一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法

技术领域

本发明涉及分子生物试验技术领域，尤其涉及一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法。

背景技术

随着分子生物学技术的发展，包括药物研发、遗传病和感染性疾病诊断、基因研究、聚合酶链式反应(PCR)和杂交试验都需要大量的DNA片段，这些DNA片段大都需要人工合成。DNA合成的片段常常有不同的表述方法，比如寡核苷酸、PCR引物、接头、探针、短链引物和长链引物等。

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法，目前主流的引物合成仪有Dr.Oligo、MerMade、ABI3900和Oligo Maker等，所有这些合成仪均采用间歇反应釜的方法，即每一步反应将反应试剂通过加液泵或惰性气体压力的方式，这种方法使试剂进入反应载体的孔隙主要靠渗透作用，效率很低，时间较长。

如附图说明中图2所示，每个步骤加试剂的动作，会使反应载体不断旋转，降低了合成试剂在孔隙中流动的效率，同时由于液体是由上向下流动，在管壁效应的作用下，每个孔隙的反应条件是不同的，这样就造成了反应的不均一性。为了提高反应的程度和收率，只能通过增加反应时间和加入过量的反应试剂，但这样不经造成了各种反应试剂的浪费，增加了化学废液的总量，而且并没有从根本解决问题。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法。

本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法，包括以下步骤：

S1：一次混合反应：自动合成引物过程中，将反应试剂通过加液的泵体输入至预反应使用的混合器中，接着将试剂利用加热恒温器预热后，再经泵体由反应器中反应柱的底部根据设定的稳定流速经过反应柱进行反应，然后将反应柱反应后的试剂再投入至混合器中进行循环的反应处理，通过分析或设定的时间，多次反应后停止循环，试剂进行排放，反应进入下一个阶段；

S2：进样混合模式：S1中的加入混合器中的步骤为进样混合，利用多种试剂按照投放顺序，通过计量泵投入至混合器中，其中投放量均可控；

S3：循环流模式：S1中的混合器和反应器之间的循环反应步骤，利用混合器中试剂进入反应器反应后，再投入至混合器中，每次循环都经过加热恒温器预热反应；

S4：往复逆流模式：在进行循环反应过程中，往复逆流模式通过泵体的往复输入方向变化，将反应试剂和循环试剂之间往复在反应器和混合器之间，在反应器和混合器的每次交流过程中均需要通过恒温器加热；

S5：循环流模式：在进行循环反过程中，循环流模式为试剂通过进入反应器后，直接注入至混合器中，不通过泵体输出至混合器中，直至反应结束后废液排出，进行下阶段试验。

作为本发明中进一步方案，所述S1中反应试剂投入使用的泵体为计量泵，可精准计量投入量，便于分子生物试验中不同试剂的计量投入作业。

作为本发明中进一步方案，所述S1中的混合器和反应器之间的连接泵体为恒流泵，其可顺逆向实现试剂运输。

作为本发明中进一步方案，所述S1-S4中的加热恒温器为套管式结构，且加热恒温器固定于混合器和反应器之间的连接管道外壁上。

本发明中的有益效果为：

1、本自动合成引物方法通过这种逆流、循环、连续流并预热的方式，使反应更充分，清洗更彻底，每个合成步骤更高效，提高了合成产物的纯度，突变率更低；

2、本自动合成引物方法的合成效率更高，降低了生产时间，缩短了产品交付周期；

3、本自动合成引物方法大大降低了试剂的使用量，化学废液的总量也大大降低，更环保；

4、本自动合成引物方法为全自动合成工艺，无需人工干预，节省了人工成本，同时由于试剂量的降低，使的生产成本更低。

附图说明

图1为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的总体流程示意图；

图2为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的传统方式试剂投入示意图；

图3为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的进样混合模式示意图；

图4为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的循环流模式示意图；

图5为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的往复逆流模式示意图；

图6为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的循环流模式示意图；

图7为本发明提出的一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法的固相亚磷酰胺三酯法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1和图3-6，一种基于分子生物试验用的自动合成引物的方法，包括以下步骤：

S1：一次混合反应：自动合成引物过程中，将反应试剂通过加液的计量泵输入至预反应使用的混合器中，接着将试剂利用加热恒温器预热后，再经恒流泵由反应器中反应柱的底部根据设定的稳定流速经过反应柱进行反应，然后将反应柱反应后的试剂再投入至混合器中进行循环的反应处理，通过分析或设定的时间，多次反应后停止循环，试剂进行排放，反应进入下一个阶段；

S2：进样混合模式：S1中的加入混合器中的步骤为进样混合，利用多种试剂按照投放顺序，通过计量泵投入至混合器中，其中投放量均可控；

S3：循环流模式：S1中的混合器和反应器之间的循环反应步骤，利用混合器中试剂进入反应器反应后，再投入至混合器中，每次循环都经过加热恒温器预热反应；

S4：往复逆流模式：在进行循环反应过程中，往复逆流模式通过恒流泵的往复输入方向变化，将反应试剂和循环试剂之间往复在反应器和混合器之间，在反应器和混合器的每次交流过程中均需要通过恒温器加热；

S5：循环流模式：在进行循环反过程中，循环流模式为试剂通过进入反应器后，直接注入至混合器中，不通过恒流泵输出至混合器中，直至反应结束后废液排出，进行下阶段试验。

反应试剂投入使用的泵体为计量泵，可精准计量投入量，便于分子生物试验中不同试剂的计量投入作业。混合器和反应器之间的连接泵体为恒流泵，其可顺逆向实现试剂运输。加热恒温器为套管式结构，且加热恒温器固定于混合器和反应器之间的连接管道外壁上。

参照图7，目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法，具体步骤如下：

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成方向是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如下：

第一步，脱保护基(Deblocking)，将被固相载体（CPG，树脂等）上保护的活性基团与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

第二步，活化(Activation)，将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；

第三步，连接(Coupling)，亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基；

第四步，带帽(Capping)，缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的；

第五步，氧化(Oxidation)，缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

本发明中，化学连续流的方法引入到引物合成的工艺中，并创新的采用逆流、循环、连续流并预热的方式，在每一步反应中，将反应试剂先通过加液泵加入到预反应器中进行混合，然后通过加热恒温套管预热后，经稳流输送泵由反应柱的底部由设定的稳定流速经过反应柱进行反应。

本基于分子生物试验用的自动合成引物的方法很好的解决了原来试剂进入反应载体的孔隙效率低，时间长且反应不均一的问题，同时反应试剂在经过反应柱后再次进入预反应器，并经同一路径再次进入反应柱进行循环反应。通过分析或设定的时间，停止循环，试剂进行排放，反应进入下一个阶段。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。