一种检测血清中平喘药物的方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及血药浓度检测技术领域，具体涉及一种检测血清中平喘药物的方法和试剂盒。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

茶碱类药物主要用于治疗慢性阻塞性肺疾病和哮喘，临床最为常用的茶碱类药物有茶碱、氨茶碱、多索茶碱、胆茶碱、二羟丙茶碱等。茶碱类药物的治疗剂量与中毒剂量相当接近，治疗指数狭窄，且该类药物口服吸收影响因素较多，个体差异大，因此临床血药浓度监测十分必要。

目前利用HPLC-MS进行血液中药物的测定越来越受到关注。其中，样本预处理简单，样品需要量少，不需水解及衍生化，检测时间短，是临床常规检测的理想选择方法。

茶碱类药物分子结构相似，尤其是茶碱与二羟丙茶碱只是一个基团的区别，二羟丙茶碱是在茶碱结构的7位引入一个二羟丙基，两者之间，色谱行为差别不大，常规的流动相很难将两者有效分开，而且检测时间过长。

血液样本成分复杂，含有大量的内源性大分子，使得分析结果易受基质效应的影响，因此在分析前需要对样本进行适当地预处理，将待测组分从生物样本基质中分离出来，以降低基质效应的影响。简单的蛋白沉淀并不能完全去除杂质，在进行定量分析时，杂质的存在严重影响检测结果的准确性。而过于复杂的提取方法如液相、固相萃取技术操作繁琐，且检测成本过高，不适合市场化大规模推广。因此合适的样本提取技术至关重要。

根据文献报道常用的平喘药常规流动相为甲醇和水溶液，提取方法为蛋白沉淀后直接进样分析，或用水稀释1倍后进样，此类方法检测时间长，不能有效去除杂质降低基质效应，势必会影响检测结果的准确性，且长时间进样检测后极易造成管路阻塞和损伤仪器。

发明内容

为了改善现有技术的不足，本申请提供了一种检测血清中平喘药物的方法和试剂盒，所述平喘药物为茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱，本发明的方法能够在改善分离度的同时有效缩短检测时间，提高分析测定效率，并解决了检测信号低、灵敏度低的问题；同时，本发明的方法线性良好可行性高。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种检测血清中平喘药物的方法，所述平喘药物为茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱，所述方法包括对血清样品进行提取后采用HPLC-MS法检测分析，其中，提取液为含有三氯乙酸的甲醇和乙腈的混合溶液。

在本发明的实施方式中，本发明的提取液提取更为充分，能够有效去除杂质，降低基质效应。尤其是，经过优化，发明人发现提取液中三氯乙酸体积分数为0.02-0.08％，甲醇、乙腈体积比为1:1-1:8时效果较优，尤其是，当提取液中甲醇、乙腈体积比为1:5，三氯乙酸体积分数为0.05％时，效果更好，在本发明的一些实施方式中，本发明经优化后的技术方案相较于常规的提取方法，比如以甲醇/乙腈为提取液，使用本发明的提取液可使得分析物茶碱的峰面积提升10-14倍，二羟丙茶的峰面积提升2-5倍，多索茶碱提取效果提高了3-6倍。在本发明的实施方式中，发明人还验证了单独使用三氯乙酸的效果，结果发现，三氯乙酸能够与蛋白质结合形成不溶性盐析出，但是难以保证沉淀完全，蛋白沉淀效果无法有效控制。

在本发明的一些实施方式中，所述提取方法包括：使用提取液对血清进行提取后涡旋离心取上清液稀释。其中，以含三氯乙酸的水溶液作为稀释液进行稀释。

本发明的稀释液进一步降低了干扰，在本发明的一些实施方式中，含三氯乙酸的水溶液中三氯乙酸体积分数为0.02-0.08％，尤其为0.05％时，这一效果更为明显，相较于以水溶液为稀释液进行的检测，可以明显提高分析物茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的提取效果，在本发明的一些实施方式中，相较于常规的水溶液作为稀释液，分析物茶碱的峰面积可提升1.8-3.0倍，二羟丙茶碱的峰面积可提升1.2-2.5倍，多索茶碱提取效果提高了1.5-2.8倍。

在本发明的一些实施方式中，HPLC-MS分析时，流动相A为含有三氟乙酸和氟化铵的HPLC级水，流动相B为含有三氯乙酸和氟化铵的甲醇。

在本发明的实施方式中，本发明的流动相可以大大缩短检测时间，改善峰形，且分离度满足要求，降低时间检测成本。尤其是，流动相A和B中含有的三氯乙酸的体积分数为0.02-0.08％，氟化铵的浓度为0.05mM-0.4mM时，这一改善较为明显，特别是流动相A和B中含有的三氯乙酸的体积分数为0.05％，氟化铵的浓度为0.2mM时，改善效果更好；在本发明的一些实施方式中，现有的方法出峰时间较晚、有些分析物分离效果欠佳，且检测总时长往往超过15min，而本发明的方法分析物的出峰时间较短、且彼此间分离较好，而且检测总时长可控制在5min左右，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。

在本发明的一些实施方式中，所述方法的色谱条件为：

色谱柱：ZORBAX SB C18(2.1mm×100mm,3.5μm)；

柱温：40-70℃，优选40℃；

流动相A：含体积分数为0.05％的三氯乙酸和0.2mM氟化铵的HPLC级水，流动相B：含体积分数为0.05％的三氯乙酸和0.2mM氟化铵的甲醇；

梯度洗脱条件：0-1.0min，20％流动相B；1.01-4.0min，80％-95％流动相B；4-4.01min，98％-20％流动相B；4.01-5min，20％流动相B；

流速：0.2-0.5mL/min，优选为0.3mL/min；

进样量：2-8μL，优选为2μL。

在本发明的一些实施方式中，所述方法的质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，喷雾电压4000V：去溶剂温度：380℃；

优选地，分析物茶碱的母离子为181.112m/z，子离子为181.112m/z，透镜电压为96V，碰撞能量为18.45V；

分析物二羟丙茶碱的母离子为255.162m/z，子离子为124.083m/z，透镜电压为108V，碰撞能量为28.96V；

分析物多索茶碱母离子为267.112m/z，子离子为124.083m/z，透镜电压为112V，碰撞能量为29.49V。

本发明的检测方法能够显著改善提取效果、在保证良好分离度的同时有效缩短检测时间，可将检测总时长控制在5min以内，提高分析测定效率，并提升了检测信号；并且绘制得到的分析物的标准曲线图相关系数R2均大于0.999，线性良好、可行性高。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种检测血清中平喘药物的试剂盒，所述平喘药物为茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱，所述试剂盒中包括提取液、稀释液和流动相溶液；

所述提取液为含有三氯乙酸的甲醇和乙腈的混合溶液；优选地，提取液中甲醇、乙腈体积比为1:1-1:8，优选为1:5，三氯乙酸体积分数为0.02-0.08％，优选为0.05％；

所述稀释液为含有三氯乙酸的水溶液；优选地，稀释液中三氯乙酸体积分数0.02-0.08％，优选为0.05％；

所述流动相溶液为：流动相A为含有三氟乙酸和氟化铵的HPLC级水，流动相B为含有三氯乙酸和氟化铵的甲醇；优选地，流动相A和B中含有的三氯乙酸的体积分数为0.02-0.08％，优选为0.05％，氟化铵的浓度为0.05mM-0.4mM，优选为0.2mM。

通过上述技术手段，可实现以下有益效果：

本发明的方法提供了一种同时检测血清中平喘药茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的方法，其中提取液、稀释液的改进大大减少了杂质的干扰、提升了提取效果，流动相的改进在保证分析物良好分离的前提下、显著缩短了检测时间，降低时间检测成本，解决常规方法中检测时间长，不能有效去除杂质，检测结果准确性和灵敏度低的问题。此外，本发明的方法相比传统液液萃取和固相萃取方法操作更简单快速，样品用样量少，试剂消耗少，提取效果更佳。因此，本发明的方法能够更快更好的实现对血清中平喘药茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的血药浓度检测，为保障临床用药安全以及便于对患者实施个体化给药提供了便利。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：

图1为实施例1中茶碱的信号图。

图2为实施例1中二羟丙茶碱的信号图。

图3为实施例1中多索茶碱的信号图。

图4为对比例2中茶碱的信号图。

图5为对比例2中二羟丙茶碱的信号图。

图6为对比例2中多索茶碱的信号图。

图7为对比例3中茶碱的信号图。

图8为对比例3中二羟丙茶碱的信号图。

图9为对比例3中多索茶碱的信号图。

图10为对比例4中茶碱的信号图。

图11为对比例4中二羟丙茶碱的信号图。

图12为对比例4中多索茶碱的信号图。

图13为实施例2中茶碱的标准曲线图，其中，相关系数R2＝0.9999，标准曲线方程为Y＝1.537E0X，即Y＝1.537X。

图14为实施例2中二羟丙茶碱的标准曲线图，其中，相关系数R2＝0.9998，标准曲线方程为Y＝8.444E-1X，即Y＝0.8444X。

图15为实施例2中多索茶碱的标准曲线图，其中，相关系数R2＝0.9996，标准曲线方程为Y＝2.14E0X，即Y＝2.14X。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并且不意在限制本申请的示例实施例。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该”意在包括复数形式，除非上下文明确指示相反意思。还应当理解术语“包括”、“包括了”、”包含”、和/或“包含了”当在本文中使用时，指定所声明的特征、整数、步骤、操作、单元和/或组件的存在性，并且不排除一个或多个其他特征、数量、步骤、操作、单元、组件和/或他们的组合的存在或增加。

应当理解，尽管在本申请可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本申请范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

此外，特定特征、结构、功能或特性可以以任何适合的方式组合到一个或多个实施例中。例如，第一实施例可以结合第二实施例，只要与这两个实施例相关联的特定特征、结构、功能或特性不互相排斥。

本发明所述实施例和对比例中的血清样品取样来源相同，均取自同一血清样品。本发明全血样品取自同时使用了依维莫司和西罗莫司的病患，于下一次给药前采血用于检测。

1、提取血清中的茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱

(1)向离心管中加入25μL血清样品，加100μL提取液，提取液成分为甲醇、乙腈、三氯乙酸溶液的混合液，甲醇、乙腈体积比为1:5(三氯乙酸体积分数为0.05％)。

(2)将上述样品溶液涡旋5min，离心机转速为12000r/min；离心5min。

(3)取离心后取10μL上清至96孔接收板中，加入100μL稀释液，混匀，稀释液成分为含三氯乙酸体积分数为0.05％的水溶液。

(4)覆上铝箔封膜，供色谱进样分析。

2、仪器方法

(1)色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB C18(2.1mm×100mm，3.5μm)，柱温：40℃；流动相A：含体积分数为0.05％的三氯乙酸和0.2mM氟化铵的HPLC级水，流动相B：含体积分数为0.05％的三氯乙酸和0.2mM氟化铵的甲醇；梯度洗脱条件：0-1.0min，20％流动相B；1.01-4.0min，80％-95％流动相B；4-4.01min，98％-20％流动相B；4.01-5min，20％流动相B，具体的梯度洗脱程序如表1所示。流速：0.3mL/min；进样量2μL；

表1梯度洗脱程序

(2)质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，喷雾电压4000V：去溶剂温度：380℃。

分别选取了茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱进行检测，MRM质谱参数如表2所示：

表2 MRM质谱参数

结果，茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱能够很好的分离，且灵敏度高、信号强度高，总体检测时长为4.5min，耗时较短。其中，茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的信号图如图1、图2和图3所示，上述分析物的保留时间如表3所示、峰面积如表4所示。

表3分析物保留时间

表4分析物峰面积

对照品溶液：分别精密称取茶碱、二羟丙茶碱、多索茶碱对照品为47.00、10.22、11.50mg，分别置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为4.70、1.02、1.15mg/mL的对照品溶液，置4℃冰箱备用。

咖啡因内标溶液：精密称取咖啡因对照品10.00mg，用甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，得质量浓度为1.00mg/mL的咖啡因储备液，置4℃冰箱备用。

血清样品预处理：取200μL血清，加入内标溶液20μL涡旋混匀30s，加入380μL提取溶剂(甲醇：乙腈＝1:1，v/v)，涡旋混匀2min，于14500r/min离心10min，取上清液200μL加入200μL水，涡旋混匀，进样20μL记录色谱图。

色谱条件：色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱(0-1min，7％A；1-12min，7％-25％A；12-15min，25％-7％A；15-18min，7％A)；流速1mL/min；检测波长273nm；柱温30℃；进样量20μL。

结果，分析物茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的保留时间如表5所示。

表5分析物RT出峰时间

该方法与本发明的实施例1相比，总体检测时间过长，且茶碱和二羟丙茶碱的分离欠佳。

采用甲醇和乙醇的混合溶液(甲醇、乙腈体积比为1:5)替代实施例1中的提取液对血清样品进行提取，其他条件与方法同实施例1。

结果，茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的信号图如图4、图5、图6所示，分析物峰面积如表6所示。

表6分析物峰面积

如表6所示，实施例1的检测方法相较于对比例2可以明显提高分析物茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的信号，其中，实施例1相较于对比例2，茶碱提取效果提高了13.7倍，二羟丙茶碱提取效果提高了3.7倍，多索茶碱提取效果提高了5.5倍。

以纯水替代实施例1中的稀释液，其他条件和方法同实施例1。

结果，茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的信号图如图7、图8、图9所示，分析物峰面积如表7所示。

表7分析物峰面积

如表7所示，实施例1的检测方法相较于对比例3可以明显提高分析物茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的信号，其中，实施例1相较于对比例3，茶碱提取效果提高了2.2倍，二羟丙茶碱提取效果提高了1.9倍，多索茶碱提取效果提高了2.2倍。

以HPLC级水为流动相A和以甲醇为流动相B替换实施例1中的流动相，其他条件及方法同实施例1。

结果，茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的信号图分别如图10、图11、图12所示。实施例1的检测方法相较于对比例4可以明显改善分析物茶碱、二羟丙茶碱和多索茶碱的峰形。

向牛血清中添加混标，茶碱、二羟丙茶碱、多索茶碱浓度依次为20μg/mL、10μg/mL、10μg/mL。以牛血清为稀释液依次对牛血清混标液按1:1等比稀释，共6个浓度梯度，采用实施例1的方法进行检测。

用数据处理软件对数据处理，计算并绘制标准曲线，其中，茶碱、二羟丙茶碱、多索茶碱的标准曲线图如图13、图14和图15所示，相关系数R2均大于0.999，满足线性要求。

其中，茶碱的线性范围为：0.1-80μg/mL，二羟丙茶碱和多索茶碱的线性范围均为0.05-40μg/mL。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。