四联活菌制剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及四联活菌制剂及其应用。

背景技术

益生菌是指能够改善宿主肠道菌群生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。因此，益生菌在工业、农业、医药、食品和饲料等与人类生活密切相关的重要领域中应用价值很高。近年来，国内外研制出多种益生菌活菌制剂，其基本指导思想就是用人或动物的正常生理菌群的菌株，经过筛选和培养，通过各种途径，制成各种剂型的活菌制剂，然后再以投入方式使其回到原来环境，从而发挥其自然的生理作用。我国对益生菌用于保健食品和药品的研究起步较晚，20世纪90年代才开始将双歧杆菌用于各种保健食品中。目前市场上出现的益生菌保健产品剂型大致分为三类，即胶囊剂，如美常安、聚克、整肠生、贝飞达、丽珠肠乐等；颗粒剂和散剂，如妈咪爱、培菲康、常乐康等；片剂，如促菌生、金双歧、思连康、乳酸菌素等。2001年世界卫生组织的一份报告将益生菌定义为当摄入足够量时对宿主起有益作用的活的微生物，但并未明确指出所述的足够量的具体含量。目前只有少数国家和地区对活菌制剂中益生菌最低含量做出规定，如国际乳业联盟推荐活菌制剂中益生菌数量不得少于10

但目前尚无文件对活菌制剂中益生菌含量的上限做出规定，多数认为益生菌效果随摄入量的增加呈递增趋势，大量现有技术报道，益生菌组合物的活菌含量都均超过了2×10

越来越多的研究证明，益生菌具有免疫调节作用，并能够参与到多种疾病的发生发展过程中。一般益生菌能够定植于肠道，维持肠道菌群的平衡，刺激胸腺、脾脏等免疫器官的发育，活化肠道相关淋巴组织，增强巨噬细胞的吞噬活性，引起体液免疫和细胞免疫应答，调节机体的免疫功能。研究表明，绝大多数疾病的发病率和发病程度都与患病人群的免疫水平有紧密关联。目前我国免疫功能低下的患者的绝对数量居世界首位，免疫系统是人体天然的屏障，当失去了它的保护，或保护作用降低时，人体感染病毒、细菌、真菌等病原体的几率大大增加，同时，当机体免疫力下降时，人体“监视”细胞变异的能力随之下降，导致患癌风险增加。人们为了增强机体免疫力，除了改变原有不规律的生活方式，增加运动外，大部分人群选择服用保健品来提高自身的免疫力。专利CN108310344A中公开了一种可提高免疫力的中药，其中包含黄芪、干姜、党参、杜仲等，其能通过协同增效作用，提高机体免疫力；CN109662278A提供了一种微生物酵素产品，通过将拟青霉菌接种到水果或茶叶等食品中进行发酵培养，形成富含腺苷，具有保健功能的发酵产物，经常食用能够增强机体免疫力。CN109846046A公开了一种提高免疫力的甘露糖-氨基酸复合物，该发明将甘露糖、精氨酸和瓜氨酸的复合物组合在一起，相互促进协调提高免疫力。目前，国内用于免疫力的保健产品多为复方中药，益生菌产品较少，且国内活菌制剂，大多数都是通过单株、双株或者最多三株益生菌联用，例如整肠生为单一的地衣芽孢杆菌单一菌剂；妈咪爱为屎肠球菌和枯草杆菌二联菌制剂；培菲康为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌三联菌制剂；很少有超过四种，产品的使用范围比较狭窄，不能适应更广泛的人群的不同肠道特征，大大限制了益生菌的应用。另外，双歧杆菌和一些菌株都是专性厌氧菌，它们在肠道内定植需要一个缺氧环境，而人体肠道是一个微需氧环境，所以上述的一些杆菌在肠道内定植有困难，因此菌种在肠道内存活性不好，停留时间短，容易排出，使得制剂的疗效受到影响。

因此，包含双歧杆菌和乳杆菌的四联或四联以上的益生菌仍需要进一步开发，以满足更广泛的人群不同肠道的适应，取得更好的疗效具有现实意义。

发明内容

本发明提供了一种复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂能够用于治疗免疫力低下患者，提高患者免疫力。该复合益生菌由嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌以及副干酪乳杆菌组成。该复合益生菌在提高机体免疫力方面具有重要作用，通过本发明设计不同剂量组证明了益生菌并非服用越多效果越明显。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种四联活菌制剂。根据本发明的实施例，所述四联活菌制剂包括：嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌以及副干酪乳杆菌。其中，嗜酸乳杆菌的活菌量不低于1×10

根据本发明的实施例，上述四联活菌制剂还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，活菌占所述四联活菌制剂的质量分数为13％～20％。

根据本发明的实施例，所述四联活菌制剂包括：嗜酸乳杆菌2～4重量份、乳双歧杆菌1～3重量份、鼠李糖乳杆菌0.2～0.4重量份以及副干酪乳杆菌0.5～2.5重量份。

根据本发明的实施例，所述四联活菌制剂进一步包括：益生元。

根据本发明的实施例，所述益生元包括选自低聚果糖、低聚半乳糖、蓝莓果粉、麦芽糊精的至少之一。

所述低聚果糖是一种天然“双歧因子”，能够特异性增殖机体肠道中的双歧杆菌，从而使肠道环境改变为酸性，抑制有害菌的增殖，促进肠道蠕动。此外低聚果糖能够预防肠道感染，促进矿物元素吸收，改善脂质代谢等；低聚半乳糖是益生元的一种，在母乳中含量比较丰富，具有改善腹泻、调节肠道菌群平衡、促进矿物质吸收、提高免疫力等多种功能；麦芽糊精是以淀粉为原料，经酶法工艺控制水解转化而成；蓝莓果粉能改善保健食品的感官性质，完好地保留有效成分的活性，更好地促进人体的新陈代谢。

根据本发明的实施例，所述益生元包括低聚果糖35～45重量份、低聚半乳糖35～45重量份、蓝莓果粉5～15重量份、麦芽糊精95～110重量份。

根据本发明的实施例，所述四联活菌制剂包括：嗜酸乳杆菌3重量份、乳双歧杆菌2.1重量份、鼠李糖乳杆菌0.3重量份以及副干酪乳杆菌1.5重量份。

根据本发明的实施例，所述益生元包括低聚果糖40重量份、低聚半乳糖40重量份、蓝莓果粉10重量份、麦芽糊精103重量份。

根据本发明的实施例，所述活菌制剂的给药剂量为0.2～0.5g/kg.bw，优选0.3g/kg.bw。根据本发明实施例的活菌制剂的给药剂量在0.2～0.5g/kg.bw范围内，相比于高剂量的给药剂量，如0.67g/kg.bw或1.00g/kg.bw，在提高机体免疫力方面具有显著优势。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种四联活菌制剂，所述四联活菌制剂为单剂型，包括嗜酸乳杆菌0.02～0.04g、乳双歧杆菌0.01～0.03g、鼠李糖乳杆菌0.002～0.004g以及副干酪乳杆菌0.005～0.025g。其中，嗜酸乳杆菌的活菌量不低于1×10

根据本发明的实施例，上述四联活菌制剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述四联活菌制剂包括嗜酸乳杆菌0.03g、乳双歧杆菌0.02g、鼠李糖乳杆菌0.003g以及副干酪乳杆菌0.01g。

根据本发明的实施例，进一步包括1.7～2.2g的益生元，例如包括1.931g益生元。

根据本发明的实施例，所述益生元包括低聚果糖0.35～0.45g，低聚半乳糖0.35～0.45g，蓝莓果粉0.05～0.15g以及麦芽糊精0.95～1.1g。

根据本发明的实施例，所述益生元包括低聚果糖0.4g，低聚半乳糖0.4g，蓝莓果粉0.1g以及麦芽糊精1.031g。

本发明提供了一种复合益生菌，其在治疗免疫力低下疾病的应用。该复合益生菌由嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌以及副干酪乳杆菌组成。药效试验表明，该益生菌制剂相比于中剂量(0.67g/kg.bw)和高剂量(1.00g/kg.bw)，低剂量(0.33g/kg.bw)的四联益生菌组合物能更显著提高机体免疫力。本发明提供的复合益生菌、药物制剂中，菌株、低聚果糖、低聚半乳糖、蓝莓果粉及麦芽糊精及药学上可接受的辅料均可由市场购得。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

1材料与市法

1.1样品

四联益生菌粉(包括0.03g嗜酸乳杆菌、0.021g乳双歧杆菌、0.003g鼠李糖乳杆菌、0.015g副干酪乳杆菌、0.4g低聚果糖、0.4g低聚半乳糖、0.1g蓝莓果粉以及1.031g麦芽糊精)，样品性状为浅粉色粉末。实验前取内容物用纯水配制至所需浓度。

1.2试验动物及饲养

SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18g～22g.动物由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(川)2015-030号。饲养在屏障级动物房，许可证号：四川省实验动物管理委员会SYXK(川)2018-011。饲料由成都达硕实验动物有限公司提供，饮水为纯水，整个实验期间动物自由摄食和饮水，动物房温度20℃-26℃，相对湿度40％-70％。

1.3主要仪器与试剂

1.3.1主要仪器

BSA223S电子天平：德国赛多利斯股份公司；

数显游标卡尺：上海塞拓五金工具有限公司；

全波长多功能酶标仪：Thermo公司；

MCO-15AC CO

UV 8100B紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.3.2主要试剂

绵羊红细胞(SRBC)：成都达硕实验动物有限公司；鸡红细胞(CRBC)：采自健康公鸡心脏血；YAC-1细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；氧化型辅酶1：Sigma公司产品；一得阁墨汁：北京一得阁工贸公司；ConA:Sigma公司产品；MTT:Sigma公司产品；补体：10只健康豚鼠的混合血清；小牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司NP-40；Biosharp公司产品；乳酸程：国药集团化学试剂有限公司；PMS：Biosharp公司产品；RPMIl640培养液、双抗：Hyclone公司产品。

1.4药效研究

1.4.1剂量选择及动物分组

Balb/c小鼠(雄)根据体重按分层随机分组原则分为四组。试验设一个对照组(纯水)及0.33g/kg.bw组、0.67g/kg.bw组和1.00g/kg.bw组。各剂量组分别取受试物0.67g、1.33g、2.00g加纯水至40mL。充分混匀后作为各组灌胃液，现配现用。灌胃量均为20mL/kg.bw，每天一次，连续灌胃30天，每周称一次体重。

实验动物共分为4个指标测定组，每个指标测定组均分别包括对照组和受试物三个剂量组，每组11只动物。第一组用于迟发型变态反应、抗体生成细胞与血清溶血素实验，在连续灌胃的第25天，每只小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2mL免疫，继续灌胃4天后，测量左后足跖厚度，测量3次取平均值；然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只20μL。注射后24小时测量左后足跖厚度，测量3次取平均值；之后取眼球血用于血清溶血素实验，最后颈椎脱臼处死动物继续其他指标测定。第二组连续灌胃30天后颈椎脱臼处死动物用于NK细胞活性测定与脾淋巴细胞转化实验。第三组连续灌胃30天后每只小鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液ImL，30分钟后，颈椎脱臼处死，用于腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。第四组连续灌胃30天后从小鼠尾静脉注入4倍稀释的墨汁用于碳廓清实验。

1.4.2脏器/体重比值测定

连续灌胃30天后，称取动物体重，颈椎脱臼处死动物，取出第一组动物的脾脏、胸腺，分别称出脾脏、胸腺重量，计算脏器/体重比值(以mg/10g表示)。

1.4.3细胞免疫功能测定

1.4.3.1迟发型变态反应(足跖增厚法)：计算攻击前后足距厚度的差值，以差值表示小鼠足蹈增厚的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，判断为阳性结果。

1.4.3.2ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验CMTT法)：颈椎脱臼处死动物，无菌取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank's液洗3次，用完全1640培养液配成3x l0

1.4.4体液免疫功能测定

1.4.4.1血清溶血素测定(血凝法)：摘除眼球取血于离心管内，放置l小时，剥离，2000r/min离心10分钟，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100μL，再加入0.5％SRBC悬液100μL，混匀，置湿盒37℃3小时后观察结果，记录每孔的凝集程度。按下式计算抗体积数。受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体积数判为阳性结果。

抗体水平＝(S

式中1，2，3….n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别。

1.4.4.2抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：颈椎脱臼处死小鼠，取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液配成5xl0

1.4.5单核-巨噬细胞功能测定

1.4.5.1小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)：每只小鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1mL，30分钟后，颈椎脱臼处死，将其固定在鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1分钟，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2张载玻片上，置湿盒3 7℃30分钟，取出在生理盐水中漂洗、晾干、固定，4％Giemsa PBS染色3分钟，蒸馏水漂洗晾干，镜检。按下式计算吞噬百分率及吞噬指数。受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组相比差异有显著性，可判为阳性结果。

吞噬百分率(％)＝吞噬红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数*100％

吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞总数

1.4.5.2小鼠碳廓清实验：从小鼠尾静脉注入4倍稀释的墨汁，立即计时，分别于2min、10min从小鼠内眦静脉丛取血20μL，加到含2mL0.1％Na

K＝(logOD

1.4.6NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)

颈椎脱臼处死动物，取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank's液洗3次，用完全1640培养液配成2xl0

NK细胞活性率(％)＝(各反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)*100％

1.5实验数据统计

各实验组与对照组均数比较使用方差分析，若方差不齐采用秩和检验。所用软件为PEMS3.1((中国医学百科全书.医学统计学》统计软件包(第二版)。

2结果

2.1脏器/体重测定结果

2.1.1四联益生菌粉对小鼠体重的影响：在四个指标测定组中，各剂量组与对照组相比，初始体重、中期体重、末期体重及体重增重均无显著性差异(P>0.05)，见表1-表4。

表1四联益生菌粉对小鼠体重的影响(第一指标测定组)

表2四联益生菌粉对小鼠体重的影响(第二指标测定组)

表3四联益生菌粉对小鼠体重的影响(第三指标测定组)

表4四联益生菌粉对小鼠体重的影响(第四指标测定组)

2.1.2四联益生菌粉对小鼠脏器/体重比值的影响：各剂量组与对照组小鼠相比，其脾脏/体重比值均无显著性差异

表5四联益生菌粉对小鼠脏器/体重比值的影响

注：*代表与对照组相比，P＜0.05，以下同。

2.2细胞免疫功能测定结果

2.2.1四联益生菌粉对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响：抗原攻击24小时后，1.00g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度无显著性差异(P>0.05)；0.33g/kg.bw和0.67g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度显著增高(P<0.05)，见表6。

2.2.2四联益生菌粉ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)：各剂量组与对照组小鼠相比，其光密度差值均无显著性差异(P>0.05)，见表7。

表6四联益生菌粉对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

表7四联益生菌粉对小鼠淋巴细胞转化的影响

2.3体液免疫功能测定结果

2.3.1四联益生菌粉对小鼠血清溶血素产生的影响：1.00g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其抗体积数无显著性差异(P>0.05)；0.33g/kg.bw和0.67g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其抗体积数显著增高(P<0.05)，见表8。

2.3.2四联益生菌粉抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：各剂量组与对照组小鼠相比，其抗体生成细胞数均无显著性差异(P>0.05)，见表9。

表8四联益生菌粉对小鼠血清溶血素抗体积数的影响

表9四联益生菌粉对小鼠抗体生成细胞数的影响

2.4单核-巨噬细胞功能测定结果

2.4.1四联益生菌粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响：各剂量组与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均无显著性差异(P>0.05)，见表10。

2.4.2四联益生菌粉小鼠碳廓清实验：0.67g/kg.bw和1.00g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其碳廓清吞噬指数a无显著性差异(P>0.05)；0.33g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其碳廓清吞噬指数a显著增高(P<0.05)，见表11。

表10四联益生菌粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

表11四联益生菌粉对小鼠碳廓清的影响

2.5NK细胞活性测定结果

四联益生菌粉对小鼠NK细胞活性的影响：各剂量组与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均无显著性差异(P>0.05)，见表12。

表12四联益生菌粉对小鼠NK细胞活性率的影响

3小结

分别经口给予小鼠(Ba1 b/c)0.33g/kg.bw、0.67g/kg.bw和1.00g/kg.bw剂量的四联益生菌粉30天后，未见本检品对小鼠体重和增重有不良影响。在小鼠脏器/体重比值测定中，各剂量组与对照组小鼠相比，脾脏及胸腺脏器/体重比值均无显著性差异(P>0.05)。在小鼠迟发型变态反应实验中，抗原攻击24小时后，1.00g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度无显著性差异(P>0.05)；0.3 3g/kg.bw和0.67g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度显著增高(P<0.05)。在小鼠淋巴细胞转化实验中(MTT法)，各剂量组与对照组小鼠相比，其光密度差值均无显著性差异(P>0.05)。在小鼠血清溶血素实验中，1.00g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其抗体积数均无显著性差异(P>0.05)；0.33g/kg.bw和0.67g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其抗体积数均显著增高(P<0.05)。在小鼠抗体生成细胞检测实验中，各剂量组与对照组小鼠相比，其抗体生成细胞数均无显著性差异(P>0.05)。在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验中，各剂量组与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均无显著性差异(P>0.05)。在小鼠碳廓清实验中，0.67g/kg.bw和1.00g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其碳廓清吞噬指数a无显著性差异(P>0.05)；0.33g/kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其碳廓清吞噬指数a显著增高(P<0.05)。在小鼠NK细胞活性测定实验中，各剂量组与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均无显著性差异(P>0.05)。

通常认为，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞、NK细胞活性四个方面任两方面结果呈阳性(显著增强)，即可判定受试样品具有增强免疫力功能作用。在本发明中，四联益生菌组合物能小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能及单核-巨噬细胞功能实验结果呈阳性(显著增强)，因此本发明所提供的四联益生菌组合物具有增强免疫力的功能。此外，本发明还证明益生菌并非摄入越多结果越有效，这为日后益生菌的使用提供了指导作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。