一种化妆品过敏原的检测方法及过敏原斑贴试剂盒

技术领域

本发明属于化合物检测技术领域，主要涉及化妆品过敏原的检测方法及过敏原斑贴试剂盒。

背景技术

变应性接触性皮炎(ACD)由接触过敏原导致的一种细胞介导的超敏反应，是接触性皮炎(contact denllatitis，CD)临床上最常见的类别。变应性接触性皮炎是典型的IV型超敏反应，接触物为致敏因子。接触物可作为抗原在皮肤接触部位启动免疫反应。再次接触半抗原时，从接触至皮疹出现的潜伏期将比第1次缩短，此时致敏因子仍需先形成半抗原，在于已经特异致敏的T淋巴细胞作用，一般在24-48小时内产生明显的炎症反应。常见的临床症状有瘙痒、水肿、红斑，水疱、大疱等。本病的治疗原则是寻找病因、迅速脱离接触物并积极对症处理，治愈后应尽量避免再次接触致敏原，以免复发。随着人民生活水平的提高，化妆品应用更加广泛，化妆品过敏导致ACD有逐年上升的趋势，根据相关报道证实，化妆品致敏居前三位的成分依次为香料(33.7％)、防腐剂(30.3％)、苯二胺(25.8％)。

斑贴试验(Patch Test)可有效协助完成化妆品过敏源引起的接触性皮炎的临床分析，同时有研究表明，通过斑贴试验诊断过敏原、告知求美者如何避免接触以及对症治疗具有非常明显的益处。斑贴试验是确定接触性过敏患者的致敏原一个简单而可靠的方法。当患者因皮肤或粘膜接触致敏原产生过敏后，在同一致敏原或化学结构类似、具有相同抗原性物质在接触到体表的任何部位，就将在接触部位出现皮肤炎症改变，此即变态反应性接触性皮炎。斑贴试验就是利用这一原理，人为地将可疑的致敏原配置成一定浓度，放置在一特制的检测点并敷贴于人体体表，经过一定时间，根据有否阳性反应来确定受试物是否系致敏原。斑贴试验避免了病人针刺、抽血等创伤性操作，患者无痛苦，并且不需要昂贵的检测设备，不仅有助于确定化妆品致敏原还有助于指导求美者的预防及治疗。

目前针对上述化妆品过敏原成分的主要筛选方法有液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法，但是传统的筛选方法筛选过程过于繁琐，而现有的斑贴诊断技术都是以凡士林作为过敏原检测基质，凡士林几乎不与其他化学物质相溶，与化妆品样品抗原相混合不容易混匀，容易出现抗原分布不均的情况，影响检测结果的准确性，并且传统斑贴法皮肤变态反应的应答时间长，通常需要48—72小时才能观察结果，因此求美者的诊断及治疗时机造成一定程度上的延误，另外，在皮肤斑贴试验中，当皮肤细胞接触到大量外源性物质时，其生理平衡关系将受到影响和改变，进而使其代谢失常、渗透压改变(使细胞肿胀或收缩)，产生一系列的应激性反应，导致诊断干扰，因此，需要在测试过程中保持人体细胞内的钾离子与细胞外的钠离子互相协调，维持体液及组织细胞的生理机能。因此急需建立快速、准确、便捷、安全的个性化化妆品筛选方法。

发明内容

本发明提供一种化妆品过敏原的检测方法及过敏原斑贴试剂盒，其主要目的在于克服现有化妆品过敏原筛选方法繁琐、灵敏度较低、检测时间长、刺激皮肤、检测结果不准确的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

a)将待测化妆品置于斑贴试剂盒内，所述待测化妆品包含致敏物质为香料类、防腐剂类、苯二胺类；所述斑贴试剂盒中斑贴成分按组合物质量百分比含量包括如下组分：

基质1％-90％；

促吸收剂1-30％；

溶剂0-70％

缓冲液0.1-1％；

b)清洁检测点区域皮肤；

c)将步骤a得到已装载样品溶液的斑贴试剂盒包被于步骤b中的已清洁检测点区域皮肤；

d)获取并分析斑贴处理后的皮肤数字图像；

进一步的，所述香料类过敏原为苎烯、苯甲醇、芳樟醇、香茅醇、香叶醇、羟基香茅醛、丁香酚、异丁香酚、α-异甲基紫罗兰酮、铃兰醛、新铃兰醛、已基肉桂醛、苯甲酸苄酯、水杨酸苄酯、肉桂酸苄酯、戊基肉桂醛、肉桂醇柠檬醛、肉桂醛、香豆素；

进一步的，所述防腐剂类过敏原为甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、重氮烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、苯甲酸、山梨酸；

进一步的，所述过敏原为甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮；

进一步的，所述染发成分类过敏原为间苯二酚、甲苯-2，5-二胺硫酸盐、对苯二胺、对氨基苯酚、间氨基苯酚、2-氨基-3羟基吡啶、4-氯间苯二酚、4-氨基-2-羟基甲苯、2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、N，N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐、2-氯对苯二胺硫酸盐、2-甲基间苯二酚、6-氨基间甲酚、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、4-氨基间甲酚、对甲基氨基苯酚硫酸盐、4-硝基邻苯二胺、2，6-二氨基吡啶、6-羟基吲哚、2，7-萘二酚、N-苯基对苯二胺、1，5-萘二酚或1-萘酚；

进一步的，所述基质包括：聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、西黄蓍胶、聚乙二醇、黄原胶、明胶、淀粉、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或几种；

进一步的，所述的促吸收剂包括：甘油、丙二醇、山梨醇、1-正十二烷氮杂环庚-2-酮中、薄荷醇、冰片的一种或几种；本发明中的促吸收剂，其促进抗原透皮吸收的机理为：作用于表皮角质层细胞间脂质，使角质层细胞疏松，细胞间距增大，从而引起角质层外层细胞易于脱落，皮肤角质层变薄，大大降低了皮肤对药物的屏障作用，从而促进抗原的经皮渗透。在本发明中其与体温液化组合基质共同使用，达到相互促进的效果，在大幅缩短检测时间的同时，有效增强检测的敏感性；

进一步的，所述的溶剂包括丙酮、乙醇、水中的一种或几种；

进一步的，所述缓冲液包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠中的一种或几种；本发明中的缓冲液组合物，可有效克服皮肤应激性反应导致的诊断干扰因素，达到维持斑贴试验时受检处细胞内外渗透压平衡及其正常的生理功能和代谢功能的目的，同时还有助于过敏原抗原物质的输送，对检测物质的吸收产生进一步的促进作用；

和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:

1、本发明操作简便、检测时间短、敏感性及结果评估方法更客观准确性更高，移除斑贴时不污染衣物，更适合求美者在筛选化妆品时个性化应用；

2、本发明中基质具有良好的水溶性，相比于传统医用凡士林基质更易与化妆品样品均匀混溶，有更好的透明度。

3、本发明中的促吸收剂，其促进抗原透皮吸收的机理为：作用于表皮角质层细胞间脂质，使角质层细胞疏松，细胞间距增大，从而引起角质层外层细胞易于脱落，皮肤角质层变薄，大大降低了皮肤对药物的屏障作用，从而促进抗原的经皮渗透。在本发明中其与体温液化组合基质共同使用，达到相互促进的效果，在大幅缩短检测时间的同时，有效增强检测的敏感性。

4、本发明中增加了细胞离子缓冲液组合物，达到维持斑贴试验时受检处细胞内外渗透压平衡及其正常的生理功能和代谢功能的目的，可有效克服皮肤应激性反应导致的诊断干扰因素，同时还有助于过敏原抗原物质的输送，对检测物质的吸收产生进一步的促进作用。

5、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明应用组合基质、促吸收剂、缓冲液等相结合的斑贴法基质组合物筛选化妆品过敏原，可改变皮肤屏障层结构，使化妆品过敏原更好地混合并渗透，提高了化妆品过敏原检测速度及检测敏感性，提供了一种个性化的化妆品筛选方法。另外缓冲液组分可维持和保护受检部位的组织细胞的生理功能及正常的新陈代谢，避免应激性反应的发生，减少外源性诊断干扰，保证了皮肤过敏原斑贴试验的准确性。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一种化妆品过敏原的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将待测化妆品置于斑贴试剂盒内，所述待测化妆品包含致敏物质为香料类、防腐剂类、苯二胺类；所述斑贴试剂盒中斑贴成分按组合物质量百分比含量包括如下组分：

基质1％-90％；

促吸收剂1-30％；

溶剂0-70％

缓冲液0.1-1％；

b)清洁检测点区域皮肤；

c)将步骤a得到已装载样品溶液的斑贴试剂盒包被于步骤b中的已清洁检测点区域皮肤；

d)获取并分析斑贴处理后的皮肤数字图像；

具体的，所述香料类过敏原为苎烯、苯甲醇、芳樟醇、香茅醇、香叶醇、羟基香茅醛、丁香酚、异丁香酚、α-异甲基紫罗兰酮、铃兰醛、新铃兰醛、已基肉桂醛、苯甲酸苄酯、水杨酸苄酯、肉桂酸苄酯、戊基肉桂醛、肉桂醇柠檬醛、肉桂醛、香豆素。

所述防腐剂类过敏原为甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、重氮烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、苯甲酸、山梨酸。

所述染发成分类过敏原为间苯二酚、甲苯-2，5-二胺硫酸盐、对苯二胺、对氨基苯酚、间氨基苯酚、2-氨基-3羟基吡啶、4-氯间苯二酚、4-氨基-2-羟基甲苯、2，4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、N，N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐、2-氯对苯二胺硫酸盐、2-甲基间苯二酚、6-氨基间甲酚、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、4-氨基间甲酚、对甲基氨基苯酚硫酸盐、4-硝基邻苯二胺、2，6-二氨基吡啶、6-羟基吲哚、2，7-萘二酚、N-苯基对苯二胺、1，5-萘二酚或1-萘酚。

具体的，所述基质包括：聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、西黄蓍胶、聚乙二醇、黄原胶、明胶、淀粉、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或几种；在斑贴试剂盒中斑贴成分按组合物中以质量百分比计，所述基质的含量可以为1％-90％，优选为25-85％，更优选为35-80％，进一步优选为45-78％；

具体的，所述的促吸收剂包括：甘油、丙二醇、山梨醇、1-正十二烷氮杂环庚-2-酮中、薄荷醇、冰片的一种或几种；并且其按组合物质量百分比配比的含量分别为：1-正十二烷氮杂环庚-2-酮25～30％(优选为30％)、丙二醇25～28％(优选为30％)、薄荷醇20～30％(优选为28％)、冰片25～30％(优选为30％)；

缓冲液中氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠的质量比例为14:1:20。

实施例一

步骤一、选取300名ACD志愿者；

步骤二、将准备好的含不同浓度(包含甲基异噻唑啉酮：0.01％，0.02％，0.03％)本发明斑贴试剂盒各100份，分别包被在志愿者左小臂的受试区域皮肤；

左小臂斑贴试剂盒按质量百分比包括如下组分：

聚乙二醇6000 75％；黄原胶1％；海藻酸钠1％；

甘油20％；

缓冲液(氯化钠：磷酸二氢钾：磷酸氢二钠质量比例为14:1:20)0.6％；余量水

步骤三、准备普通斑贴对照样品,制备方法：加入甘油2％、丙烯酸树脂1％加热至65℃，至温度37℃，调节PH至6，搅拌,加入甲基异噻唑啉酮(0.01％，0.02％，0.03％)各100份，逐一加入普通斑贴小凹槽中，成型，分别包被在志愿者右小臂的受试区域皮肤；

步骤四、用TiVi700偏振光谱相机拍摄测试受试区域皮肤即左小臂(测试组)和右小臂(对照组)照片，同时观察受试区域皮肤有无明显变化(红肿，痒，浸润、丘疹、水疱过敏反应等)，之后每隔一个小时再进行观察及拍摄照片。

注意事项：皮炎急性期不易作斑贴试验，病人应在皮炎完全消退两周后作斑贴试验。必须嘱咐受试者，如发生强烈反应，可随时去掉斑试物。病人受试前两周及受试期间不要内服皮质类固醇激素(强的松15mg/日即可抑制斑贴试验反应)，试验前两天及受试期间宜停用抗组织胺类药物。斑试期间不宜洗澡、饮酒及搔挠斑试部位。应保持斑试物在皮肤上48小时，尽量不要过早地去除斑试物，试验部位要有标记，胶带粘贴一定要密闭，以避免出现假阳性结果。必要时(如高度怀疑对该变应原过敏而72小时呈阴性者)在斑贴后第七天进行第三次观察或重复试验。斑贴过筛试验的同时，不应忽视对患者实际接触的可疑制敏物质进行斑贴试验。

阳性率＝(弱阳性例数+强阳性例数+极强阳性例数)/受试例数*100％

采用本发明的过敏原斑贴试剂盒及筛选方法筛选得到甲基异噻唑啉酮0.01％，0.02％，0.03％斑贴阳性率分别为54％、73％、82％，对照组则红斑微弱不均匀阳性率分别为13％，26％，34％。

实验组ACD患者对于测试组阳性率明显高于普通斑贴盒及测试方法所得结果，说明本发明方法较传统方法更为灵敏；本发明的斑贴盒对于ACD患者安全可靠。

实施例二

步骤一、选取300名ACD志愿者；

步骤二，将准备好的含不同浓度(包含甲基氯异噻唑啉酮：0.1％，0.2％，0.3％)本发明斑贴试剂盒各100份，分别包被在志愿者左小臂的受试区域皮肤；

所述斑贴试剂盒按质量百分比包括如下组分：

明胶45％；卡波姆1％；西黄蓍胶1％；

丙二醇10％；甘油10％；

缓冲液(氯化钠：磷酸二氢钾：磷酸氢二钠质量比例为14:1:20)0.6％；余量水

步骤三、准备普通斑贴对照样品,制备方法：将水与aristoflex AVC 1％浸泡溶胀后，分散，加入戊二醇3％搅拌均匀，调节pH至6，加聚氨酯6％，搅拌均匀，加甲基异噻唑啉酮分别(0.01％，0.02％，0.03％)各100份，逐一加入普通斑贴小凹槽中，成型，分别包被在志愿者右小臂的受试区域皮肤；

步骤四、用TiVi700偏振光谱相机拍摄测试受试区域皮肤即左小臂(测试组)和右小臂(对照组)照片，同时观察受试区域皮肤有无明显变化(红肿，痒，浸润、丘疹、水疱过敏反应等)，之后每隔一个小时再进行观察及拍摄照片。

注意事项同实施例一。

阳性率＝(弱阳性例数+强阳性例数+极强阳性例数)/受试例数*100％

采用本发明的过敏原斑贴试剂盒及筛选方法筛选得到甲基氯异噻唑啉酮0.1％，0.2％，0.3％斑贴阳性率分别为55％、76％、88％，对照组阳性率分别为15％，26％，38％。

实验组ACD患者对于测试组阳性率高于普通斑贴盒及测试方法所得结果，说明本发明方法较传统方法更为灵敏，本发明的斑贴盒对于ACD患者安全可靠。

实施例三

步骤一、选取100名ACD志愿者；

步骤二，将准备好的含1％肉桂醛的斑贴试剂盒包被在志愿者左小臂的受试区域皮肤；所述斑贴试剂盒按质量百分比包括如下组分：

聚乙烯吡咯烷酮60％；黄原胶1％；海藻酸钠1％；壳聚糖1％；

薄荷醇28％；

缓冲液(氯化钠：磷酸二氢钾：磷酸氢二钠质量比例为14:1:20)0.5％；余量水

注意事项同实施例一。

步骤三、准备普通斑贴对照样品,制备方法：将水与丙烯酸树脂交联聚合物1％浸泡溶胀后，分散，加入戊二醇3％搅拌均匀，调节pH至6，加阿拉伯树胶5％，搅拌均匀，加1％肉桂醛，逐一加入普通斑贴小凹槽中，成型，分别包被在志愿者右小臂的受试区域皮肤；

步骤四、用TiVi700偏振光谱相机拍摄测试受试区域皮肤即左小臂(测试组)和右小臂(对照组)照片，同时观察受试区域皮肤有无明显变化(红肿，痒，浸润、丘疹、水疱过敏反应等)，之后每隔一个小时再进行观察及拍摄照片。

阳性率＝(弱阳性例数+强阳性例数+极强阳性例数)/受试例数*100％

采用本发明的过敏原斑贴试剂盒及筛选方法筛选得到1％肉桂醛的斑贴阳性率分别为75％，对照组阳性率为30％。

实施例四

步骤一、选取100名ACD志愿者；

步骤二、将准备好的含香豆素2.5％的斑贴试剂盒的分别包被在志愿者左小臂的受试区域皮肤，所述斑贴试剂盒按质量百分比包括如下组分：

羧甲基纤维素钠60％；黄原胶1％；

1-正十二烷氮杂环庚-2-酮中30％；

缓冲液(氯化钠：磷酸二氢钾：磷酸氢二钠质量比例为14:1:20)0.5％；余量水

注意事项同实施例一；

步骤三、准备普通斑贴对照样品,制备方法：将水与丙烯酸树脂交联聚合物2％浸泡溶胀后，分散，加入戊二醇4％搅拌均匀，调节pH至6，加聚氨脂5％，搅拌均匀，加香豆素2.5％，逐一加入普通斑贴小凹槽中，成型，分别包被在志愿者右小臂的受试区域皮肤；

步骤四、用TiVi700偏振光谱相机拍摄测试受试区域皮肤即左小臂(测试组)和右小臂(对照组)照片，同时观察受试区域皮肤有无明显变化(红肿，痒，浸润、丘疹、水疱过敏反应等)，之后每隔一个小时再进行观察及拍摄照片；

阳性率＝(弱阳性例数+强阳性例数+极强阳性例数)/受试例数*100％

采用本发明的过敏原斑贴试剂盒及筛选方法筛选得到香豆素2.5％斑贴阳性率分别为77％，对照组阳性率均为30％。实验组ACD患者对于测试组阳性率高于普通斑贴盒及测试方法所得结果，说明本发明方法较传统方法更为灵敏安全可靠。

实施例五

步骤一、选取100名ACD志愿者；

步骤二、将准备好的含苯二胺1％的斑贴试剂盒的包被在志愿者左小臂的受试区域皮肤，所述斑贴试剂盒按质量百分比包括如下组分：

羟丙基甲基纤维素50％；卡波姆1％；

丙二醇28％；

缓冲液(氯化钠：磷酸二氢钾：磷酸氢二钠质量比例为14:1:20)0.5％；余量水

注意事项同实施例一。

步骤三、准备普通斑贴对照样品,制备方法：将水与甘油2％、羟丙基二淀粉磷酸酯5％混合均匀后，调节pH至6，搅拌均匀，加苯二胺1％，逐一加入普通斑贴小凹槽中，成型，分别包被在志愿者右小臂的受试区域皮肤；

步骤四、用TiVi700偏振光谱相机拍摄测试受试区域皮肤即左小臂(测试组)和右小臂(对照组)照片，同时观察受试区域皮肤有无明显变化(红肿，痒，浸润、丘疹、水疱过敏反应等)，之后每隔一个小时再进行观察及拍摄照片。

阳性率＝(弱阳性例数+强阳性例数+极强阳性例数)/受试例数*100％

采用本发明的过敏原斑贴试剂盒及筛选方法筛选得到苯二胺1％斑贴阳性率分别为76％，对照组阳性率均为27％。

实验组ACD患者对于测试组阳性率高于普通斑贴盒及测试方法所得结果，说明本发明方法较传统方法更为灵敏安全可靠。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。