一种铁基金属有机骨架材料固定过氧化物酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环保领域，具体涉及固定化酶的制备方法与其在去除双酚A领域中的应用。

背景技术

双酚A(Bisphenol A,BPA)，作为一种典型的环境内分泌干扰物，在环境中特别是各类水体中被频繁检出。BPA不仅能干扰生物体的神经系统和内分泌系统，还具有疏水性、低挥发性和难降解性等特点。常见的双酚A处理方法有物理法、化学法以及生物法。物理法主要是吸附法和膜分离法，虽然方便但仅仅是物质的转移，没有从根本上去除污染物。化学法主要有光催化、电化学、Fenton法等，需要耗费较多能源，且生成的中间产物可能毒性更大，造成环境的二次污染。相比之下，生物酶法具有高化学选择性、区域选择性和立体选择性等优势，可以更高效绿色的降解双酚A。然而，酶在工业应用中常常受到操作稳定性低、回收困难等限制，因此需要固定化酶技术。酶固定化的载体，如多孔碳材料、溶胶-凝胶基质、水凝胶、聚合物微球、介孔磁性材料和介孔二氧化硅等，存在着孔径尺寸不可控、酶易变性及浸出等缺点。金属有机骨架材料(metal organic frameworks,MOFs)是一种由金属离子和有机配体通过络合作用自组装形成的晶态多孔材料，因其具有超高的比表面积、高的孔隙率以及孔隙、功能可调等优点，成为一种新兴的固定化酶材料。

MIL-88B(Fe)是一种性能优良的铁基MOF，相比于其他MOF材料，铁离子的存在可以促进辣根过氧化物酶的催化活性；而MIL-88B(Fe)相比于其他铁基MOF，又具有更优秀的水稳定性，可以更有效的去除水环境中的双酚A。本发明通过共价固定法将辣根过氧化物酶(HRP)固定在MIL-88B(Fe)上，以实现水环境中双酚A的高效绿色降解。

发明内容

本发明的目的是提供一种可重复使用的降解双酚A的环保功能材料。通过EDC/NHS体系将辣根过氧化物酶共价固定在MOF材料上，使酶具有更好的稳定性，并且可以实现多次利用，降低处理污水的成本。

本发明的目的通过下列技术方案实现：

一种铁基金属有机骨架材料固定过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将氯化铁和对苯二甲酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并进行加热反应；将反应后的溶液进行离心，得到滤渣，并用乙醇清洗，清洗后的固体进行真空干燥，得到MIL-88B(Fe)；

(2)将步骤(1)所得到的MIL-88B(Fe)，与EDC、NHS和辣根过氧化物酶溶液搅拌反应，反应产物进行离心，并用去离子水清洗，再经真空干燥，得到固定化酶材料MIL-88B(Fe)/HRP。

优选地，所述步骤(1)中氯化铁和对苯二甲酸的质量比为(0.5～0.9):(0.1～0.4)，对苯二甲酸与DMF的质量体积比为(0.1～0.4)：(30～80)g/ml。

优选地，步骤(1)中所述加热反应的温度为100～150℃，反应时间为1～24h。

优选地，步骤(1)中所述真空干燥的温度为25～100℃，真空干燥的时间为5～24h。

优选地，步骤(2)中所述MIL-88B(Fe)与EDC、NHS的质量比为(1～10)：(1～40)：(1～40)。

优选地，步骤(2)中所述MIL-88B(Fe)与酶溶液的质量体积比为(1～10)：(2～10)g/ml，酶溶液的浓度为0.02～0.2mg/ml。

优选地，步骤(2)中所述搅拌反应的时间为0.5～24h。

优选地，步骤(2)中所述真空干燥的温度为25～35℃，真空干燥的时间为5～24h。

所述铁基金属有机骨架材料固定过氧化物酶在降解双酚A中的应用。优选地，降解体系中含有聚乙二醇、固定过氧化物酶(0.02-0.10g/L)以及双酚A(10-100mg/L)，在15-55℃条件下降解。更优选地，降解温度为25～35℃，降解时间3-4h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明产品具有良好的活性保留，在将辣根过氧化物酶(HRP)通过共价法固定化之后，其能够保留65％左右的相对活性。EDC/NHS交联体系具有无毒、生物相容性良好的特点，可以更好的保留酶活。

(2)本发明产品具有比游离酶更好的温度稳定性和贮存稳定性。说明MIL-88B(Fe)的骨架对于过氧化物酶空间结构有一定的保护作用，可以减少酶因环境变化而导致的构象改变从而失活。

(3)本发明产品具有优秀的双酚A去除能力，在聚乙二醇(PEG)存在的情况下，固定化酶材料1h内对双酚A去除率可以达到99.2％。亲水剂聚乙二醇可以防止降解后的产物附着在酶上，堵塞酶的活性位点而引起酶的失活，引入后可使得材料更高效的去除双酚A。

(4)本发明相比于游离酶，可以实现多次重复利用，大大降低了处理废水的成本。

附图说明

图1为MIL-88B(Fe)及MIL-88B(Fe)/HRP的热稳定性图。

图2为MIL-88B(Fe)及MIL-88B(Fe)/HRP的贮存稳定性图。

图3为MIL-88B(Fe)/HRP的回用性图。

图4为MIL-88B(Fe)/HRP在不同固定化酶投加量下对双酚A的降解效果图。

图5为MIL-88B(Fe)/HRP在不同双酚A初始浓度下的降解效果图。

图6为MIL-88B(Fe)/HRP在不同温度下对双酚A的降解效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1-3为固定化酶性能实验，4-6为双酚A降解实验：

实施例1

一种铁基金属有机骨架材料固定过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取0.7563g的氯化铁和0.2314g对苯二甲酸，溶解在60mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌均匀。

(2)将步骤(1)所述溶液放入反应釜中并移至烘箱恒温加热反应，加热温度为150℃，加热时间为12h。

(3)将步骤(2)中反应后的溶液进行离心，得到滤渣，并用乙醇进行数次清洗。

(4)将步骤(3)中清洗后的固体放入到真空干燥箱中60℃干燥24h，得到MIL-88B(Fe)材料。

(5)称取10mg步骤(4)中所得到的MIL-88B(Fe)固体，与10mg的EDC、5mg的NHS和10mL浓度为0.05mg/mL的酶溶液搅拌反应4h。

(6)将步骤(5)中反应得到的混合物进行离心，并用去离子水进行数次清洗，得到固定化酶材料MIL-88B(Fe)/HRP。

(7)将步骤(6)中得到的固定化酶材料放入真空干燥箱中30℃干燥12h。

将MIL-88B(Fe)以及MIL-88B(Fe)/HRP浸泡于25-60℃条件下1h，测定浸泡前后的活性，并以最高活性作为100％，计算不同温度下固定化酶以及游离酶的相对活性。

如图1所示，MIL-88B(Fe)/HRP的热稳定性在30-60℃均高于游离酶，这是由于MIL-88B(Fe)的刚性骨架与酶之间的相互作用，保护HRP的空间构象不受环境温度改变，防止酶失活。

实施例2：将游离酶溶液以及MIL-88B(Fe)/HRP放置于4℃条件下30天，每隔3天测定游离酶和固定化酶的活性，并以最高活性作为100％，计算随着贮存时间变化，固定化酶以及游离酶的相对活性变化。

如图2所示，MIL-88B(Fe)/HRP的贮存稳定性在30天期间远远高于游离酶，这是由于共价固定后，材料对酶起到保护作用，可以防止酶因时间原因而导致的构象变化从而失活。

实施例3：将MIL-88B(Fe)/HRP用于双酚A降解后，用离心法清洗。之后，在相同实验条件下，材料在新的反应介质中重复使用。测定每次循环后的活性，并以最高活性作为100％，计算不同循环次数下固定化酶的相对活性。

如图3所示，固定化酶材料在经过5次循环后，仍具有超过50％的活性，可以证明本发明产品具有良好的回用性，为其在污水处理工业应用中提供了可能。

实施例4-6：50mL体系中，含有聚乙二醇和固定化酶(0.02-0.10g/L)以及双酚A(10-100mg/L)，在不同温度(15-55℃)条件下降解3-4h。在特定的时间间隔，用注射器采集样品，用0.22微米膜过滤器过滤。然后用比色法(4-氨基安替比林)在510nm下测定样品浓度。

其中所述4-氨基安替比林法操作为取1mL样品稀释至25mL，加入0.5mL氯化铵缓冲溶液(pH＝10.7)，1mL2％4-氨基安替比林溶液，1mL8％铁氰化钾溶液，摇匀，10min后于紫外分光光度计λ＝510nm测试。

随着固定化酶初始投加量的增加，双酚A的降解率和降解速率也随之增加(图4)。这是由于初始剂量的增加增强了给定浓度(20mg·mL

表1不同材料固定化酶对BPA的去除率

图5显示了BPA初始浓度的影响，可以看出，在10mg/mL时，MIL-88B(Fe)/HRP对双酚A的降解率最高。值得注意的是，即使在100mg/mL的浓度下，4h内材料的降解率也达到了93.2％，显示了材料的优异性能。

温度对降解的影响如图6所示。从15℃到55℃，去除率呈先升高后降低的趋势，25℃时去除率达到最大值。在15、25和35℃下，降解率相差不大，在45℃和55℃下，降解率较低。这可能与酶在高温下失活有关。与35、45℃相比，25℃时反应的初始降解速率较慢，但最终降解程度较高。造成这一现象的原因是高温条件下，最开始酶活性受到激发，降解速度较快，而随着时间的推移，酶活性逐渐丧失，最终降解能力受到影响。