140925和CN104975018中所述。表达载体是基因工程化的构建体，其用于在宿主细胞中引入基因和表达目的蛋白。表达载体可在基因编码序列的上游和/或下游包含不同类型的启动子(如US2019055580中所公开的)，以及其他调控元件，使得发生目的基因的更有效表达。例如，文件US2008241883公开了用于重组表达载体的增强子元件，以促进重组蛋白质在宿主细胞中的表达。然而，这些元件的长度非常长，具有2329和2422个碱基对，这使得它们难以亚克隆，并且带来使骨架表达载体增加了相当大尺寸的缺点，从而使其更难于扩增、操纵和转染。某些增强子仅在特定的宿主细胞中起作用，如文件CN107653266或CN105238816中描述的增强子(其仅针对昆虫细胞设计)或US20110195451中所公开的载体(其仅针对动物细胞设计)所示例的。其他增强子序列对于给定基因是特异性的，如文件US2010151520和US2003013867中所示例的。

因此，尽管在理解可影响重组蛋白质表达的多种序列和其他因素方面取得了进展，但是仍然需要提高重组蛋白质的产率，特别是旨在用于治疗的或其他专门化的生物技术应用的重组蛋白的产率。期望地，这可以通过可以化学合成并容易地亚克隆(sob-cloned)的小的增强子序列来解决，该增强子在多种类型的宿主细胞和不同靶基因中具有“通用”效应，而不会干扰基因编码区。然而，现有技术仍然缺少具有所有这些特征的序列。

公开这些事实是为了说明本公开内容解决的技术问题。

发明内容

本发明人发现并表征了一种新的短的28个核苷酸序列，在本文中称为iPLUS——蛋白质水平通用序列增加——并在SEQ ID nr.1中规定，在包括果蝇、斑马鱼的几个模式系统中和在人类细胞系中，该核苷酸序列强烈提高了体内蛋白质生产。可以在体外合成该序列，并将其用于组合物、载体、重组细胞系或试剂盒中，其中该序列大大地提高了蛋白质生产，例如Polo蛋白或绿色荧光蛋白(GFP)的生产。通过特定方法，可以将该28个核苷酸序列或该序列的较小功能片段插入基因、表达载体或报告载体的序列中，以增强蛋白质生产。

因此，根据权利要求1，本发明涉及核酸用于提高目的蛋白质表达的用途，其特征在于，包含至少一个拷贝的具有SEQ ID nr.1的碱基序列的28-寡核苷酸。

根据权利要求2，在本发明的另一个实施方式中，用于提高目的蛋白质表达的核酸的特征在于，包含至少一个拷贝的核苷酸碱基序列SEQ ID nr.1的截短序列，其在4和27个核苷酸之间，最优选22个核苷酸。

根据权利要求3，本发明的另一方面涉及用于提高目的蛋白质表达的组合物，其特征在于，包含至少一个拷贝的具有序列SEQ ID nr.1或SEQ ID nr.1的截短形式的核酸、缓冲剂(例如Tris-HCl)、二价离子螯合剂(例如EDTA)及其组合。

根据权利要求4，在本发明的另一个实施方式中，所述用于提高目的蛋白质表达的组合物的特征在于，进一步包含在SEQ ID nr.1或SEQ ID nr.1的截短形式的上游、下游或两端的限制性内切酶识别序列。

根据权利要求5，本发明还涉及用于提高目的蛋白质表达的基因构建体，其特征在于，在目的基因编码区的下游或上游，最优选下游，包含至少一个拷贝的具有SEQ ID nr.1或SEQ ID nr.1的截短形式的核酸。

根据权利要求6，在本发明的另一个实施方式中，所述用于提高目的蛋白质表达的基因构建体是表达载体。

根据权利要求7，在本发明的另一个实施方式中，所述表达载体选自重组真核质粒表达载体、重组原核表达载体、重组病毒表达载体、重组噬菌体表达载体、重组酵母微染色体表达载体、重组细菌人工染色体表达载体和重组酵母表达质粒载体。

根据权利要求8，本发明还指用于提高目的蛋白质表达的宿主细胞系，其特征在于，包含SEQ ID NO：1中描述的核酸的至少一个外源拷贝，其例如通过基因编辑引入。

根据权利要求9，在本发明的另一个实施方式中，所述用于提高目的蛋白质表达的宿主细胞系的特征在于，稳定地或瞬时地包含所述基因构建体或表达载体。

根据权利要求10，在本发明的另一个实施方式中，宿主细胞系选自哺乳动物宿主细胞(其非限制性实例包括海拉细胞、中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾293细胞、小仓鼠肾细胞、人B细胞、人T细胞Jurkat、神经元细胞、胰腺细胞、CV-I/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞和MDCK细胞)、昆虫宿主细胞(这类非限制性实例包括果蝇细胞)、脊椎动物宿主细胞(非限制性实例包括斑马鱼和斑马鱼细胞系)、植物宿主细胞(非限制性实例包括烟草、拟南芥、莴苣、原生质体、悬浮细胞)、真菌宿主细胞(其非限制性实例包括曲霉属、脉孢菌属、酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属(Yarrowia)和念珠菌属细胞)、藻类宿主细胞(其非限制性实例包括集胞藻属和其他蓝藻目细胞)、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和原核宿主细胞(其非限制性实例包括大肠杆菌、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)和溶组织梭菌细胞)。

根据权利要求11，本发明的另一方面涉及用于提高目的蛋白质在宿主细胞中表达的方法，其特征在于包括以下步骤：

a)合成具有上述寡核苷酸序列的核酸插入物并制备所述组合物；

b)使插入物核酸组合物与编码目的蛋白质的线性化表达载体接触，并通过在适当的缓冲液和温度条件下与DNA连接酶一起温育来使插入物连接，从而获得如上所述的表达载体；

c)通过瞬时或稳定转化、转导、转染或通过基因编辑方案，将所述表达载体或所述核酸引入宿主细胞，以生产宿主细胞系。

根据权利要求12，在本发明方法的另一个实施方式中，所述插入物连接在基因编码序列的下游，以在3'非翻译区(3'UTR)处转录。

根据权利要求13，在本发明方法的另一个实施方式中，所述插入物连接在所述基因编码序列的上游，以在5'非翻译区(5'UTR)处转录。

根据权利要求14，在本发明方法的另一个实施方式中，所述插入物连接在基因编码序列的上游和下游二者，以在5'UTR和3'UTR二者处转录。

根据权利要求15，在本发明方法的另一个实施方式中，所述目的蛋白质选自激酶(例如Polo激酶蛋白或其他酶蛋白)、报告蛋白(例如GFP和荧光素酶蛋白)、抗体或抗体片段蛋白、激素蛋白、生长因子蛋白、细胞因子蛋白、受体蛋白、结构蛋白和病毒蛋白。

根据权利要求16，在本发明方法的另一个实施方式中，所述转化、转导、转染或基因编辑方案包括本领域已知的方案，其采用氯化钙和热休克、病毒颗粒、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体、非脂质体脂质、树状聚体、向导RNA和CRISPR/CAS9酶或胚胎显微注射。

根据权利要求17，本发明还涉及用于提高目的蛋白质表达的试剂盒，其特征在于，包括用所述核酸、或所述基因构建体表达载体或所述宿主细胞系制备的所述组合物。

根据权利要求18，本发明还涉及至少一个拷贝的具有28个寡核苷酸碱基序列SEQID nr.1的核酸在用于提供治疗疾病例如但不限于癌症、基因、胰腺或神经系统紊乱的方法中的用途，其通过基因编辑方法将所述核酸引入宿主细胞并提高目的蛋白质的表达。

根据权利要求19，本发明的另一个方面涉及降低宿主细胞中目的蛋白质的表达、基本上抑制宿主细胞中目的蛋白质的表达或基本上关闭宿主细胞中目的蛋白质的表达的方法，该方法包括以下步骤：缺失或干扰具有SEQ ID nr.1的28-寡核苷酸碱基序列的非编码核酸。

本发明的方法、核酸序列、组合物、载体、细胞系和试剂盒可以有利地用作在生物技术和/或生物制药应用中促进蛋白质生产的新工具，这是由于其在斑马鱼、果蝇或其他模式生物以及在哺乳动物或人类细胞中增强源自基因构建体、基因表达或报告载体的蛋白质生产的能力。

具体实施方式

本发明人发现并表征了新的短的非编码的28个核苷酸序列，在本文中称为iPLUS——蛋白质水平通用序列增加——并在SEQ ID nr.1中规定，其强烈提高了体内和体外的蛋白质生产。

由于该序列短，因此其可以通过化学合成获得，并且可以容易地插入表达载体或宿主细胞的基因组中。令人惊讶地，它证明了“通用”蛋白质表达增强子效果，该效果在多种类型的宿主细胞中并且对不同类型的目的蛋白质有效。此外，因为它是非编码的，所以在不干扰基因编码区和所产生的蛋白质的情况下，实现了其效果。

所述iPLUS序列(SEQ ID nr.1)可以通过使用固相亚磷酰胺核苷的核苷酸合成方法(如以下出版物所述：Beaucage，SL；Iyer,RP(1992).“通过亚磷酰胺方法合成寡核苷酸的进展(Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the PhosphoramiditeApproach)”.Tetrahedron 48(12)：2223)来制备。合成可以在带有固体支持物(受控孔玻璃或聚苯乙烯)的柱上进行，该固体支持物用每个寡核苷酸3'端的第一个碱基功能化。寡核苷酸的制备在许多合成循环之后进行，每个合成循环由化学反应组成，通常为四个化学反应：i)释放(脱三苯甲基)、ii)偶联、iii)保护和iv)氧化。在每个循环中，在生长链的5'端添加对应于所需序列的核苷酸残基。

核苷酸是指天然或合成来源的核苷酸，其具有通过与互补核苷酸碱基配对的杂交能力，并且可以包括但不限于DNA、RNA和核苷酸类似物(例如，具有闭合构象的核酸，其称为“锁核酸”——LNA)、核苷酸或没有核苷酸间磷酸二酯型键(例如，肽核酸——PNA)以及具有硫二酯(tiodiester)键的核酸等等，其用于同样目的。

在本发明的另一个实施方式中，可以在基因、表达载体或报告载体的序列中插入4至27个核苷酸之间，最优选22个核苷酸的该序列(SEQ ID nr.1)的较小的截短功能片段，以增强蛋白质生产。

在本发明的另一个实施方式中，可在串联重复序列中使用1个拷贝以上的SEQ IDnr.1的核酸或该序列的较小的截短功能片段，以为了实现蛋白质生产中更高的倍数变化。

在本发明的另一个实施方式中，具有SEQ ID nr.1的核酸或该序列的较小的功能片段用于生成组合物，该组合物进一步包含缓冲液(例如Tris-HCl)、二价离子螯合剂(例如EDTA)或其组合，用于将序列插入表达载体或宿主细胞中。

可通过具有“平端”的DNA片段之间的DNA连接酶介导的磷酸二酯键执行将增加蛋白质生产的序列插入表达或报告载体中。

在本发明的一个实施方式中，本发明人称为pLuc的载体——其具有与表达报告荧光素酶的载体pmirGLO(来自Promega)相似的功能，通过SmaI消化(在37℃下1小时)线性化，并用2μl FastAP在37℃下在10分钟期间进行去磷酸化。插入物iPLUS核苷酸序列(SEQ IDnr.1)或突变体形式(iPLUS突变体)——用作对照，和线性化的pLuc使用100ng pLuc和19ngiPLUS或iPLUS突变体(5:1)在5单位的T4 DNA连接酶的存在下于22℃下持续2小时进行连接。

在一个实施方式中，通过采用包含28个核苷酸增强序列的组合物的分子生物学方法，将GFP-iPLUS和GFP-iPLUS突变体序列亚克隆到pUC19miniTOL表达载体的SalI和KpnI限制性内切酶切位点中。

因此，在本发明的另一个实施方式中，插入物组合物中的核酸序列(SEQ ID nr.1)可以进一步在SEQ ID nr.1的上游、下游或两端包含限制性内切酶识别序列，以提供“黏性末端”以更有效和定向的插入物连接。

在本发明的另一个实施方式中，将iPLUS亚克隆到GFP的下游，并将所得的构建体(puc19 miniTOL-GFP-iPLUS，图1A)显微注射到斑马鱼的一细胞阶段的胚胎中。还制造了对照构建体，其中iPLUS序列被突变(puc19miniTOL-GFP-iPLUSmt)。值得注意的是，与iPLUS突变体对照相比，显微注射iPLUS的斑马鱼胚胎中GFP蛋白生产提高，通过荧光显微镜法可视化(图1B)。蛋白质水平的定量清楚地表明，与对照相比，iPLUS增强了GFP生产(图1C)。将GFP-iPLUS和GFP-iPLUS突变体随机插入基因组的斑马鱼证实了iPLUS作为蛋白质生产的激活剂(图1D)。

在本发明的另一个实施方式中，将iPLUS序列(SEQ ID nr.1)亚克隆到荧光素酶基因的下游，并将所得的构建体(pLucDelSV40.iPLUS)转染到海拉细胞中。还设计了其中iPLUS被突变的对照构建体(pLucDelSV40.iPLUS突变体)。定量荧光素酶蛋白活性水平，并且结果显示，与对照相比，在用iPLUS转染的细胞中提高了了八倍(图2)。

因此，在本发明的优选实施方式中，包括表达载体，其中iPLUS(SEQ ID nr.1)被插入到编码的目的基因(在前一种情况下是LUC或GFP)的下游。

基因构建体，例如以上述方式生成的表达载体，构成了本发明的另一个实施方式，其涉及基因构建体和表达载体，其中体现了SEQ ID nr.1、串联重复序列或较小的截短的功能片段。

其中可以插入iPLUS的表达载体可以包括重组体，重组真核质粒表达载体、重组原核表达载体、重组病毒表达载体、重组噬菌体表达载体、重组植物表达载体、重组酵母微染色体表达载体、重组细菌人工染色体表达载体和重组酵母表达质粒载体。

在另一个实施方式中，具有至少一个拷贝的具有28-寡核苷酸碱基序列SEQ IDnr.1的核酸的上述基因构建体或载体也可以用作报告基因，以测试28个核苷酸序列或该序列的较小的功能片段的活性，以发现其效率的调节剂，其包括在宿主细胞内的其他基因、化合物或基因修饰。

在另一个实施方式中，通过在42℃下热休克1分钟，用包含体现iPLUS(SEQ IDnr.1)的质粒表达载体的连接产物转化感受态细菌。选择带有iPLUS和iPLUS突变体的菌落，并获得质粒DNA。然后将表达载体质粒转染到在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM 1x GlutaMAX，Gibco)中培养的海拉细胞中，并根据制造商的方案使用Lipofectamine 3000试剂(来自Thermo Fisher Scientific)。

在另一个实施方式中，将混合物显微注射到一细胞阶段的斑马鱼胚胎中，该混合物含有50ng pUC19miniTOL-GFP-iPLUS和pUC19miniTOL-GFP-iPLUS突变体对照，以及50ngTol2和0.1μl酚红(用作染料以指导显微注射成功)。显微注射后，将胚胎放置于E3培养基中(28.67g的NaCl、1.26g的KCl、4.83g的CaCl

因此，数种类型的宿主细胞可以用包含iPLUS的表达载体转染以提高蛋白质表达，并因此，本发明的其他实施方式涉及用于提高目的蛋白质表达的宿主细胞系，所述宿主细胞系稳定地或瞬时地包含整合iPLUS(SEQ ID nr.1)的表达载体。

总体而言，通过转染iPLUS序列(SEQ ID nr.1)生成的宿主细胞系的范围可能包括哺乳动物宿主细胞(其非限制性实例包括海拉细胞、还有中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾293细胞、小仓鼠肾细胞、人B细胞、人T细胞Jurkat、神经元细胞、CV-I/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞和MDCK细胞)、昆虫宿主细胞(这类的非限制性实例包括果蝇细胞)、鱼宿主细胞(非限制性实例包括斑马鱼一细胞的胚胎)、植物宿主细胞(非限制性实例包括烟草、拟南芥、莴苣、原生质体、悬浮细胞)、真菌宿主细胞(其非限制性实例包括曲霉属、脉孢菌属、酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属和念珠菌属细胞)、藻类宿主细胞(其非限制性实例包括集胞藻属和其他蓝藻目细胞)、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和原核宿主细胞(其非限制性实例包括大肠杆菌、菊欧文氏菌和溶组织梭菌细胞)。

除了体现包含iPLUS(SEQ ID nr.1)的表达载体的宿主细胞系以外，本发明的另一个实施方式涉及包含具有序列SEQ ID nr.1的核酸的至少一个外源拷贝的宿主细胞系，而该核酸不一定整合到表达载体中，其例如通过本领域已知的基因编辑方案被引入到目的基因的下游，并且仍然处于天然基因调控元件的控制之下。

根据上述实施方式，本发明的另一方面涉及用于提高目的蛋白质在宿主细胞中表达的方法，其特征在于包括以下步骤：

a)合成具有上述寡核苷酸序列的核酸插入物并制备所述组合物；

b)使插入物核酸组合物与编码目的蛋白质的线性化表达载体接触，并通过在适当的缓冲液和温度条件下与DNA连接酶一起温育来使插入物连接，从而获得如上所述的表达载体；

c)通过瞬时或稳定转化、转导、转染或通过基因编辑方案，将所述表达载体或所述核酸引入宿主细胞，以生产宿主细胞系。

同样，根据本文所述的实施方式，所述目的蛋白质选自激酶(例如Polo激酶蛋白或其他酶蛋白)、报告蛋白(例如GFP和荧光素酶蛋白)、以及其他普通重组蛋白(例如抗体或抗体片段蛋白)、激素蛋白、生长因子蛋白、细胞因子蛋白、受体蛋白、结构蛋白和病毒蛋白。

根据本文所述的实施方式，在本发明的方法中，所述转化、转导、转染或基因编辑方案包括本领域已知的方案，其直接采用氯化钙感受态细菌和热休克、脂质体(例如Lipofectamine3000试剂)，以及本领域中其他已知的其他方案，其包括病毒颗粒、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、非脂质体脂质、树状聚体、向导RNA和CRISPR/CAS9酶。

根据本文所述的实施方式，本发明还涉及用于提高目的蛋白质表达的试剂盒，其包含用于进行本发明方法的实施方式中的至少一个，即上述用具有SEQ ID nr.1的iPLUS核酸制备的组合物，或上述表达载体，或其中体现这些载体的宿主细胞系。

由于iPLUS是短的序列的事实，它可以通过本领域已知的基因编辑方案整合到包括胚胎细胞在内的宿主细胞系中，因此，本发明还涉及至少一个拷贝的具有28-寡核苷酸碱基序列SEQ ID nr.1的核酸在用于提供治疗疾病例如但不限于癌症、基因、胰腺或神经系统紊乱的方法中的用途，其通过基因编辑方法将外源核酸引入宿主细胞并提高目的蛋白质的表达。

在本发明的一个实施方式中，通过共聚焦显微镜法定量了转基因蝇类中的polo激酶蛋白质水平。通过注射带有各自转基因的ww1118胚胎，获得带有iPLUS或缺失的iPLUS序列(gfp-polo-Del-iPLUS)的携带pW8-gfp-polo激酶蛋白的转基因蝇类(图3A)。通过将转基因蝇类与携带有显性标记和平衡染色体的品系(strain)即w1118；Sco/SM6交配，进行在第二条染色体具有转基因的转基因系的选择。然后将这些与w1118；If/CyO；MKRS/TM6B和w1118；If/CyO；polo9/TM6C交配以产生w1118；gfp-polo-Del-iPLUS；polo9/TM6B系(本文称为Del-iPLUS转基因蝇类品系)。将每个品系的切开的幼体大脑置于PBS中的新鲜的50μM秋水仙碱中，在25℃下持续1小时30分钟，然后用1.8％甲醛和45％乙酸固定5分钟。将脑压片(brain squashes)与无水乙醇一起温育10分钟，然后与0.1％Triton X-100的PBS一起温育10分钟，并用PBS洗涤10分钟。在室温下用含10％FBS的0.05％的PBS-T封闭固定的大脑1h，然后与下述抗体在4℃一起温育过夜：大鼠抗-Spc105(1:150)、小鼠抗-Polo(1:10，MA294)、兔抗P-Aurora(1:500，Rockland，Limerik，PA)、兔抗-Thr676-P-Mps1(1:10000)和豚鼠抗-总Mps1(1:250，Gp15 RRID:AB_2567774)。随后在0.05％Tween20的PBS中洗涤3次，每次5分钟，然后与在0.05％Tween20的PBS中以1:250稀释的下述二抗(Thermo Fischer)在室温下一起温育2h：山羊抗大鼠AlexaFluor 647、山羊抗小鼠AlexaFluor488、山羊抗兔AlexaFluor 568和山羊抗豚鼠AlexaFluor 568。使用激光扫描共聚焦显微镜Leica TCSSP5 II和LAS 2.6软件(德国Leica Microsystems)进行图像获取。体内Polo蛋白表达的结果清楚地表明，在没有iPLUS的转基因蝇类中，蛋白质生产强烈降低(图3B和3C)。

因此，本发明的另一个方面涉及降低宿主细胞中目的蛋白质的表达、基本上抑制宿主细胞中目的蛋白质表达或基本上关闭宿主细胞中目的蛋白质表达的方法，该方法包括以下步骤：缺失或干扰具有SEQ ID nr.1的28-寡核苷酸碱基序列的核酸。

本发明的核酸序列、组合物、载体、宿主细胞系、方法、试剂盒和用途可以有利地用作在生物技术和/或生物制药应用中促进蛋白质生产的新工具，这是由于其在斑马鱼、果蝇或其他模式生物以及在哺乳动物或人类细胞中增强源自基因构建体、基因表达或报告载体的蛋白质生产。

附图说明

图1：其中iPLUS(SEQ ID nr.1)提高斑马鱼中GFP表达的实施方式。A)用于生成转基因鱼的构建体的示意图，其具有插入GFP的3'UTR中的iPLUS(puc19 miniTOL-GFP-iPLUS)。B)与突变的iPLUS相比，iPLUS激活GFP表达。在一细胞阶段的胚胎中，显微注射puc19 miniTOL-GFP-iPLUS和puc19miniTOL-GFP-iPLUSmt与mylz启动子mCherry。在24h阶段获取图像。C)iPLUS与iPLUS突变体GFP表达的定量。在每种情况下，在24小时阶段分析30个胚胎的GFP强度。D)与iPLUS突变体建立者(founder)Zelya相比，iPLUS建立者Spot中有强烈的GFP表达。在背侧和腹侧视图中在48h阶段获取图像。

图2：其中在用iPLUS(SEQ ID nr.1)转染的海拉细胞中提高萤光素酶活性的实施方式。在海拉细胞中具有不同质粒(pLucDelSV40、pLucDelSV40.iPLUS和pLucDelSV40.iPLUS突变体)的萤光素酶/海肾(Renilla)(RLU)的百分比。在读板机(Synergy 2)中通过双重萤光素酶报告基因测定法(Promega)来测量海肾和萤光素酶的表达。

图3：其中缺失了iPLUS(SEQ ID nr.1)以减少基因表达的实施方式。A)构建用于产生转基因蝇类的转基因的示意图，其中iPLUS序列包含在polo基因下游的3'UTR处。转基因开始处的箭头代表内源性polo启动子，灰色框代表5个polo外显子，黑色框代表5'和3'UTR，gfp框代表框内插入有polo起始密码子的gfp编码序列。3'UTR中的阴影框代表iPLUS序列，该序列已从3'UTR序列中缺失。B)如通过分裂的成神经细胞中GFP-Polo的免疫荧光的定量评估的，在iPLUS缺失的蝇类中GFP-Polo表达降低，其中Spc105用作动粒标记。

总之，一种28个核苷酸的核酸序列iPLUS是在包括果蝇、斑马鱼在内的不同模式生物中和人类细胞中的体内和体外蛋白质生产的新激活剂。通过在生物技术和/或生物制药应用中使用用作提高蛋白质生产的有效工具的组合物、方法和试剂盒，可以轻松地操纵iPLUS。

上文中引用的所有专利、申请和出版物均通过引用包含在本文中。

现在，本文所描述的本发明的其他变化和实施方式对本领域技术人员而言是显而易见的，并且本发明的所有此类变化和可选实施方式旨在被包含在前述描述和所附权利要求书之内。

序列表

SEQ ID nr.1:5’-AATTTATTTGTTTTTGCCCCTTCCCCTT-3’

波尔图，10月9日，2019

序列表

<110> 分子细胞生物学研究所 - IBMC

<120> 激活基因表达以及蛋白质生产的核酸

<130> 13676FFP

<150> PT115073

<151> 2018-10-09

<160> 1

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

aatttatttg tttttgcccc ttcccctt 28