一种修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，更具体地说，涉及一种修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质基纳米颗粒在自然界中含量丰富，具有遗传和化学改性、单分散、生物相容性和生物可降解性，已广泛应用于生物医药等领域。蛋白基纳米颗粒由蛋白质亚基组成，这些亚基具有可以自发且精确自组装的显著能力。其中，铁蛋白是由24个蛋白亚基自组装形成纳米中空笼状结构，该纳米笼水溶性和稳定性好、尺寸分布均匀、生物相容性好且表面可以通过基因修饰和化学修饰被赋予新的功能，此外，该铁蛋白本身具有天然的靶向性，可与肿瘤细胞表面过量表达的转铁蛋白受体1(TfR1)特异性结合。虽然铁蛋白固有的肿瘤靶向能力使其成为一种较为有效的药物传递载体，但与肿瘤细胞存活相关的机制也十分值得研究，可以通过修饰获得新功能铁蛋白纳米载体，应用于不同抗肿瘤研究领域。

有研究表明，丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)通路(也称为Ras-Raf-MEK-ERK通路)是一种控制细胞增殖和细胞凋亡等活动的高度保守的通路，可以作为一个理想的特异性治疗肿瘤细胞的位点。该通路机制的激活至少需要三个激酶：MAPK；MAPK激酶(MAPKK或MEK)和MAPKK激酶(MAPKKK或MEKK)。因此，MAPK必须与其上游的蛋白激酶MEK相关联，才能发生磷酸化，从而激活MAPK。为了中断MEK与ERK(MAPK的一种)的相互作用，MAPK/ERK激酶(MEK)氨基末端13个氨基酸关联域衍生的MPKKKPTPIQLNP序列，即ERK多肽抑制剂，被证明可以抑制ERK1/2的激活，从而影响癌细胞的增殖、凋亡相关的生理活动。为了进一步提高抑制肿瘤细胞的能力，有必要研究开发具有与肿瘤细胞存活机制相关的新型纳米粒子。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子。本发明所要解决的另一技术问题是提供所述修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子制备方法。本发明最后要解决的技术问题在于提供所述修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子，通过连接序列将ERK多肽抑制剂与铁蛋白C末端连接，所述的ERK多肽抑制剂的氨基酸序列为

进一步地，所述的修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子，其特征在于，所述的连接序列为：

所述的修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

1)构建表达修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子的载体；

2)利用步骤1)所得载体构建工程菌；

3)利用步骤2)所得的工程菌表达并纯化蛋白，即得修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子。

进一步地，所述的修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子的制备方法中，步骤1)中所述载体中表达修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子的核酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述的修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述的应用是将所述的修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子作为疏水抗癌药物的载体。

进一步地，所述的应用包括如下步骤：

A、在HERK蛋白溶液中加入尿素溶液避光孵育；

B、在步骤A所得溶液中加入抗癌药物混合形成混合溶液；

C、将步骤B所得混合溶液置于透析袋中透析除去游离的抗癌药物，透析完成即得包封抗癌药物的修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子。

进一步地，所述的抗癌药物是紫杉醇。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明C端修饰ERK多肽抑制剂MPKKKPTPIQLNP的铁蛋白纳米粒子，具有较强的肿瘤细胞生长抑制作用，不仅能够靶向肿瘤细胞，也能抑制肿瘤细胞的增殖生长，所制得的抗肿瘤药物有着很强的细胞毒性，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例3中HERK蛋白的表征图；A为重组蛋白纯化后的SDS-PAGE图；B为重组蛋白纯化后的透射电镜图；C为HERK蛋白纯化后的体积排阻色谱图；D为HERK蛋白纯化后的圆二色谱图；E为HFtn和HERK的粒径分布图；

图2为实施例4中HERK-PTX的表征；A为HERK-PTX的透射电镜图；B为HERK-PTX的体积排阻色谱图；C为HERK-PTX的圆二色谱图；

图3为实施例5中HERK-PTX和HFtn-PTX紫杉醇纳米药物中紫杉醇的释放曲线；

图4为实施例6中HERK和HFtn对通路关键酶的抑制作用分析；A为处理细胞后的westernblot图；B为关键酶的表达量水平柱状图；

图5为实施例7中的细胞存活率；(A)MDA-MB-231细胞和A549细胞在不同浓度的HERK和HFtn铁蛋白作用下的存活率；(B)MDA-MB-231细胞和A549细胞在不同浓度的HERK-PTX和HFtn-PTX纳米药物作用下的存活率；

图6为实施例8中激光共聚焦、流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞和A549细胞对HERK和HFtn的摄取情况；

图7为实施例9中HERK、HERK-PTX对MDA-MB-231细胞和A549细胞的伤口愈合实验抑制情况；

图8为实施例10中HERK-PTX对MDA-MB-231细胞和A549细胞的细胞凋亡促进情况考察图；

图9为实施例11中HERK-PTX对MDA-MB-231细胞和A549细胞的细胞周期阻滞情况考察图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：HERK重组蛋白的构建

以HFtn编码基因为基础，在其3′端通过连接序列将ERK多肽抑制剂MPKKKPTPIQLNP与铁蛋白C末端连接，连接序列为

将上述质粒热激至大肠杆菌感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性及基因测序等手段筛选出阳性单克隆。

实施例2：HERK重组铁蛋白的表达

将HERK的阳性重组菌，以1％的接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下，210r/min，震荡过夜使菌种活化10-12h。之后，以1％的接种量将活化的菌液加入至400mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，210r/min，培养至菌液OD 600达到0.6-0.8，向培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导培养6h后，于4℃，8000rpm，离心5min收集菌体，弃上清，加入7mL的灭菌水进行重悬清洗，重悬后再次在相同的条件下离心，弃上清收集菌体，再次重悬于7mL Lysis缓冲液(50mM NaH

实施例3：HERK重组铁蛋白的分离纯化

将HERK重悬的菌液超声破碎，超声条件为：超声2s，间歇3s，共超声35min，然后8000rpm离心30min收集上清，上清液结合Ni-NTA初步纯化，再通过体积排阻色谱(SEC)对目的重组铁蛋白进行纯化，得到所述的目的重组铁蛋白HERK。对获得的重组蛋白进行表征，表征结果如图1所示，修饰后的铁蛋白仍然能够形成完整的笼状结构，且HERK的粒径增大。

实施例4：HERK紫杉醇纳米药物的制备

在HERK蛋白溶液中加入终浓度为20.0mM尿素溶液避光孵育2h后，加入紫杉醇溶液混合形成混合溶液，其中，HERK蛋白与紫杉醇的摩尔比为1∶300，4℃缓慢搅拌30-60min，再将所得溶液置于截留值为6-8kDa的透析袋中透析除去游离的紫杉醇和尿素，透析18-24h后取出，离心，上清即为C端修饰ERK多肽抑制剂MPKKKPTPIQLNP的铁蛋白-紫杉醇纳米药物，表征结果如图2所示。取部分上清将pH重新调节至2.0使铁蛋白中的紫杉醇重新释放至溶液中，通过HPLC检测该紫杉醇纳米药物中紫杉醇的含量，计算得出每个蛋白笼中约有36.8个PTX分子被包封，包封率为12.27％。

实施例5：

HERK-PTX紫杉醇纳米药物的稳定性及体外释放研究：

为研究紫杉醇纳米药物的稳定性及体外释放特性，将紫杉醇纳米药物放入透析袋(截留分子量为6-8kDa)中，放入pH 7.4和pH 5.0的PBS缓冲液中37℃孵育，在孵育时间0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、60小时分别取样并通过HPLC对释放的紫杉醇进行定量，紫杉醇释放量＝释放的紫杉醇/紫杉醇的总量，结果如图3所示，紫杉醇纳米药物在pH 7.4下相对稳定，但在pH 5.0下该紫杉醇纳米药物中紫杉醇更容易释放，该结果表明该紫杉醇纳米药物的释放是pH依赖性的。

实施例6：蛋白免疫印迹法(western blot)分析HERK对MAPK/ERK通路的作用：

将MDA-MB-231细胞和A549细胞在6孔板内按每孔30-50万个细胞的密度种板，待细胞在37℃含5％二氧化碳的细胞培养箱内培养24h后，在孔内加入配制好的HERK蛋白溶液和对照组，再放于细胞培养箱内孵育48h，之后弃去上层液体，细胞用胰酶消化后收集，加入100～200μL细胞裂解液在冰上裂解30～60min，再离心保留上清液即为提取的蛋白质溶液，使用10％的SDS-PAGE分离蛋白条带，再将蛋白条带转至PVDF膜上，封闭1h后，分别孵育一抗(兔抗人ERK1/2、兔抗人p-ERK和兔抗人GAPDH)，再孵育二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)，最后滴加ECL化学发光液显色分析。如图4所示，HERK表现出较强的ERK1/2的抑制作用。

实施例7：HERK-PTX紫杉醇纳米药物的体外细胞毒性研究：

为研究紫杉醇纳米药物的体外细胞毒性，将MDA-MB-231细胞和A549细胞以每孔5000个细胞的密度种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，将紫杉醇含量为0.05-10μg/mL的PTX、HFtn-PTX、HERK-PTX加入相同的孔中培养48h，使用PBS洗两遍，加入MTT孵育4h后离心小心除去上清后加入二甲基亚砜，在490nm处测紫外吸收，MDA-MB-231细胞和A549细胞在不同浓度的PTX、HFtn-PTX、HERK-PTX紫杉醇纳米药物作用下的存活率如图5所示，结果表明HERK-PTX表现出较强的细胞毒性。

实施例8：HERK纳米颗粒的体外靶向性研究：

为研究细胞对HERK纳米颗粒的摄取情况，将MDA-MB-231细胞和A549细胞以每孔1×10

实施例9：HERK-PTX紫杉醇纳米药物对肿瘤细胞增殖的影响：

以每孔50万个细胞的密度将MDA-MB-231细胞和A549细胞接种于6孔板中，待37℃培养12h后，用枪头在孔板底部划出伤痕，吸去多余的培养基后加入PBS清洗1次，再加入8μg/mL的PTX、HERK-PTX以及HFtn-PTX处理细胞24h，于显微镜下观察并拍照分析。如图7所示，HERK-PTX对肿瘤细胞的增殖抑制效果最明显。

实施例10：HERK-PTX紫杉醇纳米药物对肿瘤细胞的细胞凋亡的影响：

将MDA-MB-231细胞和A549细胞以50万个细胞每孔的密度接种于6孔板中，于37℃含5％二氧化碳的细胞培养箱内培养24h后，加入8μg/mL的PTX、HERK-PTX以及HFtn-PTX处理细胞48h，收集所有细胞后用PBS清洗3遍后，加入195μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI轻轻混匀，在室温避光孵育10到20min后置于冰浴，通过流式细胞仪检测荧光信号。结果如图8表明，HERK-PTX表现出最明显的促进细胞凋亡的作用效果。

实施例11：HERK-PTX紫杉醇纳米药物对肿瘤细胞的周期的影响：

将MDA-MB-231细胞和A549细胞以100万个细胞每孔的密度接种于6孔板中，于37℃含5％二氧化碳的细胞培养箱内培养24h后，加入10μg/mL的PTX、HERK-PTX以及HFtn-PTX处理细胞48h，弃去上清后用PBS洗3遍，再用胰酶消化后收集细胞，加入500μL体积分数为70％的冷乙醇固定细胞，清洗后加入500μL提前配制染色工作液(以Rnase A：PI为1∶9的比例配制)，室温避光30-60min，使用流式细胞仪检测分析。结果如图9所示，药物组对肿瘤细胞的周期抑制作用均集中在G2/M期。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种修饰ERK多肽抑制剂的铁蛋白纳米粒子及其制备方法和应用

<130> 2021

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 183

<212> PRT

<213> HFtn(Artificial)

<400> 1

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 2

<211> 657

<212> DNA

<213> HERK(Artificial)

<400> 2

atgactaccg catcgacaag tcaggttcgc cagaactacc atcaagatag cgaggccgcc 60

atcaaccgcc agatcaacct ggagttgtat gcttcgtacg tgtatctctc tatgagctat 120

tactttgacc gtgatgatgt tgcgctgaag aactttgcca aatatttcct ccatcagtcg 180

catgaggaac gtgaacatgc agaaaaactt atgaagctgc aaaaccaacg cggcggtcgt 240

atctttcttc aggacattaa aaaaccagat tgcgacgact gggagtcagg tctcaatgca 300

atggagtgtg cgctgcatct ggaaaaaaac gttaaccaga gcctgttaga gcttcacaag 360

cttgcaaccg ataaaaatga cccgcatttg tgcgatttta tcgagacgca ctacctgaac 420

gagcaggtca aagctattaa agaattgggc gaccatgtaa ccaatcttcg caaaatgggc 480

gccccggaaa gcggtctggc ggaatatctg ttcgataagc acacactggg tgattctgat 540

aatgaatccc tcgagcacca ccaccaccac cacgggggcg gcggtagtgg tggcggtggt 600

tctgggggcg gcggtagtat gcccaagaag aagccgacgc ccatccagct gaacccg 657