一种植物挥发物的无伤收集及定量分析方法

技术领域

本发明具体涉及一种植物挥发性物质活体收集的方法，具体为一种植物挥发物的无伤收集及定量分析的方法。

背景技术

植物挥发物是指由分子量在100-200之间的烃类、醇类、醛类、酮类、有机酸和含氮化合物等次生物质组合而成的混合物。植物的年龄，生理状态(健康、衰弱、受害)，所处的生长环境(水分、土壤、光照、温度)等都会影响其挥发物的组分。此外，挥发物的浓度在不同个体之间也存在较大差异。植物挥发物除却能进行生理调控以抵御热胁迫，调节植物生长发育外，在植物-昆虫的信息交流中发挥着重要的作用，能引起昆虫的定向行为，如引诱害虫，刺激昆虫的产卵，驱避或阻碍昆虫取食等。寄主植物挥发性物质与昆虫之间的信息交流较为复杂，挥发性物质的组分、浓度对不同昆虫的作用存在较大差异。寄主植物挥发性物质与天牛相互作用的研究，特别是大量的对天牛行为具刺激作用的物质的发现，为天牛引诱剂和驱避剂的开发与合成提供理论支撑，使得天牛害虫的生化调控成为一种可行的策略。

而相关的研究、试验的前提基础是寄主植物挥发性物质的活体收集与定量，植物发性物质的富集现常用的方法主要有：吹扫捕集、液液萃取、水蒸气蒸馈、超临界流体萃取和固相微萃取。为便于野外操作，本文选用动态顶空法进行植物挥发物采集。该方法对样品无须进行高温、高压处理，外在条件限制相对较小，且不会对植株造成损害，在植株自然状态下测定其挥发物成分与含量，更为真实可靠。气相色谱技术是与昆虫相关的化学信息物质鉴定最便捷的方法之一，将其与质谱连接使用，便为气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)。气相色谱-质谱联用技术具有快速定性的优点，因此被广泛的使用于测定植物挥发性物质。因此，在活体植株挥发物的检测分析上应用较为广泛。因此，本发明具有较高的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供的一种植物挥发物的无伤收集及定量分析方法，在不损伤树体的前提下活体收集寄主植物挥发性物质，收集到植物在自然界最真实的挥发性物质的组分、浓度，并且定量分析采集到的挥发性物质的含量；吸附管在使用之后经过洗脱，再活化可以多次使用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种植物挥发物的无伤收集及定量分析方法，包括步骤：

(1)吸附管制作：将定制的一头细一头粗的玻璃试管和200目铁丝网浸泡在色谱级二氯甲烷中半小时，取出置于鼓风干燥箱60℃烘干至恒重；从玻璃试管粗口端放入一片200目细铁丝网至细口端，从粗口端倒入吸附剂200mg后末端再置入一片200目细铁丝网，铁丝网平整展开，吸附剂不晃动漏出即可；

(2)吸附管处理：将制作好的吸附管粗口朝上，细口朝下竖直放置于试管架中，使用移液枪吸取2ml二氯甲烷溶液从吸附管粗口注入，利用重力自然淋洗吸附剂，待管中液体完全滴尽，再次吸取2ml甲醇注入吸附管中，同上操作后注入2ml二氯甲烷。对制作好的的吸附管进行洗脱去除吸附剂中吸附的杂质；将洗脱后的吸附管置于鼓风干燥箱200℃烘干至恒重。

(3)闭合气路连接：选取所需进行挥发物收集的植株，按照大气采样仪——活性炭吸附管——过滤吸附管A——植物样品——待采集植物样品吸附管 B——大气采样仪连接成闭合回路；使用聚乙二烯采集袋包裹笼罩待采集植物样品，置入过滤吸附管两根，其中一个吸附管A粗口外接活性炭吸附管后接入大气采样仪出气口，另一个吸附管B细口连接于大气采样仪进气口，所有连接采用医用硅胶管。枝干与采集袋之间铺填一层脱脂棉，再使用止血橡胶皮管捆扎至采集袋密闭不漏，再将袋内残余空气抽干后注入过滤后的空气；

(4)挥发性物质收集：对待测植物是用大气采样仪以100mL/min的速率进行抽提采样，采样时间持续3～4小时，正午阳光暴晒时注意适当遮阴防止采集袋内植株因暴晒过热受损；收集完成后，立即取下吸附管B，封口膜封口，锡箔纸包被，避光保存，并尽快洗脱；所采集的植物样品沿采集袋捆扎口剪下，置于鼓风干燥箱103℃烘干至恒重，得到样品质量；

(5)挥发性物质洗脱，淋溶液收集：将吸附管置于试管架上，粗口朝上，细口下接2mL气相样品瓶，使用封口膜包裹吸附管与样品瓶口，分别使用300 μL二氯甲烷溶液从吸附管粗口滴入淋溶洗淋吸附管中的化学物质；待淋溶完成后再滴入200μL二氯甲烷溶液，重复二次；洗淋结束后密封保存于-20℃冰箱中；

(6)内标物添加：每700μL淋洗液中加入50μL的2-辛醇内标(浓度 400mg/L)；

A样品——样品的相对百分比或峰面积

A内标——内标物的相对百分比或峰面积

(7)GC-MS上机测试：取0.2μL淋洗液，以液体进样的方式，插入GC-MS 进样器，按照需要的升温程序进行分析测定。

吸附管A和吸附管B的细口端均设有吸附口，所述吸附口包括粗吸附口和细吸附口。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

在不损伤树体的前提下活体收集寄主植物挥发性物质，收集到植物在自然界最真实的挥发性物质的组分、浓度，并且定量分析采集到的挥发性物质的含量，富集、测定效率高。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的植物挥发物的无伤收集及定量分析方法，其较佳的具体实施方式是，，包括步骤：

(1)吸附管制作：将定制的一头细一头粗的玻璃试管和200目铁丝网浸泡在色谱级二氯甲烷中半小时，取出置于鼓风干燥箱60℃烘干至恒重；从玻璃试管粗口端放入一片200目细铁丝网至细口端，从粗口端倒入吸附剂200mg后末端再置入一片200目细铁丝网，铁丝网平整展开，吸附剂不晃动漏出即可；

(2)吸附管处理：将制作好的吸附管粗口朝上，细口朝下竖直放置于试管架中，使用移液枪吸取2ml二氯甲烷溶液从吸附管粗口注入，利用重力自然淋洗吸附剂，待管中液体完全滴尽，再次吸取2ml甲醇注入吸附管中，同上操作后注入2ml二氯甲烷。对制作好的的吸附管进行洗脱去除吸附剂中吸附的杂质；将洗脱后的吸附管置于200℃鼓风干燥箱30分钟快速活化。

(3)闭合气路连接：选取所需进行挥发物收集的植株，按照大气采样仪——活性炭吸附管——过滤吸附管A——植物样品——待采集植物样品吸附管B——大气采样仪连接成闭合回路；使用聚乙二烯采集袋包裹笼罩待采集植物样品，置入过滤吸附管两根，其中一个吸附管A粗口外接活性炭吸附管后接入大气采样仪出气口，另一个吸附管B细口连接于大气采样仪进气口，所有连接采用医用硅胶管。枝干与采集袋之间铺填一层脱脂棉，再使用止血橡胶皮管捆扎至采集袋密闭不漏，再将袋内残余空气抽干后注入过滤后的空气；

(4)挥发性物质收集：对待测植物是用大气采样仪以100mL/min的速率进行抽提采样，采样时间持续3～4小时，正午阳光暴晒时注意适当遮阴防止采集袋内植株因暴晒过热受损；收集完成后，立即取下吸附管B，封口膜封口，锡箔纸包被，避光保存，并尽快洗脱；所采集的植物样品沿采集袋捆扎口剪下，置于鼓风干燥箱103℃烘干至恒重，得到样品质量；

(5)挥发性物质洗脱，淋溶液收集：将吸附管置于试管架上，粗口朝上，细口下接2mL气相样品瓶，使用封口膜包裹吸附管与样品瓶口，分别使用300μL 二氯甲烷溶液从吸附管粗口滴入淋溶洗淋吸附管中的化学物质；待淋溶完成后再滴入200μL二氯甲烷溶液，重复二次；洗淋结束后密封保存于-20℃冰箱中；

(6)内标物添加：每700μL淋洗液中加入50μL的2-辛醇内标(浓度400mg/L)；

A样品——样品的相对百分比或峰面积

A内标——内标物的相对百分比或峰面积

(7)GC-MS上机测试：取0.2μL淋洗液，以液体进样的方式，插入GC-MS进样器，按照需要的升温程序进行分析测定。

洗脱过程中，洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。吸附剂选用Paropak Q，为高分子吸附剂。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。