用于光学处理样本的系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年6月10日提交的美国临时申请序列No.62/859,666、于2019年2月1日提交的美国临时申请序列No.62/800,385和于2018年10月8日提交的美国临时申请序列No.62/742,833的优先权，这些申请中的每一个通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明一般而言涉及用于处理样本实体的测定的领域。

背景技术

进行测定的设备通常用于生物化学研究、药物发现、细胞筛选、医学诊断和其它应用的目的，以检测和/或测量样本的一种或多种组分。数字测定是一种将生物样本分到多个较小的容器中使得每个容器包含离散数量的生物实体的测定。例如，数字测定可以用于分析包括单个细胞或其它实体的微流体液滴，诸如用于量化核酸、蛋白质或其它生物学成分。

当前的微流体系统具有许多缺点。例如，常规的微流体数字测定要求在实验期间液滴是单分散的并且具有相同类型(例如，仅是DNA)，以便例如准确地将测量与分析物浓度相关联，并跨不同的液滴比较这种测量。这些设备要求对液滴进行预分选，以确保它们具有合适的均匀尺寸，这既费时又降低了处理液滴的效率。此外，这些设备还包括线性的单轨道微流控通道，液滴在其中串行行进以进行处理，这进一步限制了液滴分析的效率。因而，需要用于处理样本的新的和改进的数字测定系统和方法。

发明内容

一般而言，一种用于处理样本的系统可以包括具有至少一个入口和至少一个出口的腔室，其中该腔室被构造为容纳从至少一个入口朝着至少一个出口的样本流。该系统还可以包括成像器阵列，该成像器阵列被配置为对腔室中的样本流进行成像，其中该成像器阵列包括可与至少一个光源相对地配置的至少一个无透镜图像传感器。在一些变型中，腔室可以被构造为容纳二维样本流，诸如在多个方向上的移动(例如，在腔室的X-Y平面内)。成像器可以包括用于对腔室中的样本流进行成像的无透镜图像传感器的二维阵列。作为另一个示例，成像器可以包括无透镜图像传感器的一维或单行阵列，用于对腔室中的样本流进行成像。通过位于与跨腔室的至少一个光源相对的位置，在一些变型中，成像器阵列可以被配置为生成腔室中的样本流的阴影图像。

腔室可以包括相对的表面，这些表面被偏移以形成接收样本流的间距。例如，腔室可以包括第一表面和从第一表面偏移的第二表面。多个间隔件可以部署在第一和第二表面之间(例如，以强制实施和/或支撑第一和第二表面之间的间距)。第一表面和第二表面中的至少一个可以包括光学透明的材料(例如，聚酰亚胺、玻璃等)。第一表面和第二表面中的至少一个可以通过诸如半导体制造工艺之类的平面处理技术形成。第一表面和第二表面可以被构造为使得样本的至少一部分变平，使得如本文中将更详细描述的，变平的样本或样本实体可以流过腔室。

在一些变型中，该系统还可以包括光源，其中成像器阵列和光源跨腔室彼此相对。成像器阵列可以被嵌入在第一结构中，该第一结构具有与腔室相邻的第一光学透明部分。光源可以被嵌入第二结构中，该第二结构具有与腔室相邻的第二光学透明部分。

一般而言，用于处理样本的系统的另一个变型可以包括腔室，该腔室至少部分地由第一结构和与第一结构相对的第二结构限定，其中第一和第二结构中的每一个具有光学透明的至少一部分。该系统还可以包括被嵌入在第一结构中并且被配置为朝着腔室发射光的至少一个光源，以及被嵌入在第二结构中并且被配置为对腔室进行成像的成像器阵列。成像器阵列可以包括至少一个无透镜图像传感器。成像器阵列可以包括无透镜图像传感器的一维或二维阵列。成像器阵列可以被配置为生成样本流的阴影图像。在一些变型中，第一结构和第二结构可以一体地形成。

腔室可以被构造为在腔室的至少一个入口和至少一个出口之间容纳二维样本流。腔室可以被构造成使样本的至少一部分变平(例如，在相对的第一和第二结构之间)。在一些变型中，可以在第一结构和第二结构之间的腔室中部署多个间隔件。这样的间隔件中的至少一个可以包括将第一结构和第二结构结合在一起的锚定件。例如，在一些变型中，锚定件可以包括焊料、聚合物粘合剂或其它合适的锚定件材料，其可以流入间隔件中的一个或多个通孔中并且邻接第一和第二结构的面对的表面。

在一些变型中，第一结构和第二结构中的至少一个可以包括光学透明层的层叠堆叠。例如，可以通过平面处理来形成第一结构和第二结构中的至少一个。

在一些变型中，样本可以包括至少一种如本文进一步描述的POD。至少一种POD可以包括分析物，诸如细胞、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质和/或酶。附加地或可替代地，至少一种POD可以缺乏或不包括分析物。在使用中，测定系统可以被用于生成PODS及其内容的光学图像，以生成可以从中推导化学和/或生物学信息的信息。

一般而言，在一些变型中，用于处理包括多个颗粒的样本的系统可以包括被构造为容纳样本的腔室，其中该腔室包括被配置为输送足以合并样本中的颗粒的所选择部分的电能的至少一个电极，以及被配置为基于颗粒尺寸分离样本的颗粒的分选布置。例如，在一些变型中，腔室可以包括在腔室的第一和第二相对表面之间延伸的多个电极(例如，可以结合电极功能性提供结构支撑)。腔室可以被构造为容纳二维样本流。此外，在一些变型中，该系统还可以包括被配置为生成该腔室中的样本的一个或多个图像的成像器阵列(例如，包括无透镜图像传感器)，以及被配置为激活至少一个电极以基于样本的一个或多个图像向颗粒的所选择部分输送电能的控制器。

在一些变型中，分选布置可以包括被动分选布置。例如，分选布置可以包括多个间隔件。间隔件可以以交错的阵列布置并且被配置为经由确定性的横向位移来执行颗粒分离。作为另一个示例，腔室可以包括第一出口和第二出口，其中第一出口的尺寸被设置为基本上仅使低于预定阈值颗粒尺寸的颗粒通过，并且第二出口的尺寸可以被设置为使高于预定阈值颗粒尺寸的颗粒通过。附加地或可替代地，腔室可以包括被配置为经由流体动力过滤来执行颗粒分离的多个分支通道。附加地或可替代地，在一些变型中，腔室可以包括主动分选布置(例如，经由主动流体控制、PDEP力等)。

一般而言，在一些变型中，用于处理样本的系统可以包括被配置为容纳样本流的腔室，其中该腔室包括被配置为选择性地将电能输送到样本的至少一部分的至少一个电极、被配置为对腔室中的样本流进行成像的成像器阵列(例如，包括无透镜图像传感器)，以及被配置为基于对一个或多个图像的分析来激活至少一个电极的控制器。

在一些变型中，腔室可以被构造为容纳二维样本流。腔室可以包括多个电极，并且控制器可以被配置为选择性地激活电极对，诸如相邻的电极。被激活的电极可以例如与一个或多个目标颗粒电容耦合，这可以使目标颗粒合并。

在一些变型中，系统还可以包括被配置为基于颗粒尺寸分离样本的颗粒的分选布置。分选布置可以包括被动分选布置。分选布置可以例如包括以交错的阵列布置并且被配置为经由确定性的横向位移来执行颗粒分离的多个间隔件。作为另一个示例，腔室可以包括第一出口和第二出口，其中第一出口的尺寸被设计为仅使低于预定阈值颗粒尺寸的颗粒通过，而第二出口的尺寸可以被设计为使高于预定阈值颗粒尺寸的颗粒通过。附加地或可替代地，腔室可以包括被构造为经由流体动力过滤来执行颗粒分离的多个分支通道。附加地或可替代地，在一些变型中，腔室可以包括主动分选布置(例如，经由主动流体控制、PDEP力等)。

一般而言，在一些变型中，一种用于处理包括多个颗粒(例如，PODS)的样本的方法可以包括：在包括至少一个电极的腔室中接收样本，将样本中的一个或多个颗粒表征为废弃颗粒，通过将电能从至少一个电极输送到废弃颗粒来合并废弃颗粒，并基于颗粒尺寸对样本的颗粒进行分选。在一些变型中，表征一个或多个颗粒可以包括在腔室中接收样本的一个或多个图像，并基于一个或多个图像来表征一个或多个颗粒。一个或多个图像可以包括例如样本的光学阴影图像。

在一些变型中，输送电能可以包括根据驱动波形来激活一对电极。驱动波形可以例如是AC波形。在一些变型中，波形可以具有在大约0.5V和大约10V之间，或者在大约0.5V和大约5V之间的峰-峰电压。此外，在一些变型中，波形可以具有在大约1Hz和1MHz之间，或者在大约50Hz和大约20kHz之间的频率。

在一些变型中，分选颗粒可以包括被动地分选颗粒。例如，可以经由确定性的横向位移对颗粒进行分选。作为另一个示例，可以通过允许第一尺寸的颗粒穿过腔室的第一出口并且允许第二尺寸的颗粒穿过腔室的第二出口来对颗粒进行分选。附加地或可替代地，可以经由流体动力过滤来分选颗粒。

此外，在一些变型中，方法可以被用于处理样本，其中颗粒的至少一部分包含分泌感兴趣物质(例如，抗体、胰岛素等)的一个或多个细胞(例如，CHO细胞、杂交瘤、B细胞、骨髓瘤细胞等)。在这些变型中，表征样本中的一个或多个颗粒可以包括表征一个或多个细胞的分泌水平，诸如通过表征一个或多个细胞中的凝集。例如，缺乏分泌细胞的颗粒和/或含有低分泌细胞的颗粒可以被表征为废弃颗粒，而包括高分泌细胞的颗粒可以被表征为感兴趣颗粒。可以对用于废弃的颗粒和感兴趣颗粒进行分选和分离。例如，分选可以包括将低于阈值尺寸的颗粒分选为感兴趣颗粒(例如，包含高分泌细胞的颗粒)。在一些变型中，可以制备样本，使得每个颗粒平均约有0.1个细胞。

一般而言，在一些变型中，用于使得能够从细胞群中选择感兴趣细胞的系统可以包括包封试剂，其中包封试剂具有大于大约1.0的密度，以及悬浮在水性介质中的第一多个颗粒，其中多个第一颗粒中的每个颗粒都包括对由感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体。在一些变型中，包封试剂可以包括表面活性剂。在一些变型中，表面活性剂包括氟和聚乙二醇中的至少一种。在一些变型中，第一多个颗粒中的每个颗粒可以具有在大约30nm至大约50μm之间的直径。在一些变型中，第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括聚苯乙烯、金、纤维素、胶乳、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、玻璃和磁珠中的至少一种。在一些变型中，通过第一和第二结合配偶体的结合形成第一集群位点。在一些变型中，第一结合配偶体和第二结合配偶体可以是第一蛋白质和第二蛋白质。在这些变型中，第一结合配偶体或第二结合配偶体可以是抗原或抗体。例如，抗体可以是IgG。在一些变型中，第一结合配偶体和第二结合配偶体可以是第一和第二肽。

此外，在一些变型中，系统还可以包括第二多个颗粒，其中第二多个颗粒中的每个颗粒具有第三结合配偶体，该第三结合配偶体对由感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性。在这些变型中，系统还可以包括由第三和第四结合配偶体的结合形成的第二集群位点。

一般而言，在一些变型中，混合物可以包括包封试剂；悬浮在水性介质中的一个或多个第一颗粒，其中每个第一颗粒包括第一结合配偶体；以及具有分泌具有第二结合配偶体的感兴趣蛋白质的至少一个感兴趣细胞的细胞群，其中第一结合配偶体对第二结合配偶体具有特异性。在一些变型中，包封试剂可以包括表面活性剂。在一些变型中，表面活性剂包括氟和聚乙二醇中的至少一种。在一些变型中，包封试剂可以按体积计占混合物的大约60％和90％之间。在一些变型中，一个或多个第一颗粒可以按体积计占混合物的大约5％和20％之间。在一些变型中，细胞群可以按体积计占混合物的大约5％和20％之间。在一些变型中，第一多个颗粒中的每个颗粒可以具有在大约30nm至大约50μm之间的直径。在一些变型中，第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括聚苯乙烯、金、纤维素、胶乳、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、玻璃和磁珠中的至少一种。在一些变型中，混合物还可以包括由第一和第二结合配偶体的结合形成的第一集群位点。在一些变型中，第一结合配偶体和第二结合配偶体可以是第一和第二蛋白质。在这些变型中，第一结合配偶体或第二结合配偶体可以是抗原或抗体。例如，抗体可以是IgG。在一些变型中，第一结合配偶体和第二结合配偶体可以是第一和第二肽。在一些变型中，细胞群可以包括CHO细胞、B细胞、杂交瘤细胞、浆细胞、HEK293细胞、骨髓瘤细胞和T细胞中的至少一种或多种。在一些变型中，一个或多个第一颗粒可以包括一个或多个细胞，并且第一结合配偶体可以包括在一个或多个细胞上表达的抗原。在一些变型中，第一多个颗粒可以包括第二细胞群，并且第一结合配偶体可以包括在第二细胞群上表达的抗原。

此外，在一些变型中，混合物还可以包括多个样本实体，其中每个样本实体包封一个或多个第一颗粒中的至少一个或多个、来自细胞群的至少一个细胞，以及水性介质。在这些变型中，多个样本实体可以是多分散样本实体。

此外，在一些变型中，混合物还可以包括第二多个颗粒，其中第二多个颗粒中的每个颗粒具有第三结合配偶体，该第三结合配偶体对由至少一个感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性。在这些变型中，系统还可以包括由第三和第四结合配偶体的结合形成的第二集群位点。

一般而言，在一些变型中，一种用于制备用于聚类测定系统的样本的方法可以包括：提供具有至少一个感兴趣细胞的细胞群；将细胞群、第一多个颗粒和包封试剂组合以产生混合物，其中多个第一颗粒中的每个颗粒悬浮在水性介质中并且包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体；并且搅拌混合物以产生乳剂，由此将细胞群包封到多个多分散样本实体(例如，PODS)中。在一些变型中，第一结合配偶体和第二结合配偶体可以是第一和第二蛋白质。在这些变型中，第一结合配偶体或第二结合配偶体可以是抗原或抗体。例如，抗体可以是IgG。在一些变型中，第一结合配偶体和第二结合配偶体可以是第一和第二肽。在一些变型中，细胞群可以包括CHO细胞、B细胞、杂交瘤细胞、浆细胞、HEK293细胞、骨髓瘤细胞和T细胞中的至少一种或多种。在一些变型中，第一多个颗粒可以包括第二细胞群，并且第一结合配偶体可以包括在第二细胞群上表达的抗原。

在一些变型中，提供细胞群可以包括稀释细胞群以获得在每毫升大约100000和300000个细胞之间的期望细胞浓度。在这些变型中，期望的细胞浓度可以是每毫升大约220000个细胞。

此外，在一些变型中，将细胞群、第一多个颗粒和包封试剂组合还可以包括添加第二多个颗粒以形成混合物，其中第二多个颗粒中的每个颗粒包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体。在这些变型中，第二结合配偶体和第四结合配偶体可以分别是抗体的第一组分和第二组分。

此外，在一些变型中，乳剂可以由λ值表征，其中λ是多个多分散样本实体中的每个样本实体的细胞数。在这些变型中，λ值可以在每个样本实体大约0和大约10个细胞之间。

此外，在一些变型中，方法还可以包括将乳剂孵育预定的时间长度。在这些变型中，预定的时间长度可以在大约1和大约6小时之间。

一般而言，在一些变型中，一种用于从细胞群中选择至少一个感兴趣细胞的方法可以包括提供具有细胞群和第一多个颗粒的乳剂，其中细胞群和第一多个颗粒被包封到多个多分散样本实体(例如，PODS)中，并且其中第一个多个颗粒中的每个颗粒悬浮在水性介质中并且包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体；测量至少一个样本实体的信号，其中该信号至少部分与第一和第二结合配偶体的结合相关联；至少部分地基于测得的信号来识别至少一个感兴趣细胞。在一些变型中，第二结合配偶体可以耦合到由至少一个感兴趣细胞分泌的感兴趣蛋白质的第一组分，并且其中测得的信号量化至少一个样本实体中的感兴趣蛋白质。在一些变型中，第一多个颗粒可以包括第二细胞群，并且第一结合配偶体可以包括在第二细胞群上表达的抗原。

在一些变型中，乳剂还可以包括包封在多个多分散样本实体(例如，PODS)中的第二多个颗粒，其中第二多个颗粒中的每个颗粒包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体。在这些变型中，信号可以至少部分地与第一和第二结合配偶体的结合相关联，并且可以至少部分地与第三和第四结合配偶体的结合相关联。在这些变型中，第二结合配偶体和第四结合配偶体可以与由至少一个感兴趣细胞分泌的感兴趣蛋白质相关联，并且测得的信号可以量化感兴趣蛋白质对第一结合配偶体或第三结合配偶体的结合亲和力和/或特异性。在这些变型中，测得的信号可以量化从感兴趣细胞分泌的抗体的抗原结合亲和力和/或特异性。

在一些变型中，识别至少一个感兴趣细胞可以包括识别具有大于预定阈值的测得的信号的样本实体的至少一部分。在一些变型中，测量至少一个样本实体的信号可以包括接收至少一个样本实体的至少一个阴影图像，并且基于至少一个阴影图像确定样本实体中至少一个物体的尺寸分数，其中测得的信号至少部分地基于尺寸分数。

此外，在一些变型中，方法还可以包括将乳剂引入到与被构造为生成至少一个阴影图像的成像器阵列相邻的腔室中。

此外，在一些变型中，方法还可以包括从多分散样本实体中移除至少一个感兴趣细胞。在这些变型中，方法还可以包括利用PCR、FACS、DNA测序和ELISA中的一种或多种分析至少一个感兴趣细胞。

附图说明

图1A和1B描绘了用于光学处理样本的测定系统的示例性变型的示意图；

图2A描绘了具有无透镜图像传感器的腔室布置的示意图；

图2B描绘了在图2A的腔室布置中利用无透镜图像传感器获得的示例性阴影图像。

图3描绘了用于光学处理样本的测定系统的示例性变型。

图4A-4D描绘了腔室布置的示例性变型的示意图。图4A描绘了腔室布置的变型的横截面视图。图4B描绘了图4A中描绘的腔室布置的一部分的分解视图。图4C描绘了图4B中描绘的腔室布置的一部分的横截面视图。图4D是图4A中描绘的腔室布置的部分顶部平面图。

图5描绘了图4A中描绘的腔室布置的详细部分横截面视图。

图6描绘了图4A中描绘的腔室布置的另一个详细部分横截面视图。

图7A和7B描绘了腔室布置的另一个示例性变型的示意图。图7A描绘了腔室布置的变型的横截面视图。图7B描绘了图7A中描绘的腔室布置的详细部分横截面视图。

图8A和8B描绘了腔室布置的另一个示例性变型的示意图。图8A描绘了腔室布置的变型的横截面视图。图8B描绘了图8A中描绘的腔室布置的顶部平面图。

图9描绘了用于光学处理样本的测定系统的示例性变型中用无透镜图像传感器拍摄的示例性图像。

图10描绘了用于光学处理样本的测定系统的示例性变型中用无透镜图像传感器拍摄的另一个示例性图像。

图11A和11B描绘了具有无透镜图像传感器的腔室布置的另一个示例性变型的示意图。

图12描绘了示出可以由测定系统执行的示例性测定类型的图表。

图13A提供了检测PODS和PODS中的珠子的计算机视觉技术的示例性图像。图13B是从包括各种尺寸的珠子的样本中检测到的颗粒尺寸分数的分布的说明图。

图14A-14C提供了用于检测含有三种不同蛋白质浓度的样本中的PODS和蛋白质凝集物的计算机视觉技术的示例性图像。图14A是含有浓度为0ng/mL的IgG的PODS的计算机视觉检测的示例性图像。图14B是含有浓度为30ng/mL的IgG的PODS的计算机视觉检测的示例性图像。图14C是含有浓度为480ng/mL的IgG的PODS的计算机视觉检测的示例性图像。

图15A-15C是使用计算机视觉技术检测到的各种蛋白质浓度下PODS的多个参数分布的说明图。图15D是示出在每种蛋白质浓度下检测到的POD数量的说明性条形图。图15E-15H是在各种蛋白质浓度下使用PODS和/或POD特点内的凝集物的一个或多个参数计算的BE分数分布的说明图。

图16A-16D是已经与蛋白质浓度相关的各种BE分数的均值和中位数的说明图。

图17A和17B是与在各种蛋白质浓度下基于蛋白质的测定的精度相关的BE分数的说明图。

图18A提供了包含对照样本的PODS的计算机视觉检测的示例性图像。图18B提供了含有牛血清和960ng/mL兔子IgG样本的PODS的计算机视觉检测的示例性图像。图18C是比较对照样本与960ng/mL样本中POD参数分数的分布的说明图。

图19A描绘了用抗CD45纳米颗粒标记的CD-45+细胞的说明性示意图。图19B提供了含有如图19A所示标记的CD-45+细胞的PODS的计算机视觉检测的两个示例性图像。

图20A提供了含有用锥虫蓝染色的酵母细胞的PODS的计算机视觉检测的示例性图像。图20B是通过计算机视觉检测到的酵母细胞的颗粒计数分数的说明图。图20C是通过计算机视觉检测到的酵母细胞的颗粒尺寸分数的分布的说明图。

图21A-21E图示了用于处理一个或多个PODS的图像并在经处理的图像中识别PODS的示例性方法。

图22描绘了用于在细胞分泌测定中处理样本的另一种方法的说明性示意图。

图23A描绘了用于用电合并来处理样本的示例性方法的流程图。

图23B描绘了制备样本的示例性变型的示例性示意图。

图23C描绘了用于用电合并处理样本的方法的示例性变型的说明性示意图。

图23D和23E图示了用于处理样本的腔室中的分选布置的示例性变型。

图24A描绘了电合并腔室布置的示例性变型的说明性示意图。图24B描绘了图24A中描绘的电合并腔室布置的变型的横截面堆叠的说明性示意图。

图24C描绘了电合并腔室布置和控制器的示例性变型的说明性示意图。

图25A-25C是图示如用本文描述的成像器系统观察到的示例性杂交瘤随时间的生长速率的图像。

图26A和26B是图示如用本文描述的成像器系统观察到分别与低和高IgG浓度相关联的示例性杂交瘤分泌范围的图像。

图27描绘了图示在示例性实验中检测凝集以评估各种孵育期后的杂交瘤分泌范围的图像。

图28A和28B描绘了电合并腔室布置的示例性变型中的电极的另一个变型。

图29A是用于示例性电合并腔室布置和具有B细胞的示例性样本的系统参数的表格。图29B和29C分别是图29A中描述的样本中POD尺寸的实际分布和模型分布。

图30描绘了电合并腔室布置的另一个示例性变型的说明性示意图。

图31描绘了用于用电合并处理样本的系统的示例性变型的说明性示意图。

图32A描绘了当使用单珠测定时可能在POD内部发生的结合相互作用的示意图。图32B示出了图32A的区域的详细放大，示出了单个颗粒。

图33A描绘了当使用双珠测定时在POD内部可能发生的结合相互作用的示意图。图33B示出了图33A的POD的详细放大，并且图33C示出了图33A-33B的POD内的结合相互作用的详细放大。

图34A描绘了示出制备用于单珠聚类测定系统的样本的示例性方法的流程图。图34B描绘了示出制备用于双珠聚类测定系统的样本的示例性方法的流程图。

图35A描绘了从用于单珠测定的细胞群中选择至少一个感兴趣细胞的示例性方法。图35B描述了从细胞群中选择至少一个感兴趣细胞用于双珠测定的示例性方法。

图36A-36C描绘了来自单珠测定的测试的4X物镜显微镜细胞图像。为了证明单珠测定，制备了一批抗小鼠IgG多克隆(pAb)珠(图36A)和两批抗人IgG pAb珠(图36B-36C)以进行单珠测定。图36A-36C示出，当存在10μg/ml的小鼠或人IgG时，所有批次的珠子都示出聚类。每个批次都以无细胞(NC)对照示出。

图37描绘了使用如本文描述的单珠测定执行的测试的图像，该测试被用于评估PODS中分泌小鼠IgG的单个杂交瘤细胞。

图38描绘了使用如本文描述的双珠测定执行的测试的图像，该测试被用于评估PODS中分泌抗原特异性抗体的单个杂交瘤细胞。

图39A描绘了来自使用HB-123细胞系进行的测试的4X物镜显微镜图像，其中预期没有聚合。

图39B-39D描绘了在时间＝0、t＝1小时和t＝3小时的10倍物镜显微镜图像，示出从t＝1小时开始发生了聚类。

图40A描绘了处于打开状态的腔室布置的变型的顶部平面图。图40B描绘了处于关闭状态的图40A的腔室布置的顶部平面图。图40C描绘了沿着线40C：40C截取的图40B中所示的腔室布置的横截面侧视图。

图41描绘了处于打开状态的腔室布置的另一个变型的顶部平面图。

图42A和42B分别描绘了处于部分关闭状态和关闭状态的腔室布置的另一个变型的横截面侧视图。

图43A描绘了使用生物素包被的珠子和抗生蛋白质链菌素缀合的抗体在单珠或双珠测定中使用的第一结合配偶体复合物的示意图。

图43B描绘了使用链霉亲和素包被的珠子和生物素缀合的抗体的用于单珠或双珠测定中的第一结合配偶体复合物的示意图。

具体实施方式

本文描述并在附图中示出了本发明的各个方面和变型的非限制性示例。

一般而言，本文描述了用于处理样本的测定系统和方法的示例性变型。例如，此类系统和方法可以基本上并行地处理样本内的大量实体，诸如以使得能够对样本进行快速实验分析。此外，本文描述的系统和方法可以用于处理尺寸不均匀的多分散实体。一般而言，本文描述的系统和方法可以促进与诊断和/或研究相关的事件或样本特点的测量，诸如凝集、胶体稳定性、细胞生长、细胞表面概况、细胞尺寸概况，和/或蛋白质、抗生素、核苷酸、其它分析物等的浓度分布图。应用可以包括诊断、药物研究、环境研究等。

如下面进一步详细描述的，系统和方法可以例如处理分区的样本。例如，系统和方法可以处理合适的实验分散体，其类型在本文中也称为多分散扁桃体分散体系统(“PODS”)。POD可以在其主体中包括任何合适的实验有用的内容物，诸如细菌或哺乳动物细胞、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、酶和/或任何合适的化学和/或生物学内容物以进行分析。在其它示例中，POD可以包括用于将信号传递给一个或多个图像传感器的试剂，使得PODS可以由软件处理以产生有意义的化学和/或生物信息。PODS可以例如被用于早期检测从哺乳动物细胞分泌的分子，诸如来自杂交瘤或B细胞的IgG。合适的试剂或凝集物可以包括例如用金、乳胶、纤维素、琼脂糖、聚苯乙烯、磁性和/或与生物活性蛋白质或支架结合的其它材料(例如，适用于ELISA试剂盒和凝集测定如细胞表面结合和细胞凝集测定的材料)包被的珠子。此外，在一些变型中(例如，对于具有细胞培养物的样本)，可以将诸如L-谷氨酰胺之类的物质包封在PODS中，以帮助保持细胞存活。此外，在一些变型中，PODS可以包括用作捕获蛋白质或抗体的锚定件的水凝胶或多孔固相或聚合物相。然后可以用对捕获蛋白质特异的样本和与检测催化剂或酶(诸如辣根过氧化物酶、HRP)结合的第二种检测抗体构建夹心型测定。然后可以添加变暗的底物，诸如PCIB。

例如，POD可以包括尺寸在大约10nm至大约50μm之间并涂有生物标记物(例如，抗体)的任何此类珠子。作为另一个示例，POD可以包括尺寸在大约30nm至大约50μm之间的珠子。在本文描述的测定系统中，由此类试剂或凝集物(可以是单分散或多分散的)的自聚合产生的凝集程度可以例如使得能够推断蛋白质和/或分析物的浓度。因此，感兴趣分析物包括但不限于各种化学和/或生物混合物，包括缓冲液、细胞、组织、裂解物、凝集物、聚合蛋白质、药物、抗体、核苷酸、染料和/或包被的颗粒等。本文描述的系统和方法的示例性应用在图12中示出并且在下面进一步详细描述。

在一些变型中，每个POD可以被认为是单独的实验，使得多个PODS的处理使得能够并行地快速且高效地执行多个实验。处理PODS可以涉及但不限于分析PODS的一个或多个特点、跟踪PODS在腔室内的位置和/或预测PODS的轨迹，和/或操纵PODS进行分选。

在一些变型中，POD可以包括水相，该水相被稳定化并且可在诸如液体或其它流体(例如，含有表面活性剂的非水性溶液或脂质，或其混合物)之类的周围介质中运输。在一些变型中，被测定设备处理的POD可以至少部分地与液滴不同，因为POD不是球形的。例如，经处理的POD可能不是球形对称的。经处理的POD可以在一个维度上(例如，在如下所述的大体上正交于电极表面而测得的维度上)小于另一个维度(例如，扁圆)。例如，经处理的POD可以在至少一侧上大体上变平，类似于大体半球形，或者可以在至少两个相对侧上大体上变平，类似于盘状或“薄煎饼”形状。如下面进一步详细描述的，在至少一侧上变平的POD可以具有增加的与测定设备中的测量电极接触的表面积，使得电极测量可以具有降低的噪声以及一般而言改善的信号质量。此外，如下面进一步详细描述的，可以在体积上限制在至少一侧上变平的POD，以便将POD内容物集中到近似于相机的二维焦平面的形状，从而提高了由相机拍摄的POD内容物的可视性。此外，与常规地被认为具有相同尺寸(例如，具有单分散特点)的液滴相反，POD可以与液滴至少部分地不同，因为由测定设备同时处理的多个PODS可以是多分散的。

例如，通过增加表面活性剂浓度或以任何合适的方式，可以将POD压制成扁平形式(例如，通过两个板之间、腔室的相对表面(诸如下面所述的)之间的机械压缩，或其它合适的机构)。

PODS的周围介质可以例如包括非水连续相。在一些变型中，周围介质可以是氟。例如，介质可以包括氟化油或其它液体(例如，由3M

在一些变型中，POD的总密度可以低于周围介质的密度，使得介质内的水性PODS更易浮起并倾向于在周围介质内上升。例如，周围介质可以包括比水更稠的流体，诸如HFE-7500和/或FC-40，可将其与共嵌段聚乙二醇/Krytox

可以将一个或多个PODS与作为乳剂的合适周围介质结合被引入测定设备，并按本文描述的那样进行处理。在一些变型中，混合以产生PODS可以发生在测定设备的外部(例如，在引入设备之前邻近设备入口的外侧)，而在其它变型中，这种混合可以附加地或可替代地发生在测定设备的内部。例如，可以通过搅拌包括生物试剂和氟化液体的两种溶液来生成PODS。此外，较大的PODS可以变换成较小的PODS(例如，通过与如下所述的测定设备中的间隔件相互作用，或与任何其它合适的设备特征相互作用)，以控制或调整PODS之间的多分散性。

测定设备和方法可以用于处理多分散样本实体。例如，与要求样本单分散的常规系统相比，本文描述的设备和方法的各个方面可以使得能够基本上同时处理不同尺寸的PODS。在一些变型中，本文描述的测定设备和方法可以同时处理具有至少5％、至少10％、至少25％或至少50％的尺寸变化(例如，POD直径、POD周长、POD表面积，POD体积等)的样本实体。处置多分散样本的能力可以例如提供更简单、更高效的样本分析(例如，通过不要求在将其引入测定设备之前在单独的耗时的过程中按尺寸对样本实体进行分选)。

本文描述的测定设备和方法的示例性应用包括处理PODS以测量分析物浓度、测量细胞分裂、测量POD或其它样本实体中的细胞(和/或凝集物)或颗粒的形态、尺寸和/或数量、测量细胞与它们被包含在其中的PODS的相对尺寸(例如，POD的周长与POD内的细胞的周长之比)等。例如，所述设备和方法可以用于病理学、肿瘤学、确定白细胞或红细胞计数等。此外，本文描述的测定设备和方法可以用于进行多种凝集试验中的任何一种。

一般而言，如图1A的示意图中所示，在一些变型中，用于处理样本的测定系统100包括具有至少一个入口122和至少一个出口124的腔室120，其中腔室被构造为容纳从至少一个入口朝着至少一个出口的样本流，以及被配置为对腔室120中的样本流进行成像的成像器阵列140。成像器阵列140可以包括可与至少一个光源130相对配置的至少一个无透镜图像传感器。在一些变型中，测定系统100可以包括具有一个或多个泵、阀和/或流体传感器的流体控制系统，以操纵样本流。系统100还可以包括电子系统160(例如，具有一个或多个处理器的PCBA等)，其被配置为控制和/或接收来自测定系统100的其它组件的信号，如下文进一步描述的。在一些变型中，电子系统160还可以包括一个或多个通信组件(例如，蓝牙、WiFi等)，其被配置为将数据(例如，图像数据)传送到网络170，以供一个或多个远程处理器180分析。附加地或可替代地，数据中的至少一些可以由位于电子系统160中的一个或多个处理器分析。

图1B描绘了用于处理样本的系统100的示例性变型的示意图，该系统包括腔室120，腔室120被构造为从耦合到腔室120的入口的储器116接收样本(例如，乳剂)。腔室120可以布置在一个或多个光源130和成像器阵列之间，使得成像器阵列可以产生腔室120内的样本的光学阴影图像。可以使用诸如本文描述的技术来分析图像，可以对样本进行处理(例如，表征并输出到一个或多个废物容器中，诸如储器156和/或其它容器156'(例如，Eppendorf管)。此外，系统100可以包括机器人或自动移液器190，用于抽取样本的可能感兴趣部分以进行进一步的分析或其它处理。

腔室布置

如上所述，测定系统可以包括具有至少一个入口和至少一个出口的腔室，并且可以被构造为容纳从至少一个入口朝着至少一个出口的样本流。一般而言，腔室可以被构造为容纳二维样本流，使得PODS(或样本中的其它实体)可以在腔室的体积内循环(例如，以多向流)。例如，腔室可以包括大体上矩形的体积。在一些变型中，腔室可以至少部分地由第一结构和与第一结构相对的第二结构限定，其中第一和第二结构中的每一个都具有光学透明的至少一部分。在一些变型中，腔室可以至少部分地在柔性印刷电路板(“柔性”电路)上实现。

此外，至少一个光源可以定位在腔室中的样本流的一侧上，并且包括至少一个无透镜图像传感器的成像器阵列可以定位在腔室中的样本流的另一侧(与光源相对)上。在这种布置中，成像器阵列可以被配置为生成由至少一个光源背光照明的腔室内容物的“阴影图像”或通过阴影摄影的图像。关于样本的信息(例如，化学和/或生物学信息)可以从样本的这种阴影图像导出。

在一些变型中，测定设备可以附加地或可替代地包括一个或多个电极，这些电极被配置为测量样本的电子特点(例如，执行可以与例如关于样本的化学和/或生物信息相关的阻抗测量)和/或生成电场以启用介电泳。例如，腔室可以包括与美国专利申请序列No.15/986,416中描述的那些电极相似的电极，该专利申请通过引用整体并入本文。相对于腔室布置的示例性变型，在下面进一步详细描述此类电极的附加示例。

一般而言，如图2A的横截面示意图中所示，腔室布置可以包括具有第一结构210和第二结构212的腔室200，其中第一和第二结构包括光学透明材料并且彼此偏移以形成间隙214或至少部分地限定腔室体积。在一些变型中，第一结构210和第二结构212之间的间距可以由一个或多个间隔件216支撑或强制实施，如本文进一步描述的。间隔件的厚度可以被确定为例如调整腔室高度和/或操作参数，诸如乳剂稳定性、POD流率等。在一些变型中，腔室高度可以至少部分基于PODS的种类或期望被分析的样本。合适的腔室高度可以在例如大约0.1μm至大约200μm之间的范围内。例如，一些PODS可以包括可以使用具有较高高度(诸如25-30μm)的腔室进行最佳分析的细胞，而一些PODS可以包括可以使用较小高度(诸如小于1μm)的腔室进行最佳分析的蛋白质。

第一结构210和第二结构212可以包括利用半导体平面处理技术形成的多层堆叠(例如，通过沉积、溅射、镀覆和/或浸没工艺在基板上添加材料、减去材料以引入构图(诸如利用光刻或其它蚀刻工艺)，或激光限定的成像工艺等)。层可以是连续结构(例如，未构图的薄膜)或不连续结构(例如，具有切口、间隙等的构图的薄膜)。通过利用此类平面处理技术，可以以低成本对形成腔室的结构进行维度缩放。跨平面的可伸缩性使测定设备能够同时成像或检测许多PODS，由此增加分析通量或一段时间内可以检测到的事件总数(例如，PODS或PODS内的反应等)。此外，这些制造技术使得能够精确控制腔室高度、形状和覆盖区域，从而在为各种应用(例如，具有不同POD尺寸的样本类型)定制整体测定设备方面具有灵活性。

光源230可以定位在腔室的一侧上并且被配置为朝着间隙214发射光。具有无透镜图像传感器的成像器阵列240(例如，CMOS成像器)可以定位在腔室的与光源230相对的另一侧，并被配置为对间隙214的区域进行成像。具体而言，无透镜图像传感器可以直接放置在腔室上(或者可替代地用于直接形成腔室的边界)，而在无透镜图像传感器和腔室之间的视线内没有物镜或其它光学聚焦透镜。第一结构210和第二结构212可以包括光学透明材料，使得来自光源230的光可以穿过第一结构210的光学透明部分，穿过间隙214，穿过第二结构212的光学透明部分，并入射在成像器阵列240上。

样本可以在间隙214中流过腔室200，如图2A中表示为穿过间隙214的POD。为了说明的目的，POD可以包括分析物，诸如凝集物，如图2A中所示，但是应当理解的是，POD可以包括其它种类的分析物(或不包括分析物)。当POD在腔室中时，来自光源230的光可以朝着腔室(并且朝着腔室内的POD)发射并且与POD及其内容物相互作用。成像器阵列240可以被配置为检测并成像由这些相互作用引起的光学现象，包括例如阴影、吸收或发射光谱(例如，荧光)、消光系数、光散射等。

例如，图2A图示了其中成像器阵列240被配置为生成腔室中样本流的阴影图像的系统。光源230可以被配置为朝着样本流发射光(例如，可见光)。如图2A中所示，一些光线(例如，光线“A”)可以进入腔室并相对不受干扰地穿过POD的水性部分，这使得POD的水性部分被成像器阵列240成像为明亮的背光区域(例如，图2B中的区域I

图9是在诸如图2A中所示的腔室之类的腔室中的样本流的示例性阴影图像。阴影图像是处理未加工阴影图像的结果，该未加工阴影图像是由无透镜CMOS图像传感器在靠近腔室并与为腔室中的样本流提供背光的光源相对的位置拍摄的。样本流包括穿过腔室的多个多分散PODS。这些PODS中的一些包括直径大约22μm的珠子，其直径近似为循环肿瘤细胞的尺寸，并且可以耦合到抗体。因此，如果珠子存在于POD中，那么珠子具有可以被成像的分析物(或者以其它方式代表可以被类似地成像的另一种分析物)。例如，当POD的内容物还包括与生物标记物(例如，表位、抗原或其它标记物)反应或结合到其的实体时，包括涂有生物标记物的珠子(例如，乳胶、聚苯乙烯、磁性材料、金等)的POD可以在视觉上呈现出与众不同的图案。这种视觉上和/或量化上不同的图案(或图案的改变)可以被用于量化生物标记物。如图9的阴影图像中所示，POD的尺寸和形状基于PODS内变暗图案的外观是可识别和可测量的。此外，某些PODS中珠子的特点是可识别的，诸如珠子的存在、尺寸、形状等。此外，通过跨多个阴影图像随时间分析PODS的外观及其内容物，动态特点(例如，POD内容物的形状和尺寸的移动和/或改变)可以被分析，以提供关于PODS的化学和/或生物性质的附加信息。

图10是在诸如图2A值所示的腔室之类的腔室中的样本流的另一个示例性阴影图像。样本流包括穿过腔室的多个多分散PODS。这些PODS中的一些(例如，PODS 1010)可以包含一个或多个红细胞，而一些PODS(例如，PODS 1020)可以是“空的”，因为它们缺少红细胞或其它分析物。如图9的阴影图像中所示，基于勾勒出PODS的变暗线条的外观，POD的尺寸和形状是可识别的和可测量的。此外，某些PODS中的红细胞的特点是可识别的(例如，红细胞的数量等)。此外，类似于以上关于图9所描述的，通过跨多个阴影图像随时间分析PODS的外观及其内容物，动态特点(例如，POD内容物的形状和尺寸的移动和/或改变)可以被分析以提供关于PODS的化学和/或生物性质的附加信息。

图11A和11B图示了其中成像器阵列被配置为获得腔室中样本流的荧光图像的另一个示例性变型。图11A和11B图示了具有第一结构1110、第二结构1112的腔室布置，该第一结构1110，第二结构1112如之前所描述的那样以间隙1114偏移，并且除了以下描述的之外，其类似于以上参考图2A描述的腔室布置。如图11A中所示，光源1130可以被配置为朝着样本流发射适于诱导荧光或其它发射光谱的光1132。发射的光1132可以例如包括紫外光(UV)。样本流中的至少一些PODS可以包括珠子或生物样本1102或被配置为吸收所发射的光并作为响应而发射(例如，不同波长的)光的其它物质。例如，如图11B中所示，至少一些发射的光可以被POD或其中的内容物吸收，其可以进而发射荧光或其它光发射1134。所发射的荧光可以被成像器阵列1140中的图像传感器的至少一部分成像为荧光图像。可以从这些荧光图像中得出化学和/或生物特性(例如，基于所发射的光的波长、所发射的光的强度等)。

此外，虽然图11A和11B的腔室布置描绘了与发射用于诱导荧光的光的光源1130相对的成像器阵列1140，但是应当理解的是，在其它变型中，成像器阵列1140可以位于光源1130附近任何合适的位置，以便从样本流中捕获荧光或其它发射光谱。例如，成像器阵列1140的至少一部分和光源1130的至少一部分可以彼此正交(例如，一个在腔室1100的侧壁上，另一个在腔室1100的上部结构或下部结构上)。作为另一个示例，附加地或可替代地，成像器阵列1140的至少一部分和光源1130的至少一部分可以彼此相邻(例如，在同一表面上，诸如在上部结构或下部结构上的，以交替或其它分布图案)。

与具有透镜的常规光学系统相比，无透镜成像可以提供几个优点。例如，无透镜图像传感器可以在大视场上提供高分辨率成像。这可以使成像器阵列能够在单个图像帧中成功对腔室中的大量PODS(例如，超过100个或超过200个)进行成像。此外，因为无透镜图像传感器不要求聚焦，所以对光学组件的精确光学对准和定位的需求会减少，从而简化了制造过程并减轻了用户和/或软件调整成像器阵列的焦点的负担。没有透镜也可以减轻透镜中常见的焦距梯度带来的挑战，并降低测定设备的整体零件技术和成本。因而，将无透镜图像传感器结合在腔室布置(诸如本文描述的那些)中可以进一步以低成本启用维度可伸缩性。

腔室、一个或多个光源以及成像器阵列的布置可以以各种合适的方式构造。例如，图3示出了用于处理样本的测定系统300的示例性变型。一般而言，测定系统300可以包括类似于上面描述并且在图1中示出的测定系统100的组件。如图3中所示，测定系统300还包括一个或多个支撑件，其包括基座380和耦合到基座380的光源柱334。基座380可以包括用于接纳腔室32、腔室320下方的成像器阵列(未示出)和/或电子系统360的至少一部分的板或其它合适的稳定表面。例如，基座380可以包括至少一个凹口，该凹口被成形为互补地接纳腔室320、成像器阵列和/或电子系统360。腔室320、成像器阵列和/或电子系统360可以利用紧固件、环氧树脂、互锁配合特征和/或其它合适的特征耦合到基座380。在一些变型中，基座380可以直接或间接地固定到桌面，台面或其它合适的表面(例如，经由基座安装件382，诸如辅助板)。

光源柱334可以安装到基座380(例如，具有紧固件或互锁特征等)。在一些变型中，光源柱334可以是垂直的并且与基座380正交地安装。光源壳体332可以容纳光源(例如，LED，或诸如激光器之类的相干光源，或其它合适的光源)，并且可以(例如，经由夹具或销机构等)耦合到光源柱334，使得光源定位在基座380上的腔室320上方。光源壳体332可以可调整地耦合到光源柱334，从而使得能够调整光源与腔室320的相对位置。例如，可以旋转调整旋钮336以松开将光源壳体332耦合到光源柱334的夹具，使得可以沿着光源柱334垂直地调整光源壳体332。在将光源壳体332定位在期望的位置中后，可以拧紧调整旋钮336以将光源壳体332的位置固定在光源柱334上。在其它变型中，其它合适的机构可以使得能够调整光源壳体(例如，螺纹附件、可插入位于离散高度的孔中的一个或多个销等)。此外，应当理解的是，在一些变型中，可以相对于光源附加地或可替代地调整腔室320的位置(例如，通过移动基座380的位置)。在一些变型中，光源与腔室的相对位置使得从光源发射的光在入射到腔室上并进入腔室时基本被准直。在一个示例性变型中，容纳在光源壳体332中的光源可以包括定位在安装在基座380中的腔室上方约六英寸的距离处的一个或多个白光LED。

在图4A-4D中示出了腔室布置的示例性变型。如图4B中最佳所示，腔室布置包括具有第一、上部结构410和第二、下部结构430的腔室400。例如，如图4A和4C中所示，上部结构410可以包括层压复合材料，包括光学透明层412、构图的结构层416(例如，铜或其它合适的金属)和用于将光学透明层412和结构层416结合在一起的粘合剂层414(例如，丙烯酸粘合剂)。下部结构430可以包括层压复合材料，包括光学透明层434、上部构图的结构层432、下部构图的结构层436，以及分别用于将光学透明层434结合到上部和下部构图的结构层的粘合剂层433和435。下部结构430中的光学透明层、结构层和粘合剂层可以由与上部结构410类似的材料制成。上述光学透明层之一的至少一部分的示例性材料包括聚酰亚胺和玻璃(例如，由

如图4A中所示，一个或多个光源490可以位于腔室体积的一侧上，并且成像器阵列492可以位于腔室体积的与一个或多个光源490相对的另一侧上。例如，一个或多个光源490可以位于上部结构410上方，并被指示朝着腔室体积发射光。在一些变型中，光源490可以是嵌入或放置在上部结构410的层内的LED或其它合适光源，而在其它变型中，光源490可以位于上部结构410的外部。成像器阵列492可以位于下部结构440下方，并被指示以对腔室体积进行成像。在一些变型中，图像阵列492可以包括一个或多个无透镜CMOS图像传感器。可替代地，一个或多个光源490可以位于下部结构430下方，并且成像器阵列492可以位于上部结构上方。此外，虽然腔室400被示出和描述为结构410和430是上部和下部结构，但是应当理解的是，腔室、光源和成像器阵列的朝向可以不同(例如，朝向可以从图4A中所示的角度旋转90度或180度)。

上部结构410和下部结构430可以接合在一起，使得上部结构410提供腔室400的上表面，而下部结构430提供腔室400的下表面，如图4A的朝向所示。例如，上部结构410和下部结构430可以至少部分地通过中间粘合剂层420结合，其中粘合剂层420可以具有通道切口422，该通道切口422为上部结构410和下部结构430之间的腔室体积提供了中央空白空间。配准特征(诸如上部结构410和下部结构430中的每一个中的对准孔470)可以促进结构的对准以形成腔室。

一个或多个间隔件可以位于腔室体积中，以支撑上部结构410和下部结构430之间的间距和/或促进上部结构410和下部结构430的耦合。如图4D的顶部平面图和图4A的横截面视图中所示，一个或多个边界间隔件426可以形成腔室体积的侧壁。例如，边界间隔件426可以是大致椭圆形或矩形形状(例如，可以包括位于腔室的左侧和右侧的线性侧面，如图4D中所示)。此外，一个或多个间隔件柱424可以布置在腔室体积内。在一些变型中，间隔件柱424可以提供柱状支撑以在腔室的上部和下部结构之间形成间距。在一些应用中，间隔件柱424可以附加地起到破坏聚合的PODS、在样本流中引起湍流和/或其它影响腔室中样本流的作用。间隔件柱424可以以规则的阵列(例如，如图4D中所示的矩形阵列，如图24A中所示的交错阵列)或可替代地以不规则的阵列或其它合适的图案分布。

虽然边界间隔件246在图4D中被描绘为细长的线性条，但是应当理解的是，其它形状(例如，波浪条、不规则长度)也可以是合适的。此外，边界间隔件246可以间歇地放置在腔室的侧面上，诸如以在间歇性边界间隔件246之间容纳用于腔室的附加样本入口和/或出口。类似地，虽然间隔件柱424在图4A中被描绘为具有正方形横截面，但是应当理解的是，在其它变型中，间隔件柱424可以具有其它合适的横截面，诸如圆形或三角形。

在一些变型中，间隔件424和/或426可以由上部结构410和下部结构430的构图的结构层形成。例如，上部结构410的构图的结构层416可以邻接下部结构430的构图的结构层432，使得结构层组合形成间隔件424和/或426。在一些变型中，结构层416和432的厚度可以相等，以便每个都提供间隔件的一半高度。在其它变型中，结构层416和432可以具有不同的厚度(例如，结构层416可以比结构层432更厚或更薄)。可替代地，在一些变型中，间隔件424和/或426可以由分层结构的任何组合形成。此外，附加地或替代地，非分层组件(例如，珠子)可以在腔室400的上表面和下表面之间提供间距。

在一些变型中，如图5的详细视图中所示，可以选择相对于上部结构410和下部结构430之间的中间粘合剂层420的厚度的间隔件的高度，以在上部结构410上引入“拉伸鼓”效果，以增强上部和下部结构之间的耦合和/或压缩形成间隔件的构图的层。例如，间隔件424和/或426的高度可以略大于粘合剂层420的厚度，使得一般在腔室体积的边界处将上部结构410向下朝着下部结构430推动。这种“拉伸鼓”效果可以例如帮助将上部结构410和下部结构430压缩在一起并抵靠粘合剂层420，从而形成用于腔室体积的流体密封。在一些变型中，间隔件的高度与粘合剂层420的厚度之间的比率可以在大约2与大约4之间，或者大约3。

此外，如图4A中所示，间隔件中的至少一些可以包括通孔460，该通孔460提供穿过下部结构430的层的通路。通孔460可以提供用于锚定件材料将上部结构410和下部结构420结合在一起的通路。例如，如图4C中所示，可以将锚定件材料462引入到通孔460中以直接结合到上部结构410和下部结构420，从而接合这些结构。在一些变型中，锚定件材料可以是焊料或聚合物粘合剂。在示例性方法中，可以使用具有与通孔对准的开口(或与多个通孔对准的多个开口)的构图的模板来将锚定件材料引入通孔中。在将模板放置在通孔上方之后(例如，在下部结构430的下侧上)，可以在模板上刮擦锚定件材料以迫使锚定件材料进入通孔中。多余的锚定件材料将保留在模板上，并通过移除模板和/或从模板上擦掉而被移除，从而仅将锚定件材料留在通孔中。这种锚定可以作为上述用于结合上部结构410和下部结构420的中间粘合剂层420的补充或替代被使用。

除了上述上部和下部结构410和430之外，在一些变型中，腔室布置还可以包括加固物层450和用于将加固物层450结合到腔室400其余部分(例如，到下部结构430的下侧)的加固物粘合剂层440。加固物层450可以提供用于操纵组件(例如，用于腔室入口和/或腔室出口的端口)和/或将其连接到腔室400的结构支撑。像第一结构410和第二结构430一样，加固物层450和粘合剂层440可以包括参考特征(例如，孔470)以使得能够与其余的堆叠层对准。如图4B中所示，加固物层450可以包括通道切口456，并且粘合剂层440可以包括通道切口442，其中通道切口456和442为完全组装的堆叠中的成像器阵列492提供空间。附加的结构层454(例如，铜或其它金属)也可以结合到加固物层450，以用于进一步的结构支撑。

在图4A中所示的腔室布置的示例性实施例中，上部结构410可以包括单侧覆铜层压复合材料(诸如由DuPont

在图7A和7B中示出了腔室布置的另一个示例性变型。类似于以上关于图4A-4D描述的腔室布置，腔室布置可以包括腔室700，该腔室700包括上部结构710和从上部结构710偏移的下部结构730。如图7A中所示，一个或多个光源750可以位于腔室体积的一侧上，而成像器阵列740可以位于腔室体积的与一个或多个光源750相对的另一侧上。例如，一个或多个光源750可以位于上部结构710上方，并且被指示朝着腔室体积(例如，间隙702)发射光。在一些变型中，光源750可以是嵌入或放置在上部结构710的层内的LED或其它合适光源，而在其它变型中，光源750可以位于上部结构710的外部。成像器阵列740可以位于下部结构730的下方，并且被指示对腔室体积进行成像。在一些变型中，成像器阵列740可以包括一个或多个无透镜CMOS图像传感器。此外，虽然腔室700被示出并描述为结构710和730是上部和下部结构，但是应当理解的是，腔室、光源和成像器阵列的朝向可以不同(例如，朝向可以从图7A中所示的角度旋转90度或180度)。

类似于上述腔室布置，上部结构710和下部结构730可以偏移间隙702。间隙702可以由一个或多个间隔件720支撑或强制实施。类似于图4A中所示的腔室布置中的上部结构，上部结构710可以包括多层堆叠。例如，上部结构710可以包括光学透明材料和粘合剂(例如，聚酰亚胺和丙烯酸粘合剂，或其它合适材料)的层压堆叠。此外，上部结构710可以包括形成一个或多个间隔件720的材料(例如，形成腔室的边界的至少一部分的边界间隔件、位于腔室体积内的间隔件柱)。例如，间隔件720可以包括多个结合层，其包括共同形成间隔件720的铜722、金726和/或其它表面镀层724(例如，化学镀镍浸金或ENIG)。虽然将间隔件720描绘为在上部结构710中包括材料层，但是应当理解的是，形成间隔件720的材料层可以在下部结构730中附加地或可替代地包括材料层。

如图7B中所示，下部结构730可以包括光学透明材料(例如，聚酰亚胺)和一个或多个通孔732。铜层736可以衬垫通孔732。类似于以上参考图4A描述的腔室布置中的通孔，通孔732可以容纳用于将上部结构710结合到下部结构730的锚定件材料734。例如，可以将焊料、粘合剂或另一种合适的锚定件材料沉积在一个或多个通孔732中，并使上部结构710(例如，形成间隔件720的材料)与下部结构730邻接，从而将上部和下部结构固定在一起。

如图7B中所示，腔室700可以包括暴露于腔室体积并与在腔室内流动的样本相互作用的电极760。电极760例如可以大体上布置为阵列。在一些变型中，至少一些电极可以被配置为测量样本的电子特性(例如，阻抗)。附加地或可替代地，至少一些电极可以被配置为生成电场以启用介电泳。如图7B中所示，电极760可以连接到导电迹线762(例如，构图的铜)。此类迹线可以被构图以在平面表面上延伸(例如，相对于图7B的横截面视图进入页面或从页面出来)，并使信号能够往返于电极760传递。换句话说，电极760及其构图的电气垫和迹线可以直接集成并电连接在堆叠内，并且还可以连接到测定设备上或一个或多个外部计算设备上的电子组件(例如，控制器、处理器等)。

在图7A和7B中所示的变型的示例性实施例中，腔室布置可以包括上部结构，该上部结构包括交替的聚酰亚胺和粘合剂层的层压结构。上部结构可以包括具有大约50μm厚度的上部聚酰亚胺层712、具有大约50μm厚度的中间粘合剂层714(诸如由DuPont

在图8A和8B中示出了腔室布置的另一个示例性变型。腔室布置与以上关于图4A-4D以及图7A和7B所描述的布置相似，下面描述附加细节。例如，腔室布置可以包括腔室800，腔室800包括上部结构810和下部结构830，下部结构830与上部结构810偏移间隙802。间隙802可以由一个或多个间隔件柱820和/或边界间隔器821强制实施或支撑。

在图8A和8B所示的腔室布置中，一个或多个光源850和成像器阵列840被嵌入或集成在腔室800的上部和下部结构内。具体而言，腔室800的上部结构810可以包括与粘合剂层814层压在一起的一层或多层光学透明材料(例如，上层812和下层816)。上部结构810还可以包括一个或多个照明层818，至少一个光源850及其导电垫和/或迹线852位于其中。照明层可以包括例如加固物材料，诸如FR4加固物。类似地，腔室800的下部结构830可以包括一层或多层光学透明材料(例如，层830)以及一个或多个成像器层832，成像器阵列840及其导电垫和/或迹线842位于其中。导电迹线852和842可以传递到(一个或多个)电源和(一个或多个)控制器，以操作光源850并将信号传递到成像器阵列840和从成像器阵列840传递信号。例如，导电迹线可以穿过测定设备的电子区域870(例如，部署在腔室800外部的上部结构的外表面上)，如图8B中所示，其中电子区域870可以包括与测定设备的操作相关的组件。合适的组件包括集成电路和被动组件、电源、控制器、处理器、数据发送器和/或存储器等。在一些变型中，电子组件可以处理信号并将结果传送到外部计算设备和/或其它外围设备。

此外，类似于以上所述，可以将包括电极860的电极阵列构图到上部结构810和/或下部结构830上。导电焊盘和迹线862还可以被构图到结构中并且被传递到电子区域870或具有电极控制组件的另一个合适区域。

类似于上述腔室布置，穿过堆叠的部分的通孔可以接收锚定件材料，以耦合上部结构810和下部结构830。例如，上部结构810还可以包括被构图为形成间隔件柱820和/或边界间隔件821的附加层(例如，铜)。间隔件柱820和/或边界间隔件821可以包括通孔，其接收延伸穿过上部结构810的层812-816并穿过间隔件材料并焊接到下部结构830，从而耦合上部和下部结构。

在一些变型中，腔室布置可以包括基板，该基板包括位于不同基板部分上的上部结构和下部结构，基板可以被折叠，使得上部结构和下部结构彼此相对。折叠的基板可以被密封，以在上部结构和下部结构之间形成腔室。在图40A-40C、41和42A-42B中通过示意图描绘了此类腔室布置的示例性变化。

除了关于下面描述的附加细节之外，图40A-40E中所示的腔室布置变型与上述的那些变型(诸如关于图2A和2B、图7A和7B以及图8A和8B的变型)相似。例如，腔室布置可以是单件式流体设备，其包括腔室4000，该腔室4000包括整体形成(例如，从相同的基板上切下或以其它方式从相同的基板(诸如软膜)形成)的第一结构4010和第二结构4012。可以在通过一个或多个柔性铰链4029连接的不同基板部分上形成(例如，利用薄膜技术等沉积)结构。单件式流体设备可以是可折叠的，以在第一和第二表面之间产生密封的流体腔室，其中密封可以在折叠之后通过螺钉、弹簧夹、肘节夹或任何其它合适的机械手段(未示出)施加小的外部夹紧压力来完成。附加地或可替代地，可以通过加热、粘合剂或任何其它合适的密封工艺来密封第一和第二表面。

图40A示出了处于展开状态的单件式流体设备的示例性实施例的顶部平面图，示出了第一结构4010以及在第二结构4012的通道4022中提供的间隔件柱4024。当单件式流体设备处于折叠状态时(如图40E中所示)，第一结构4010可以充当盖子，并且间隔件柱4024可以布置成阵列，诸如例如当参考图4A时所示和描述的矩形阵列，或者当参考图23D时所示和描述的交错阵列。再次，以交错阵列布置的间隔件柱4024可以被构造为经由确定性横向位移(DLD)执行颗粒分离。单件式流体设备可以设有对准孔4089，对准孔4089可以在折叠后帮助基板部分的对准(例如，以帮助引导第一与第二结构的相对位置)，将设备放置到任何合适的设备中以用于将第一结构4010和第二结构4012夹紧或密封在一起，等等。例如，第二结构4012的对准孔4089可以被放置在夹紧块(未示出)上，并且第一结构4010可以被折叠到第二结构4012上。然后可以使用夹紧块或任何其它合适的设备将结构夹紧并密封在一起。第一结构4010和/或第二结构4012可以设有结构凸片，诸如第二结构凸片4012a，其可以例如有助于第一和第二结构的处理。

边界材料(在本文中称为“边界材料”或“边界间隔件”)可以在第一结构4010和/或第二结构4012内提供。在基板被折叠之后，这种边界材料可以形成密封腔室的周界的至少一部分。应当理解的是，边界材料可以沿着第二结构4012的周界延伸，使得通道4022可以从其所有侧面被密封。在一些变型中，边界材料可以以任何合适的图案在第一结构4010和第二结构4012内提供。在图40A中所示的腔室布置的示例性实施例中，第一结构4010设有环形边界材料4021a，当设备处于折叠状态时，该环形边界材料4021a可以接纳并环绕第二结构4012的边界材料4021b(图40B)。通道4022因此可以被放置在边界材料4021a内的第一结构4010的凹部4022a中。在图40C所示的腔室布置的示例性实施例中，第一结构4010可在整个结构中设有边界材料4021a，其中边界材料4021a除了凹部4022a之外在整个盖子上延伸。如图40A所示的实施例中，当设备处于关闭状态时，第二结构4012的边界材料4021b和通道4022可以放置在凹部4022a中。图40C示出了处于折叠状态的图40A的单件式流体设备的横截面视图。当单件式流体设备处于完全折叠状态时，流体通道可以被密封。如图40A中所示，例如，用于流体腔室4022的至少一个入口(“I”)和至少一个出口(“O”)可以提供从第一结构和第二结构(诸如单件式流体设备的第二结构4012)之一到流体腔室4022的流体通路。

换句话说，在一些变型中，第一结构中的边界材料的至少一部分和第二结构中的边界材料的至少一部分可以互补地形成，以便在腔室布置处于关闭状态时配对，并在配对的边界材料内形成密封腔室。此外，应当理解的是，除了图40A和40C中所示的示例性图案之外，可以在腔室布置的第一和第二结构中提供边界材料的不同部分和图案。

在一些变型中，可以在第一和第二结构之一中提供所有边界材料。例如，如图42A和42B中所描绘的腔室布置的侧视横截面视图所示(分别示出了部分关闭状态和关闭状态)，边界材料4021b可以仅在第二结构4012内提供，而第一结构结构4010可以形成盖子而没有在其上沉积边界材料。如图42B中所示，当设备处于关闭状态时，第一结构4010可以与边界材料4021b(和间隔件4024)的顶部齐平。再次，如前所述，当单件式流体设备处于完全关闭状态时，流体腔室4022可以被密封。

虽然以上参考图2A-8B以及图40A-40C、41和42A-42B描述了腔室布置的具体示例性变型，但是应当理解的是，这些腔室布置的各种特征可以以任何合适的方式组合。

电合并腔室

在一些变型中，腔室可以被构造为诸如通过经由由电极施加电能合并样本中的两个或更多个实体或颗粒来更改腔室中样本的至少一部分(“电合并”)。如以下进一步详细描述的，这种电合并可以使得能够进行进一步的处理，诸如按尺寸分选和分离颗粒，以便高效地隔离某些感兴趣颗粒以进行进一步处理。例如，电合并腔室布置可以被用于识别和分选感兴趣细胞，诸如作为期望物质(诸如特异性抗体或用于开发免疫疗法的胰岛素等)的高分泌者的细胞(例如，杂交瘤、B细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等)。

例如，如图23A中所示，处理样本的方法2300可以包括在腔室2320中接收包括多个颗粒的制备的乳剂，将样本中的一个或多个颗粒表征为废弃颗粒2330，通过将电能递送到废弃颗粒来合并废弃颗粒2340的至少一部分，以及基于颗粒2350对颗粒进行分选。可以对某些感兴趣颗粒执行进一步的处理2360，诸如将感兴趣颗粒收集到储器中，吸取或以其它方式将PODS或细胞沉积到孔板中，执行细胞PCR、DNA测序、ELISA、FACS和/或其它处理等。

图23B描绘了制备样本的示例性示意图，该样本包括多个颗粒当中的感兴趣颗粒(例如，PODS)。具体而言，在这个示例中，样本包括与表面活性剂(例如，氟油)混合的细胞和珠子或其它标记物，以产生具有PODS的乳剂，其中每个POD可以用作自包含的囊泡。例如，如图31中所示，可以将氟油3120添加到乳剂3130，并且可以将乳剂3130引入到电合并腔室3110中。可以将油3120附加地单独引入电合并腔室3110中。样本可以与不同尺寸的PODS多分散。细胞可以分泌一种或多种抗体。例如，如图23B中所示，细胞C1可以分泌第一类型的抗体(ab1)，细胞C2可以分泌第二类型的抗体(ab2)，而细胞C3和C4可以分泌第三类型的抗体(ab3)。可以将这些细胞与包被有特定于感兴趣抗体类型(例如，ab3)的抗原的珠子混合，使得在混合的样本中，珠子与感兴趣分泌细胞结合，并且结果所得的凝集作用可以是感兴趣细胞和/或感兴趣细胞的分泌水平的存在的指示剂。在结果所得的乳剂中，每个POD可以包括至少一个细胞(其可以是或可以不是感兴趣单元)或缺乏细胞。例如，PODS P1-P3可以分别包括细胞C1-C3，而其它PODS(Pe)可以缺少细胞。在一些变型中，细胞与表面活性剂的比例可以低，以便产生相对稀释的PODS与细胞的浓度。例如，每个POD的平均细胞数(λ)可以在大约0.9和大约1.1之间，或大约0.1(例如，对于具有至少一个细胞的每1个POD，大约有10个“空”PODS而没有细胞)。此外，这些细胞中只有一小部分可以是感兴趣细胞(即，分泌感兴趣抗体)，而这些细胞中只有一小部分可以是适于进行进一步处理的期望的感兴趣细胞(即，以足够高速率分泌感兴趣抗体)，诸如用于免疫疗法。下面参考图23A-24B进一步描述从乳剂中提取期望的感兴趣细胞的示例性系统和方法。图31图示了系统的另一个示例性变型。

与PODS组合的电合并腔室布置的一个优点是，每个POD用作小体积的囊泡(例如，平均体积在500皮升-1纳升之间)，这使得能够读出并识别少量抗体(或其它感兴趣物质)。在一些变型中，感兴趣细胞可以在适合用电合并腔室布置进行识别和分选之前仅需要几个小时生长和分泌。作为说明，图25A-25C是描绘由诸如本文描述的成像器和室系统捕获的在细胞分泌测定中杂交瘤随时间的生长(具有IgG集聚类)的图像。在时间t＝0，没有凝集物可见(图25A)。此时，如由图25A和图26A(IgG浓度为0.5ng/ml)的视觉相似性所表明的，IgG的浓度低且低于分泌范围。但是，在时间t＝2小时的仅两个小时之后，杂交瘤的生长已经被杂交瘤分泌范围内足够高的IgG浓度所反映，如图25B和图26B(IgG浓度为5μg/ml)的视觉相似性所表明的。在时间t＝6小时再生长几小时导致使用本文描述的成像和腔室系统甚至更容易检测到的IgG聚类。因而，与可能要求期间必须克隆和生长细胞以充分放大与凝集相关的信号的许多天(例如，10-14天)的仔细孵育的常规生产方案相比，电合并腔室布置可以提供产生抗体或其它目的物质的明显更快的方法。

此外，样本可以作为连续流被引入电合并腔室布置中，从而启用高吞吐量。此外，电汇合室布置的输出在输出的流体体积中具有较少的感兴趣颗粒的稀释。例如，在一些变型中，与通常导致许多空孔连同包含有用细胞的少量孔的常规生产方案相比，孔板的每个孔可以接纳单个POD，已知该POD包含从输出的流体体积中抽出的高分泌细胞。

一般而言，如图23C和31中所示，可以将样本引入与上面讨论的腔室相似的腔室中，不同之处在于该腔室在样本的流路中包括一个或多个电极。如以上关于图23A所描述的，腔室中的处理可以被表征为多步骤过程，包括表征、合并和分选POD。为了表征PODS，成像器阵列可以获得样本中PODS的一个或多个图像，并且可以使用计算机视觉和/或其它计算技术(诸如上述的那些)对图像进行分析，以基于其内容物来表征PODS(2330)。例如，可以基于PODS中存在的凝集量将一些PODS表征为感兴趣PODS(例如，包含分泌感兴趣抗体和/或以足够高速率分泌感兴趣抗体的细胞)。其它PODS可以被表征为要废弃的PODS。

然后，通过从与废弃PODS接触的一个或多个电极输送电能，可以将表征为废弃PODS的PODS合并以形成更大的PODS，该较大的PODS也只在被废弃(2340)。电极和废弃PODS可以电容性耦合，使得由电极施加的电压的变化在PODS的表面活性剂表面上造成机械干扰或其它力，从而破坏表面并使得相邻PODS破裂并合并在一起。例如，可以用AC波形驱动与PODS接触的电极，使得交替调制造成PODS表面活性剂表面的周期性机械压缩和减压，从而导致PODS破裂并合并。合适的AC波形包括以下关于图24B更详细描述的那些。因而，合并过程(2340)可以产生其中感兴趣PODS一般较小而打算废弃的PODS一般较大的乳剂。

腔室中的电极可以具有适于将电能递送到腔室中的颗粒的任何合适的形状和/或朝向。例如，电极可以是横向于样本流方向延伸(诸如在腔室的上表面和下表面之间延伸)的间隔件柱2402(例如，如图24-24C所示)。作为另一个示例，电极可以是如图28A和28B中所示的叉指状电极2810，其在腔室的下表面和/或上表面上被构图。在这个示例中，图28A描绘了在经由叉指状电极2810递送电能之前的PODS，并且图28B描绘了包括较大的合并POD(P)的PODS，其在经由叉指状电极2810递送电能之后创建。

在这种合并之后，可以基于尺寸对乳剂中的PODS进行分选(2350)，以便过滤和分离一般较小的感兴趣PODS。可以通过任何合适的分选布置来完成分选。在一些变型中，分选布置可以包括被动分选布置。例如，分选布置可以包括多个间隔件(例如，类似于图4A中所示的腔室中的间隔件柱424)，其可以以交错的阵列布置并且被构造为经由确定性横向位移(DLD)执行分离。在DLD中，柱的交错阵列可以像大理石机器一样工作，以分离小颗粒和大颗粒(诸如PODS)。例如，如图23D中所示，当包括小颗粒和大颗粒的样本大致在流体流过柱的交错阵列的方向移动时，大颗粒(即，超过临界阈值直径的颗粒)会相对于流体流方向横向地被操纵。较大颗粒的这种被动迁移因此可以使得能够分别收集较小颗粒(例如，在第一出口处)和较大颗粒(例如，在第二出口处)。可以例如通过调整柱的直径和/或间距来调整用于以这种方式分选颗粒的临界阈值直径。因而，在分选布置的一些变型中，可以构造和布置腔室中的间隔件柱，以便通过确定性横向位移来被动分选样本中的PODS。

作为另一个示例，分选布置可以包括各种尺寸的一个或多个出口，其选择性地允许不同尺寸的颗粒通过。例如，如图23C的示意图中所示，腔室可以包括多个小出口(例如，一个或多个选择通道导致在“选择端口”处捕获)，被配置为仅允许低于预定阈值颗粒尺寸的颗粒通过，并拒绝超过预定阈值颗粒尺寸的颗粒通过。通往废物接收器的一个或多个较大的出口(“垃圾箱端口”)可以被配置为允许被前面的较小出口拒绝的较大颗粒通过。因此，在诸如图23C中所示的腔室中，较小的PODS可以趋于通过较小的出口离开腔室，然后到达(一个或多个)较大的出口以废弃较大的PODS。作为另一个示例，如图30的示意图中所示，通向一个或多个通向废物接受器(“垃圾箱”)的出口的多个通道可以拒绝较大的颗粒通过，而较大的颗粒可以被通道导向接受较大颗粒的通过的捕获接受器(“选择”)。因而，在分选布置的一些变型中，逐渐增加的腔室出口尺寸的阵列可以通过根据颗粒尺寸的收集而被动地分选样本中的PODS。如图23C和图31中所示，可以收集不感兴趣颗粒以废弃(例如，图23C中所示的“垃圾箱端口”处的废物接受器，或图31中所示的废物接受器3140)。此外，在一些变型中，流体流(例如，通过使用泵、阀、腔室表面轮廓等构造)可以附加地将颗粒推向较小的出口(例如，抵靠主通道的侧壁)，以进一步促进足够小的颗粒通过较小的出口。

作为另一个示例，如图23E中所示，分选布置可以附加地包括多个分支通道，这些分支通道被构造为经由流体动力过滤执行颗粒分离。在流体动力过滤中，少量的流体通过一个或多个侧面分支通道反复从主通道中抽出，这使颗粒沿着主通道的侧壁逐渐浓缩并对准。然后可以类似于上面描述并且在图23C中示出的通过一个或多个选择通道根据颗粒尺寸收集浓缩且对准的颗粒。

附加地或可替代地，分选布置可以包括主动分选布置。例如，腔室可以包括一个或多个电极区域，这些电极区域被构造为产生电场以启用介电电泳，诸如类似于美国专利申请序列No.15/986,416中描述的那些，该专利申请在上文中通过引用并入本文。例如，可以操作此类电极区域以捕获、移动和/或以其它方式主动控制所选择的PODS的分选。

在分选PODS并收集感兴趣PODS之后，可以进一步处理感兴趣PODS。例如，可以将感兴趣的较小PODS(例如，经由真空或如下所述的流体控制系统的其它方面)引导到储器中(2360)，可以用移液器或其它仪器从中取出单个PODS或细胞(2363)。感兴趣PODS可以沉积到孔板中以进行进一步的处理和/或分析(例如，PCR、测序等)。例如，每个孔中最多可以沉积单个细胞。可编程机器人可以自动装载每个孔，从而进一步提高效率。

图24A-24C是电合并腔室布置的示例性变型的示意图。如图24A中所示，一种用于处理样本的系统可以包括腔室2400，该腔室2400包括至少一个用于接纳样本(例如，通过管道和合适的流体连接)的入口2410，以及两个或更多个出口(例如，2420和2422)，以允许样本的至少一部分离开腔室2400。沿着入口2410与出口2420、2422之间的流路径，腔室可以包括成像和合并区域2402以及在成像和合并区域2402下游的分选区域2404。腔室2400可以包括多个间隔件柱2432和2434，其分别分布在整个区域2402和2404中，其支撑和/或维持腔室的上表面和下表面之间的间隙距离。例如，如图24B的横截面堆叠示意图中所示，间隔件柱2432、2434可以在透明聚酰亚胺表面(具有大约25μm的厚度或其它合适的厚度)之间延伸并支撑之间的间距(例如，75μm或其它合适的间隙距离)。在一些变型中，腔室可以用层压压力机形成，该层压压力机至少部分地用合适的粘合剂接合聚酰亚胺表面。

如下面进一步详细描述的，成像和合并区域2402中的至少间隔件柱2402可以用作输送电能以合并所选择的PODS的电极。间隔件柱2432、2434可以例如包括诸如铜之类的导电材料。至少在分选区域中的间隔件柱2404可以用于根据尺寸来分选PODS。

一般而言，成像和合并区域2402可以定位在一个或多个光源和/或成像器阵列之间，使得成像器阵列可以获得已经进入腔室的PODS或其它颗粒的阴影图像。可以使用诸如本文关于图21A-21E描述的那些计算技术来分析一个或多个图像。基于对此类图像的分析，可以将不感兴趣PODS(例如，不包括细胞，或包括缺少IgG或其它凝集的细胞)表征为要废弃的PODS。然后可以将这种废弃PODS指定为由系统中的一个或多个处理器进行电合并。

可以用充当电极的间隔件柱2402来实现电合并。如图24C中所示，电极可以导电耦合(例如，通过诸如迹线或布线之类的导电连接)到被配置为控制电极的激活的控制器2450。虽然图24C图示了分别用于四个电极的四个导电连接，但是应当理解的是，在一些变型中，多于四个间隔件柱2402可以用作电极，并且每个电极可以具有其自己的相应的导电连接(或者可替代地，至少某个数量的n个电极可以通过合适的多路复用方案由少于n个导电连接来控制)。

在这个示例中，控制器2450可以包括信号发生器2456，该信号发生器2456被配置为生成一个或多个合适的波形以用于驱动电极。在一些变型中，信号发生器2456可以被配置为以AC波形(例如，正方形、三角形、正弦形等)驱动电极，使得电极对(例如，相邻的对)之间的PODS被电容性地耦合到电极并接收具有交替极性的电能。在接收到这种电能后，PODS就会经历周期性的压缩力，该压力破坏PODS并使相邻的受影响PODS合并为(一个或多个)较大的pod。AC波形的特定参数可以根据应用(例如，PODS的尺寸、电极的尺寸和材料、电极之间的间距等)而变化，但是一般而言，驱动波形应当具有足够的电压以引起合并效果，而不会过量以导致对样本的损坏(例如，导致气泡、黑斑等)。例如，在一些变型中，波形可以具有在大约0.5V和大约10V之间、在大约0.5V和大约5V之间或者大约2.5V的峰-峰电压。此外，在一些变型中，波形可以具有在大约1Hz和1MHz之间、在大约10Hz和大约20kHz之间、或者在大约50Hz和大约20kHz之间的频率。对于合并PODS的单个实例，驱动波形的脉冲可以循环任何合适的次数，诸如在大约1和20次之间，并且在一些变型中，脉冲宽度的持续时间可以在大约10ms和10s之间变化。但是，驱动波形可以具有任何合适的脉冲宽度、周期数等。

信号发生器2456可以通过迹线、布线或其它合适的连接导电地耦合到每个电极。沿着这些导电连接，信号处理电路系统2454(例如，放大器)可以针对每个单独的导电连接或者针对所有导电连接共同地合适地放大或修改驱动信号。此外，可以控制包括用于每个导电连接的开关的开关阵列2452，以选择性地接通和关断每个开关的对应电极的激活。因而，控制器2450可以使间隔件柱2402中的至少一些(用作电极)递送合适的电能以电合并被识别为合并的PODS(例如，不感兴趣PODS)并且与间隔件PODS柱2402接触或电容性耦合。

如上所述，在样本通过腔室的成像和合并区域2402之后，较大的PODS一般是不感兴趣PODS(例如，不包括高分泌细胞)，而较小的PODS是感兴趣的并且期望保留。因此，腔室的分选区域2404具有将较小的PODS与较大的PODS分开以进行收集的功能。如图24-24C中描绘的变型中所示，分选区域2404可以包括以交错阵列布置的间隔件柱2434，其可以被构造为朝着出口2422被动地横向地(相对于从左到右的流方向)分选较大的PODS。较小的PODS可以同时朝着出口2420被被动分选。但是，应当理解的是，在其它变型中，电合并腔室可以附加地或可替代地包括任何合适的被动和/或主动颗粒分选布置。

因而，通过将样本指引穿过成像和合并区域2402以及分选区域2404，电合并腔室布置2400可以提供感兴趣PODS的浓缩输出(可在出口2422处收集)，以及不感兴趣PODS的单独的废物输出(可从出口2420收集)，这避免稀释感兴趣PODS。此外，通过腔室2400的连续样本流可以启用PODS的高吞吐量，从而进一步有助于样本的高效处理，表明本文所述的电合并系统和方法的可行性。

流体控制系统

如图1A的示意图和图1B中的示例性变型的图示中所示，系统100可以包括流体控制系统，该流体控制系统被配置成以压力差操纵PODS。流体压力差可以引起一个或多个PODS通过腔室入口122进入腔室，包括一个或多个PODS以横越腔室，和/或引起一个或多个PODS通过腔室出口124离开腔室。例如，系统100可以包括至少一个流体耦合到腔室入口122(或以其它方式与之相关联)的正压泵110和/或至少一个流体耦合到腔室出口124(或以其它方式与之相关联)的负压泵150。泵110和/或150可以被配置为经由管道和至少一个腔室入口122从容器116(例如，罐、Eppendorf管、其它合适的容器等)中将乳剂(例如，包括PODS)抽吸到腔室120中。泵110和/或150可以附加地或可替代地被配置为通过至少一个腔室出口124从腔室120抽吸乳剂的至少一部分。在一些变型中，废物容器156可以串联连接在腔室出口124和泵150之间，用于接收和保持已经离开腔室120的乳剂。虽然图1的示意图图示了与一个腔室入口112相关联的一个泵110以及与腔室出口124相关联的一个泵150，但是应当理解的是，在其它变型中，系统可以包括任何合适数量的腔室入口、腔室出口，以及泵。此外，在一些变型中，腔室120可以是可分离的，以与其它流体控制系统集成。腔室120可以是一次性组件，而流体控制系统的其余部分可以是可重复使用的和/或可消毒的。

此外，测定系统100可以包括一个或多个阀，其可以启用测定系统100内的进一步的流体控制。例如，阀112可以与到一个或多个腔室入口的流体流成一直线定位，并且可以被控制以调节进入腔室120的样本流。附加地或可替代地，阀152可以与来自一个或多个腔室出口的流体流成一直线定位，并且可以被控制为调节从腔室120流出的样本流。此外，测定系统100可以包括被配置为监视流体系统的压力和/或其它参数的一个或多个压力传感器114、154(或流量传感器，或任何合适的传感器)。

在一些变型中，流体控制系统的组件，包括上述泵、阀和/或传感器，可以由一个或多个控制器控制。例如，电子系统160可以包括一个或多个控制器，这些控制器被配置为实现任何合适的控制系统，以至少部分地基于来自压力传感器的传感器输入来操作一个或多个泵和/或阀，以维持进入腔室120的期望流率。此外，控制系统可以操作这些组件，以便促进对腔室中的样本进行分选，如在通过引用并入本文的美国专利申请序列No.15/986,416中进一步描述的。

电子系统

如图1中所示，系统100可以包括电子系统160。电子系统160可以包括例如具有一个或多个处理器等的PCBA，其被配置为控制和/或接收来自测定系统100的其它组件的信号，如本文进一步所述。在一些变型中，电子系统160还可以包括一个或多个通信组件(例如，蓝牙、WiFi等)，其被配置为将数据(例如，图像数据)传送到网络170，以由一个或多个远程处理器180进行分析。例如，网络170可以包括与一个或多个计算设备的任何合适的有线或无线连接。附加地或可替代地，数据中的至少一些可以由位于电子系统160中的一个或多个处理器分析。

一般而言，计算设备可以包括控制器，该控制器包括处理器(例如，CPU)和存储器(其可以包括一个或多个计算机可读存储介质)。处理器可以结合从存储器接收的数据和用户输入。存储器可以包括存储指令，以使处理器执行与本文描述的方法相关联的模块、过程和/或功能。在一些变型中，存储器和处理器可以在单个芯片上实现，而在其它变型中，它们可以被植入在单独的芯片上。

处理器可以是被配置为运行和/或执行指令集或代码的任何合适的处理设备，并且可以包括一个或多个数据处理器、图像处理器、图形处理单元、物理处理单元、数字信号处理器和/或中央处理单元。处理器可以是例如通用处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)等。处理器可以被配置为运行和/或执行应用过程和/或与系统和/或与其相关联的网络相关联的其它模块、过程和/或功能。可以提供各种组件类型的底层设备技术(例如，MOSFET技术(如互补金属氧化物半导体(CMOS))、双极技术(如发射极耦合逻辑(ECL))、聚合物技术(例如，硅共轭聚合物和金属共轭聚合物-金属结构)、混合的模拟和数字等)。

一个或多个处理器可以例如提供计算机视觉系统，该计算机视觉系统被配置为使用核实的图像处理和/或计算机视觉技术来分析图像(例如，如本文所述获取的阴影图像)以评估被成像的样本。例如，参考图21A-21E，在一些变型中，一个或多个处理器可以处理原始(未加工)阴影图像(图21A)以减少噪声(例如，通过滤波处理)并移除背景内容(图21B)(例如，通过在相同或相似的照明条件下为空或无样本时腔室的对照图像获得，或者用软件算法获得)。可以从背景图像中减去样本图像以获得相减后的图像(图21C)。在减去之后，原始图像中的任何深色物体在相减后的图像中会显得更亮。可以将相减后的图像的像素强度作为阈值，以获得一个或多个PODS的二进制的黑白图像(图21D)。例如，POD中的任何物体在二进制图像中可以看起来是白色，而其它区域可以看起来是黑色(反之亦然)。最后，可以应用适当的计算机视觉技术(例如，轮廓搜索算法)来查找物体(例如，POD、POD内容物(例如，细胞或颗粒))的边界，从而启用对物体的标识。在一些变型中，此类轮廓搜索算法可以结合一个或多个经训练的机器学习模型。基于合适的计算机视觉技术的POD和/或POD内容物的一个或多个特点可以在经处理的图像中被识别(例如，如图21E中被突出显示)。例如，可以分析许多特性(诸如面积、颗粒尺寸、颗粒形状、灰度(例如，强度)、移动的速率、POD中的电流流、比率和/或其动态改变，和/或其任何组合)。

在一些变型中，存储器可以包括数据库，并且可以是例如随机存取存储器(RAM)、存储器缓冲器、硬盘驱动器、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、电可擦除只读存储器(EEPROM)、只读存储器(ROM)、闪存等。存储器可以存储指令以使处理器执行模块、过程和/或功能，诸如测量数据处理、测量设备控制、通信和/或设备设置。本文描述的一些变型涉及具有其上具有用于执行各种计算机实现的操作的指令或计算机代码的非暂态计算机可读介质(也可以被称为非暂态处理器可读介质)的计算机存储产品。计算机可读介质(或处理器可读介质)在其本身不包括暂态传播信号(例如，在诸如空间或电缆之类的传输介质上携带信息的传播电磁波)的意义上是非暂态的。介质和计算机代码(也可以被称为代码或算法)可以是为一个或多个特定目的设计和构造的。

非暂态计算机可读介质的示例包括但不限于磁存储介质，诸如硬盘、软盘和磁带；光学存储介质，诸如光盘/数字视频光盘(CD/DVD)；光盘只读存储器(CDROM)和全息设备；磁光存储介质，诸如光学盘；固态存储设备，诸如固态驱动器(SSD)和固态混合驱动器(SSHD)；载波信号处理模块；以及专门配置用于存储和执行程序代码的硬件设备，诸如专用集成电路(ASIC)、可编程逻辑设备(PLD)、只读存储器(ROM)和随机存取存储器(RAM)设备。本文描述的其它变型涉及计算机程序产品，其可以包括例如本文公开的指令和/或计算机代码。

本文描述的系统、设备和/或方法可以由软件(在硬件上执行)、硬件或其组合执行。硬件模块可以包括例如通用处理器(或微处理器或微控制器)、现场可编程门阵列(FPGA)和/或专用集成电路(ASIC)。软件模块(在硬件上执行)可以用多种软件语言(例如，计算机代码)表达，包括C、C++、

在一些变型中，计算设备还可以包括通信接口，该通信接口被配置为允许患者和/或其他用户控制计算设备。通信接口可以包括网络接口，该网络接口被配置为通过有线或无线连接将计算设备连接到另一个系统(例如，互联网、远程服务器、数据库)。在一些变型中，计算设备可以经由一个或多个有线或无线网络与其它设备通信。在一些变型中，通信接口可以包括被配置为与一个或多个设备和/或网络通信的射频接收器、发送器和/或光学(例如，红外)接收器和发送器。

无线通信可以使用多种通信标准、协议和技术中的任何一种，包括但不限于全球移动通信系统(GSM)、增强型数据GSM环境(EDGE)、高速下行链路分组接入(HSDPA)、高速上行链路分组接入(HSUPA)、演进、仅数据(EV-DO)、HSPA、HSPA+、双小区HSPA(DC-HSPDA)、长期演进(LTE)、近场通信(NFC)、宽带码分多址(W-CDMA)、码分多址(CDMA)、时分多址(TDMA)、蓝牙、无线保真(WiFi)(例如，IEEE802.11a、IEEE 802.11b、IEEE 802.11g、IEEE 802.11n等)、互联网协议语音(VoIP)、Wi-MAX、电子邮件协议(例如，互联网消息访问协议(IMAP)和/或邮局协议(POP))、即时消息传递(例如，可扩展的消息传递和到场协议(XMPP)、用于即时消息传递和到场充分利用扩展的的会话发起协议(SIMPLE)、即时消息传递和到场服务(IMPS))，和/或短消息服务(SMS)，或任何其它合适的通信协议。在一些变型中，本文的设备可以彼此直接通信而无需通过网络(例如，通过NFC、蓝牙、WiFi、RFID等)传输数据。

聚类测定

如以上所讨论的，诸如本文描述的系统和方法可以例如被用于处理细胞样本。例如，聚类测定可以被用于识别作为特定目标的抗体的高分泌者或产生者的细胞。在细胞群中，相对于群体中的其它细胞，群体内的某些细胞可以是感兴趣目标(诸如感兴趣蛋白质)的高分泌者。用于聚类测定的系统和方法的示例性变型在下面进一步详细描述。

“单珠”测定

使用单珠系统的聚类测定(“单珠测定”或“单珠聚类测定”)可以被用于识别细胞群内的高分泌细胞。虽然下面主要将“单珠测定”描述为包括一个或多个珠子作为标记物颗粒，但是应当理解的是，可以使用其它颗粒(例如，细胞，如下面进一步详细描述的)。单珠聚类测定可以被用于将包封在POD内的分泌细胞识别为感兴趣蛋白质(或肽等)的高分泌者。例如，测定可以利用提供指示感兴趣抗体的细胞的分泌水平的信号的一个或多个第一类型的颗粒。

图32A描绘了当使用单珠测定时在诸如POD 3218之类的样本实体内部可能发生的结合相互作用的示意图。POD 328可以包括一个或多个具有可以对由细胞3217分泌的第二结合配偶体具有特异性的结合配偶体的颗粒。图32B描绘了图32A的区域3220的详细放大，示出了单个颗粒3211a。如示例所示，单珠聚类测定可以被用于识别包封在POD 3218内的抗体分泌细胞3217作为感兴趣抗体3213的高分泌者。单珠聚类测定可以利用包封试剂和悬浮在水性介质中的第一多个颗粒。包封试剂可以包括大于大约1.0的密度，其可以例如帮助形成离散的样本实体，诸如包括水性介质的POD。第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体。

再次，如先前在参考图23B时所描述的，用于单珠测定的样本可以包括与表面活性剂(诸如氟油和珠子或其它标记物)混合的细胞，以产生具有样本实体的乳剂，其中每个样本实体可以用作自包含的囊泡。包封试剂可以包括表面活性剂，其可以至少部分地使样本的部分能够被包封到样本实体中。表1-3中示出了其中包封试剂包括表面活性剂的制剂的示例。PODS可以多分散在用于分析的样本中。第一多个颗粒中的颗粒可以是珠子，诸如如图32B中示为示例的抗体耦合的珠子3211a，其表面上耦合有多克隆抗体3212a。第一多个颗粒中的颗粒可以是细胞，使得在细胞上表达的抗原或任何其它合适的标记物可以与由感兴趣细胞分泌的抗体结合。因此，细胞上的标记物或抗原或珠子上的多克隆抗体3212a可以充当对第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体，该第二结合配偶体可以是由细胞3217分泌的抗体3213的结合域或任何合适的组分3213a。在一些变型中，第一结合配偶体可以包括第一蛋白质，并且第二结合配偶体可以包括第二蛋白质。在一些变型中，第一结合配偶体或第二结合配偶体可以是抗原或抗体。在一些变型中，第一结合配偶体可以包括第一肽，并且第二结合配偶体可以包括第二肽。

当第一结合配偶体3212a和第二结合配偶体3213a被结合时，结合的位点可以被称为集群位点，或如图32B中所示的第一集群位点3214a。由第一和第二结合配偶体的结合形成的这些集群位点可以通过本文所述的系统和方法来检测。此外，在一些变型中，可以通过作为抗体3213的高分泌者来选择某些细胞作为感兴趣细胞，并且高分泌细胞可以生成更大的集群。由第一结合配偶体3212a和第二结合配偶体3213a形成的集群可以例如使用如上所述的无透镜成像系统观察到，因此使得能够选择高分泌细胞。还可以使用本文描述的任何成像方法来测量或检测高分泌细胞。

因此，聚类测定可以使得能够识别包括感兴趣细胞(例如，分泌足够高量的感兴趣物质的细胞)的POD。例如，由于形成了大量的集群位点，诸如图32B的3213a所示的第一集群位点，从细胞分泌的大量感兴趣抗体会导致更大的集群。因此，耦合到珠子3211a的多克隆抗体3212a与细胞分泌的抗体3213的结合区域3213a之间的大量相互作用会导致形成大量集群，然后可将其检测为一个或多个集群。然后可以视觉上检测形成的集群，或者可通过本文描述的任何成像方法对其进行测量，并且可以将其解释为从中检测到集群的POD是包含感兴趣细胞的POD的信号。

一般而言，较大的集群将导致具有感兴趣抗体的更高分泌细胞的POD。这些集群的较大尺寸可以允许例如使用4X显微镜物镜将集群可视化。作为另一个示例，可以在阴影图像中观察到集群，诸如由上面参考图2A、9、10和14A-14C描述的系统所拍摄的阴影图像。在图32A的第一POD 3218a中示出了分泌或产生足够量的感兴趣抗体以生成可检测或可测量信号的细胞的示例。

在一些变型中，可以为包括一个或多个集群位点的POD指派颗粒尺寸分数(PSS)。例如，可以如以下示例中所述为PSD确定PSS并将其指派给POD。例如，具有较高PSS的POD可以被识别为包括感兴趣细胞(例如，高分泌细胞)，并且可以进行分选(例如，如上所述通过电合并和分选过程等)，以从细胞群中分离出感兴趣细胞。分选出的细胞中的至少一些可以进行进一步处理，诸如ELISA、FACS、DNA测序、PCR、其它合适的分析等。在一些变型中，可以从POD 3218移除感兴趣细胞以进行这种进一步处理。

聚类分析还使得能够识别不包括感兴趣细胞(例如，不分泌或少量分泌感兴趣物质的细胞)的POD。例如，当POD内的细胞不分泌感兴趣抗体时，由于耦合到珠子3211的多克隆抗体3212a与感兴趣抗体之间不发生相互作用，因此不形成集群。此外，当POD内的细胞正在分泌少量的目标抗体时，所分泌的抗体与耦合到珠子3211a的多克隆抗体3212a之间可以发生相互作用，但是结合相互作用的量或数量可能是太低而无法生成可检测或可测量的信号。在一些变型中，对于包括具有大约0.5nL的平均体积的PODS的样本，“低”信号可以指示在大约3小时内少于约1pg的感兴趣抗体的分泌量。例如，POD中具有低分泌细胞的任何形成的集群可以低于阈值尺寸，和/或可能太小而无法使用4X显微镜物镜或在诸如上面参考图2A、9、10和14A-14C所描述的阴影图像中可视化。在图32A的第二POD3218b中示出了分泌或产生不足量的感兴趣抗体以生成可检测或可测量信号的细胞的示例。

如图32B中的3212a所示，可以充当第一结合配偶体的结合配偶体的示例可以包括一类或多类抗体当中的多克隆抗体，诸如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。

可以被选择用于使用单珠测定的感兴趣细胞的示例可以包括CHO细胞、B细胞、杂交瘤细胞、浆细胞、HEK293细胞、骨髓瘤细胞和T细胞等中的任何一种或多种。

可以被选择用于使用单珠测定的目标抗体的示例可以包括一类或多类抗体当中的抗体，诸如IgA、IgD、IgE、IgE和IgM等。

感兴趣蛋白质和肽的示例包括任何合适的标准生物标记物，诸如胰岛素、NT-pro-BNP、Pro-GRP、β-CTX、PINP、胰多肽、骨钙蛋白质、β

“双珠”测定

在一些变型中，识别和收集不仅是感兴趣目标的高分泌者(同样，诸如感兴趣蛋白质)，而且其中感兴趣目标示出结合到配偶体抗原的高亲和力的/或与特异性的细胞也可以是有价值的。使用双珠系统的聚类测定(“双珠测定”或“双珠聚类测定”)可以被用于评估来自目标细胞的抗体分泌的水平以及所分泌的抗体的抗原结合亲和力。因此，双珠测定可以被用于选择分泌大量感兴趣抗体的感兴趣细胞，其中所分泌的抗体还显示出高抗原结合亲和力。例如，测定可以利用一个或多个第一类型的颗粒，其提供指示细胞的感兴趣抗体的分泌水平的信号，以及一个或多个第二类型的颗粒，其针对任何此类分泌的抗体提供指示抗原结合亲和力水平的信号。虽然下面主要将“双珠测定”描述为包括一个或多个珠子作为标记物颗粒，但是应当理解的是，可以使用其它颗粒(例如，细胞，如下文进一步详细描述的)。

类似于上述单珠测定，双珠测定可以被用于样本的分析，该样本可以包括与表面活性剂(诸如氟油)和珠子或其它标记物混合的细胞，以产生具有样本实体的乳剂，其中每个样本实体可以用作自包含的囊泡。双珠测定还可以利用包封试剂，并且第一多个颗粒悬浮在水性介质中，并且第二多个颗粒也悬浮在水性介质中。包封试剂可以包括大于约1.0的密度。包封试剂可以包括表面活性剂，其可以至少部分地使样本的部分包封到样本实体中。样本实体可以是PODS。

如上述单珠测定，第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体。但是，双珠测定也可以利用第二多个颗粒，其中第二多个颗粒中的每个颗粒包括对由感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体。

图33A描绘了当使用双珠测定时可能在POD 3318内部发生的结合相互作用的示意图。作为示例示出的是PODS 3318a、3318b和3318d，如将在本文中进一步详细描述的。POD3318a是由于被识别为感兴趣细胞的细胞3317是感兴趣抗体3313的高分泌者而生成的可检测或可测量信号的示例，其中抗体3313具有高抗原结合亲和力。POD 3318b是未生成可检测或可测量信号的示例，因为细胞3317是感兴趣抗体的低生产者。POD 3318d是未生成可检测或可测量信号的示例，因为细胞3317是感兴趣抗体的高分泌者，但是其中抗体3313具有低抗原结合亲和力。

图33B示出了图33A的POD 3318a的详细放大，并且图33C示出了图33A-33B的POD3318a内的结合相互作用的详细放大。

在双珠测定中，第一多个颗粒中的颗粒可以是珠子，诸如具有耦合到其表面的抗原3312b的抗原耦合的珠子3311b。抗原3312b因此可以充当对第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体，该第二结合配偶体可以是由细胞3317分泌的抗体3313的结合域或任何合适的第一组分3313a。第一组分3313a可以是抗原结合域。第二多个颗粒中的颗粒也可以是珠子，诸如具有耦合到其表面的抗体的抗体耦合的珠子3315b。抗体3316可以是单克隆抗体，并且可以充当对第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体，该第四结合配偶体可以是由细胞3317分泌的抗体3313的结合域或任何合适的组分3313b。如图33C中详细所示，当抗体3313显示出对耦合到构成第一多个颗粒3311b的珠子的抗原3312b的高抗原结合亲和力时，会发生结合相互作用。当抗原(充当第一结合配偶体)3312b与抗体(充当第二结合配偶体)3313a的结合域结合时，结合的位点可以被称为集群位点或第一集群位点3314a。由细胞3317分泌的大量感兴趣抗体3313可以造成由抗体3313和抗原3312b之间的相互作用形成的较大集群尺寸。

此外，抗体3313的第二结合域3313b可以结合到耦合到构成第二多个颗粒3315b的珠子的单克隆抗体3316。第二集群位点3314b可以通过抗体(充当第三结合配偶体)的结合域3316和单克隆抗体(充当第四结合配偶体)3313b的结合而形成。

因而，双珠聚类分析可以使包括感兴趣细胞的POD能够被识别(例如，作为感兴趣物质的高分泌者的细胞，其也对另一种感兴趣物质具有结合亲和力的高特异性水平)。具有分泌高水平的感兴趣抗体并且其中所分泌的感兴趣抗体具有高抗原结合亲和力的细胞的POD可以导致大集群。当在整个POD中同时存在第一集群位点和第二集群位点时，可以形成大集群，诸如图33A中示为示例的POD3318a。

双珠聚类测定还可以启用不包括感兴趣细胞的POD的识别(例如，不分泌或分泌少量感兴趣物质的细胞和/或分泌感兴趣物质但所分泌的感兴趣物质对另一种感兴趣物质具有低结合亲和力)。具有不分泌感兴趣抗体的细胞或分泌少量感兴趣抗体的细胞的POD可以导致低于阈值尺寸的集群和/或没有可测量或可检测的聚类，诸如图33A中所示的POD3318b。此外，包含作为感兴趣抗体的高分泌者的细胞但其中感兴趣抗体具有低抗原结合亲和力的POD也可以导致低于阈值尺寸的集群和/或没有可测量或可检测的聚类，诸如图33A中所示的POD 3318d。当使用双珠测定分析样本时，仅通过抗体与单克隆抗体耦合的珠子的结合而形成的集群可以导致低于阈值尺寸(例如，通过颗粒尺寸分数(诸如本文所述的)测得的)或太小而无法检测的集群。双珠测定允许将由几种结合相互作用分组在一起而造成的放大的信号，诸如在示例POD 3318a中，其中感兴趣抗体能够通过其对抗原3312b的高亲和力将几个珠子分组在一起。因此，双珠测定可以是用于检测作为具有高抗原结合亲和力和/或特异性的感兴趣抗体的高分泌者的细胞的有用工具。

在一些变型中，第一结合配偶体可以包括第一蛋白质，并且第二结合配偶体可以包括第二蛋白质。在一些变型中，第一结合配偶体或第二结合配偶体可以是抗原或抗体。在一些变型中，第一结合配偶体可以包括第一肽，并且第二结合配偶体可以包括第二肽。此外，如下面进一步详细描述的，在一些变型中，第一多个颗粒和/或第二多个颗粒中的颗粒可以是细胞，诸如包括一种或多种抗原或抗体的细胞。

通过作为抗体3313的高分泌者，可以选择某些细胞作为感兴趣细胞，其中抗体3313具有高抗原结合亲和力和/或特异性，因此可以通过生成使用本文描述的成像方法可检测的信号来选择。信号的检测或测量可以通过单克隆抗体3316的特异性检测来执行。集群位点也可以通过本文描述的计算机视觉系统和方法来检测或测量。

在一些变型中，可以为包括一个或多个集群位点的POD指派颗粒尺寸分数(PSS)。例如，可以如以下示例中所述为PSD确定PSS并将其指派给POD。例如，具有较高PSS的POD可以被识别为包括感兴趣细胞(例如，高分泌细胞)，并且可以进行分选(例如，如上所述，通过电合并和分选过程等)，以从细胞群中分离出感兴趣细胞。分选出的细胞中的至少一些和/或其中的内容物可以进行进一步处理，诸如ELISA、FACS、DNA测序、PCR、其它合适的分析等。在一些变型中，可以从POD 3318移除感兴趣细胞以进行这种进一步处理。

如图33C中的3312b所示，可以充当第一结合配偶体的结合配偶体的示例可以包括抗原。

可以被选择用于使用双珠检测的感兴趣细胞的示例可以包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、B细胞、杂交瘤细胞、浆细胞、HEK293细胞、骨髓瘤细胞和T细胞等。

可以被选择用于使用双珠测定选择的感兴趣抗体的示例可以包括一类或多类抗体当中的抗体，诸如IgA、IgD、IgE、IgE和IgM等。

可以被选择用于使用双珠检测的感兴趣蛋白质和多肽的示例包括胰岛素、NT-pro-BNP、Pro-GRP、β-CTX、PINP、胰多肽、骨钙蛋白质、β

用于聚类测定的样本制备

图34A和34B描绘了制备用于聚类测定的样本的方法的示例性变型。例如，图34A描绘了示出制备用于单珠聚类测定系统的样本的示例性方法的流程图。该方法可以包括制备用在单珠测定中的第一多个颗粒(3428a)，其可以包括将珠子与多克隆抗体耦合，并且将珠子归一化到期望的工作浓度。该方法还可以包括提供细胞群，其可以包括至少一个感兴趣细胞(3421)。可通过在介质中洗涤并稀释至期望细胞浓度以产生细胞稀释液来制备细胞群。接下来，该方法可以包括诸如用涡旋器、搅拌器(例如，磁力搅拌器)、重复移液、搅拌等组合细胞群、第一多个颗粒和包封试剂，以产生混合物(3422)。如上面进一步所述，第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括第一结合配偶体，该第一结合配偶体对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性。该方法可以包括搅拌混合物以产生乳剂，从而将细胞群包封到样本实体中(3423)。样本实体可以被多分散(例如，PODS，诸如图32B中示为示例的POD 3218c)。该方法可以包括孵育乳剂(3427)。孵育乳剂可以例如为感兴趣细胞留出足够的时间来分泌可以与标记物颗粒(例如，第一多个颗粒)相互作用的感兴趣物质(如果有的话)。一旦被孵育，就可以对包封到样本实体中的细胞进行进一步分析，诸如通过将样本实体引入处理腔室中，如上文详细描述的，用于可视化、评估、合并和/或分选等。

图34B描绘了示出制备用于双珠聚类测定系统的样本的示例性方法的流程图。该方法可以包括制备用在双珠测定中的第一多个颗粒和第二多个颗粒(3428b)，其可以包括将第一多个珠子与抗原耦合，并且将第二多个珠子与抗体耦合，并且将两批珠子归一化到期望的工作浓度。在一些变型中，调整珠子浓度，使得在包括具有平均体积0.5nL的PODS的样本中，观察到通常在1小时内产生大于1ng/mL或高达100ug/mL的聚类。该方法可以包括提供细胞群，其可以包括至少一个感兴趣细胞(3421)。可以通过在介质中洗涤并稀释至期望细胞浓度以产生细胞稀释液来制备细胞群。该方法可以包括组合细胞群、第一多个颗粒、第二多个颗粒和包封剂组合以产生混合物(3422b)。与上述类似，可以用涡旋仪或搅拌器(例如，磁力搅拌器、重复移液等)来执行混合。第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体，并且第二多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体。该方法可以包括搅拌混合物以产生乳剂，从而将细胞群包封到多分散样本实体中(3423)。再次，多分散样本实体可以是PODS。搅拌步骤(3423)可以产生PODS，诸如POD3318c，在图33A中示为示例。该方法可以包括孵育乳剂(3427)，类似于上面关于单珠测定所描述的。一旦被孵育，就可以对包封到样本实体中的细胞进行进一步分析，诸如通过将样本实体引入处理腔室中，如上文详细描述的，用于可视化、评估、合并和/或分选等。

在一些变型中，用于制备用于单珠和双珠测定的样本的包封试剂可以包括表面活性剂。在一些变型中，表面活性剂可以包括氟和聚乙二醇(PEG)中的至少一种。在一些变型中，包封试剂可以占混合物的大约60％和90％之间。在一些变型中，混合物可以包括一个或多个悬浮在水性介质中的第一颗粒，每个第一颗粒包括第一结合配偶体。在一些变型中，一个或多个第一颗粒可以按体积计占混合物的大约5％和20％之间。在一些变型中，细胞群体可以按体积计占混合物的大约5％和20％之间。在一些变型中，样本实体可以包括多分散样本实体。在一些变型中，多分散样本实体可以是PODS。在一些变型中，第一结合配偶体可以包括第一蛋白质，并且第二结合配偶体可以包括第二蛋白质。在一些变型中，第一结合配偶体或第二结合配偶体可以是抗原或抗体。在一些变型中，第一结合配偶体可以包括第一肽，并且第二结合配偶体可以包括第二肽。在一些变型中，细胞群可以是CHO细胞、B细胞、杂交瘤细胞、浆细胞、HEK293细胞、骨髓瘤细胞或T细胞。

表1示出了可以被用在根据图34的方法或本文所述的任何系统或方法中的乳剂样本的示例性制剂，其使用1.5ml Eppendorf执行分析运行。表2示出了可以被用在根据图34-35的方法或本文所述的任何系统或方法中的250ml PODS样本的示例性制剂。表1和2没有解释样本中可能存在的任何载液。表3示出了用于完整样本测试的示例性配方，其可以被用在此处描述的任何系统和方法。在一些变型中，如本文所述，表3中概述的制剂可以被用于使用变暗的底物进行测定。

表1：示例性乳剂样本制剂

表2：示例性250ml PODS样本

表3：示例性样本制剂

如前所述，在单珠或双珠测定中使用的第一或第二多个颗粒中的颗粒可以是珠子。此类珠子可以是聚苯乙烯、金、纤维素、乳胶、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、玻璃或磁珠。在步骤3422中，在与细胞群体合并之前和同时，可以将珠子悬浮在水性介质中。充当第一和第二多个颗粒的珠子可以是聚苯乙烯、金、纤维素、乳胶、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、玻璃或磁珠，并且尺寸可以是10nm至大约50μm。

在一些变型中，珠子可以包括羧酸盐，并且可以具有大约0.3μm至大约6μm、大约0.05μm和大约20μm之间或大约0.1μm至0.3μm之间的直径。在一些变型中，珠子可以包括羧酸铕，并且可以具有在大约0.10μm至大约0.30μm之间的直径。在一些变型中，珠子可以包括羧基-聚苯乙烯，并且可以具有大约0.05μm至大约8μm或大约1至大约1.4μm之间的直径。在一些变型中，珠子可以包括羧酸基团，并且可以具有大约0.2μm至大约5μm之间的直径，或可以具有大约0.85μm或大约0.4μm的直径。

在一些变型中，细胞可以充当第一多个颗粒和第二多个颗粒中的颗粒。细胞可以在其细胞表面上自然表达抗原、蛋白质或其它此类标记物，并且这些细胞表面标记物可以像图32B和33C中所描绘的相互作用中那样充当第一结合配偶体，或者像图33C中所描绘的相互作用中那样充当第三结合配偶体。因此，在本文描述的单珠或双珠测定中，在其表面上表达标记物的细胞可以代替珠子。

在一些变型中，可以在单珠或双珠测定中利用具有已知结合配偶体或与其它蛋白质的已知相互作用的蛋白质。在这些变型中，抗体可以充当第一结合配偶体，诸如在图32B中所示的示例性实施例中，并且可以通过使用已知结合配偶体之间的键(在4343处指示)耦合到珠子4311a。类似于图32B中所示的实施例，抗体4312a可以通过由细胞分泌的感兴趣蛋白质被结合，例如，其可以生成用于测定的可测量或可检测的信号。再次，这可以指示分泌感兴趣蛋白质的细胞可以是高分泌细胞，因此是感兴趣细胞。在这些变型中，可以将充当第一结合配偶体4312a的抗体与具有已知结合配偶体的蛋白质缀合。如作为示例的图43A中所示，珠子4311a可以耦合到生物素4344。链霉亲和素4345，生物素4344的已知结合配偶体，可以与充当第一结合配偶体4312a的抗体缀合。生物素化的珠子可以与充当第一结合配偶体的抗体分开提供。例如，可以将多个生物素化的珠子作为试剂盒的一部分提供，其中可以将生物素化的珠子与充当第一结合配偶体的链霉亲和素缀合的抗体混合。可替代地，可以一起提供生物素化的珠子和抗体，使得以复合物提供第一结合配偶体，该复合物包括珠子4311a、生物素4344、链霉亲和素4345和抗体4312a，其中生物素4344和链霉亲和素4345被结合(在箭头4343处指示)。如图43B中所示，作为另一个示例，抗生蛋白质链菌素4345可以耦合到珠子4311a，并且生物素4344可以缀合到抗体4312a。类似于图43A中所示的实例，可以将具有链霉亲和素的多个珠子4311a作为试剂盒的一部分提供，其中珠子4311a可以与充当第一结合配偶体的生物素缀合的抗体混合。可替代地，耦合到链霉抗生物素蛋白质的珠子4311a和抗体可以被一起提供，使得在包括珠子4311a、链霉抗生物素蛋白质4345、生物素4344和抗体4312a的复合物中提供第一结合配偶体，其中链霉抗生物素蛋白质和生物素被结合(在4343处指示)。在这些示例中，多个珠子可以用于单珠或双珠测定，其中多个珠子中的每个珠子4311a与诸如生物素或链霉亲和素之类的蛋白质缔合，并且其中诸如生物素或链霉亲和素之类的蛋白质结合到已知的结合配偶体(诸如图43A-43B中所示的示例)，因此与充当用于单珠或双珠测定的第一结合配偶体4312a的抗体缔合。

在一些变型中，由细胞分泌的感兴趣抗体可以是IgG或其它免疫球蛋白质(例如，IgA、IgD、IgE、IgM等)。

在一些变型中，在单珠和双珠测定中使用的试剂可以包括MES钠盐、Tris、NaCl、Tween-20和BSA，以及它们的各种组合。

示例性样本制备

可以如下执行制备用于单珠聚类测定系统的样本的示例性方法。作为示例，并且如前所述，第一多个颗粒可以包括珠子。制备作为第一多个颗粒的珠子可以包括将珠子与抗体耦合并使珠子浓度归一化。首先，该过程可以包括将珠子等分到低结合试管中，将珠子制成颗粒并移除上清液。接下来，可以用诸如MES半钠盐之类的缓冲液洗涤珠子，然后可以将珠子重悬浮在新鲜的缓冲液中。可以以这种方式制备几个珠子重悬浮液。可以在室温下使用EDAC(水溶性碳二亚胺衍生物)，以便用EDAC溶液制成20X MES缓冲液。可以将结果所得的EDAC溶液添加到每个珠子悬浮液中，然后将其轻轻混合并在室温下旋转孵育。接下来，可以通过离心将珠子制成颗粒，用MES缓冲液洗涤，重悬浮于新鲜的缓冲液和抗体中，并孵育。在孵育近似一个半小时之后，可以添加封闭缓冲液。接下来，可以执行重复的洗涤和孵育步骤以完成抗体耦合过程。最后，可以洗涤珠子并将其重悬浮于存储缓冲液中，在此阶段，抗体耦合的珠子可以在4℃下存储以备将来使用。

接下来，为了获得具有适当归一化的浓度以用在单珠聚类测定中的珠子，可以通过测量其吸光度作为浓度的表示来对珠子进行归一化。例如，可以使用Nanodrop的OD600功能获得吸光度。可以使用浓度标准品，诸如市售的小鼠IgG珠子标准品，以获得珠子浓度。可以通过涡旋混合珠子，例如使用Nanodrop进行测量，然后旋转减慢，然后稀释或浓缩至期望浓度。

提供包括至少一个感兴趣细胞的细胞群的步骤(3421)可以包括制备细胞样本并产生细胞稀释液。这个过程可以包括对样本中的细胞悬浮液进行计数并检查细胞活力，然后用冰冷的介质洗涤细胞两次，并用新鲜的冰冷的介质将细胞重悬浮至工作浓度。工作浓度可以是例如4.4x 10

例如，可以通过首先将细胞群(可以作为如上所述制备的细胞稀释液提供)和第一多个颗粒(可以作为如上所述制备的抗体耦合的珠子提供)混合在一起来执行细胞群、第一多个颗粒和包封试剂的组合。可以将一定体积的悬浮在水性介质(诸如上述的缓冲液)中的珠子与等体积的细胞稀释液混合。例如，可以将与多克隆抗体(诸如IgG)耦合的30μl珠子与30μl细胞稀释液组合。细胞稀释液和珠子的混合可以通过用搅拌器(例如，磁力搅拌器)等反复进行轻柔的移液来执行。

接下来，可以将包封试剂添加到混合的细胞稀释液和抗体耦合的的珠子中，以获得用于产生乳剂的混合物。包封试剂可以包括表面活性剂，其可以是例如含氟表面活性剂。表面活性剂的组分的示例可以包括氟和聚乙二醇(PEG)，并且另外的示例性制剂在下表1-3中给出。可以通过搅拌混合物来获得乳剂，这可以通过涡旋执行。结果所得的乳剂可以包括其中包含细胞和珠子的样本实体。样本实体可以是多分散样本实体，诸如本文所述的PODS。因此，搅拌步骤(3423)可以产生PODS，诸如在图32A中作为示例示出的POD 3218c。

可以将乳剂与包封试剂一起在新鲜的管(例如，15ml锥形管)中孵育，将其在37℃的细胞孵育箱中用5％CO

除了如下所述之外，制备样本以用于双珠聚类测定的示例性方法可以类似于上文关于图34A所示的用于单珠聚类测定系统的样本的制备方法所描述的方法。

第一多个颗粒和第二多个颗粒可以包括几批珠子。可以将第一多个颗粒与抗原一起孵育，并且可以将第二多个颗粒与单克隆抗体一起孵育，如上述方法中所述。接下来可以将用于双珠测定的每批珠子如所述的那样归一化至期望的浓度，并且还可以如先前所述制备细胞稀释液。作为示例，当产生混合物时，可以将大约15μl的抗体耦合的珠子与大约15μl的抗原偶联的珠子混合，以获得30μl的珠子体积。然后可以将包括第一和第二多个颗粒的30μl珠子与等体积的细胞稀释液组合。

执行聚类测定

图35A和35B描绘了执行聚类测定的方法的示例性变型。图35A描述了从用于单珠测定的细胞群中选择至少一个感兴趣细胞的示例性方法。作为示例，可以使用以下示例性方法从细胞群中选择至少一个感兴趣细胞。该方法可以包括提供包括细胞群和第一多个颗粒的乳剂(3524)，其可以是根据参考图34A时描述的方法制备的乳剂。接下来，该方法可以包括测量针对至少一个样本实体的信号，其中该信号至少部分地与第一和第二结合配偶体的结合相关联(3525)，并且至少部分地基于测得的信号识别至少一个感兴趣细胞(3526)进行单珠测定。

可以提供第一多个颗粒悬浮在水性介质中，并且第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体。第一结合配偶体可以是例如多克隆抗体(如参考图32B所描述的)。第二结合配偶体可以是由感兴趣细胞分泌的抗体的结合域(如参考图32B所描述的)。颗粒、细胞样本和包封试剂可以在乳剂中提供，可以对其进行孵育以便分析信号。然后可以基于在第一和第二结合配偶体之间发生的结合相互作用来测量(3525)信号，这可以导致可检测的集群。例如，可以使用诸如本文描述的无透镜成像器或显微镜物镜来可视化集群。集群可以允许识别至少一个感兴趣细胞(3526)，并且可以允许选择包含至少一个感兴趣细胞的POD。例如，可以使用诸如上述的系统和方法(例如，电合并、分选)来对包含至少一个感兴趣细胞的一个或多个POD进行分选。测定因此可以使得能够选择包含至少一个感兴趣细胞的POD，用于进一步处理感兴趣细胞。

图35B描绘了从细胞群中选择至少一个感兴趣细胞用于双珠测定的示例性方法。该方法可以包括提供包括细胞群、第一多个颗粒和第二多个颗粒的乳剂(3524b)，其可以是根据参考图34B时描述的方法制备的乳剂。接下来，该方法可以包括测量针对至少一个样本实体的信号，其中该信号至少部分地与第一和第二结合配偶体的结合以及第三和第四结合配偶体的结合相关联(3525)，并且至少部分地基于测得的信号识别至少一个感兴趣细胞(3526)，以执行双珠测定。

可以提供第一多个颗粒和第二多个颗粒悬浮在水性介质中，并且第一多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体。第一结合配偶体可以是例如抗原(如参考图33C所描述的)。第二结合配偶体可以是由感兴趣细胞分泌的抗体的结合域(如参考图33C所描述的)。第二多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体。第三结合配偶体可以是例如单克隆抗体(如参考图33C所描述的)。第四结合配偶体可以是例如由感兴趣细胞分泌的抗体的结合域(如参考图33C所描述的)。颗粒、细胞样本和包封试剂可以在乳剂中提供，可以对其进行孵育以便分析信号。然后可以基于在第一和第二结合配偶体之间发生的结合相互作用来测量(3525)信号，这可以导致可检测的集群。例如，可以使用诸如本文描述的无透镜成像器或显微镜物镜来可视化集群。集群可以允许识别至少一个感兴趣细胞(3526)，并且可以允许选择包含至少一个感兴趣细胞的POD。例如，可以使用诸如上述的系统和方法(例如，电合并、分选)来对包含至少一个感兴趣细胞的一个或多个POD进行分选。测定因此可以使得能够选择包含至少一个感兴趣细胞的POD，用于进一步处理感兴趣细胞。

在一些变型中，将细胞群和第一多个颗粒包封到多个多分散样本实体中，并且将第一多个颗粒中的每个颗粒悬浮在水性介质中，并且包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第二结合配偶体具有特异性的第一结合配偶体。

在一些变型中，该方法还可以包括提供第二多个颗粒。第二多个颗粒也可以与第一多个颗粒一起包封到多分散样本实体中。第二多个颗粒中的每个颗粒可以包括对由至少一个感兴趣细胞分泌的第四结合配偶体具有特异性的第三结合配偶体(3527)。

示例性应用

图12示出了本文描述的系统和方法的各种研究和/或诊断应用的示例。在一些变型中，测定系统可以执行基于蛋白质的测定以检测各种蛋白质。例如，该系统可以被用于检测标记物，诸如免疫球蛋白质G(IgG)，甲胎蛋白质(AFP)，癌症抗原(例如，CA125、CA15-3)、碳水化合物抗原(例如，CA19-9)、癌胚促性腺激素(例如、hCG或β-hCG)、前列腺特异性抗原(PSA)等(例如，用于免疫学相关研究)、乳酸脱氢酶(LDH)(例如，进行评估组织损伤、诸如心脏压力和/或评估癌症等)、β2微球蛋白质(B2M)(例如，以帮助检测癌症)、细胞因子(诸如TNFα、IL-1、IL-2、IL-10、IL-12)、I型干扰素(例如，IFN-α、IFN-β)、IFN-γ、趋化因子等(例如，以评估发炎)和链霉亲和素(例如，以评估生物素化等)，等等。本文描述的系统还可以执行基于细胞的检测测定。例如，测定系统可以被用于检测白细胞(例如，使用抗CD45标记物，诸如用于评估白血病和/或癌症转移)、红细胞(例如，用于血液学)，以及酵母细胞(例如，用于表征表达向量)。测定系统还可以被用于执行基于表达的测定。例如，测定系统可以被用于检测杂交瘤、B细胞和噬菌体展示等的表达，诸如用于药物目标识别。

示例1

本文描述的系统被用于检测和区分多种尺寸的微球。例如，图13A是使用计算机视觉检测到的包封在PODS(1300)中的微米珠(1310)的带注释的图像。将包含2μm、5μm、10μm和15μm珠子的样本与包封试剂组合，以将样本包封到PODS中。将包含具有特定尺寸的微米珠的PODS的每个样本引入测定系统的成像室。当样本流过腔室时，无透镜图像传感器生成样本的阴影图像。分析图像以便检测PODS(1300)和微米珠(1310)的边界。除了识别PODS和微米珠之外，计算机视觉系统还测量了PODS内微米珠的相对尺寸，以产生颗粒尺寸分数(PSS)(例如，如以下关于示例2-5所描述的)。图13B是对于每个包含已知尺寸的微米珠的样本产生的分布，平均值和中值颗粒尺寸分数的曲线图。例如，图13B示出了由系统测得的在包含15μm珠子的样本中的颗粒尺寸分数(1320)的分布，并且表示了颗粒尺寸分数的均值(1330)和中位数(1340)。对于2μm、5μm、10μm和15μm的珠子样本，分别绘制了系统测得的分布、均值和中位数颗粒尺寸分数。因而，系统可以区分2μm、5μm、10μm和15μm的珠子。在2-15μm尺寸范围内进行区分的能力可以使系统具有执行各种测定的能力，诸如基于对POD内蛋白质和/或细胞团块的检测的测定。

示例2

本文描述的系统被用于执行量化蛋白质测定，例如以量化样本中IgG的浓度。例如，图14A-14C是示出计算机视觉检测各种浓度的PODS(1410)中的IgG蛋白质(1400)的图像。为了执行IgG的量化蛋白质测定，将多个样本(每个样本包括特定浓度的兔子IgG)组合，抗原缀合到对兔子IgG具有特异性的1-2微米乳胶珠。如图15D中所示，从七个样本中的每个样本中生成近似一百万个PODS，其中每个样本包含范围从0ng/mL到480ng/mL的的IgG浓度。将每个IgG和抗体缀合的珠子混合物样本与碳氟化合物油一起涡旋，以将蛋白质包封到PODS中。抗体与IgG蛋白质的结合导致IgG的凝集，并在PODS中形成IgG蛋白质块(“凝集物”)。然后将PODS引入测定系统的成像室。当PODS穿过腔室时，无透镜图像传感器生成样本的阴影图像。在每种浓度下，不到10分钟即可分析近似一百万个PODS。分析图像以检测PODS内的蛋白质质量，并从图像测量PODS和凝集物的各种参数，诸如PODS的尺寸和形状以及凝集物的灰度值。凝集物在阴影图像上呈现为较暗，从而可以检测PODS中的凝集物。

例如，图15A-15C描绘了使用计算机视觉技术针对IgG的多个测试浓度检测到的POD面积、POD半径和POD圆形度的POD参数。图15A示出了针对IgG的每个测试浓度的PODS的分布、均值和中位数面积。图15B示出了每个测试浓度下检测到的PODS的分布、均值和中位数半径。图15C示出了每个测试浓度下检测到的PODS圆形度值的分布、均值和中位数。

各种POD参数分数(“BE分数”)是从PODS的一个或多个测得的参数和/或PODS中的感兴趣特征(诸如聚合物、细胞、颗粒的尺寸和/或PODS中的那些聚合物、细胞和/或颗粒的改变)得出的。例如，图15E-15H图示了从可以从无透镜图像传感器生成的样本的图像中检测到的单个POD参数得出的BE分数的示例。图15E示出了BE分数1的分布、均值和中位数，每个浓度下每个POD内检测到的聚合物的平均灰度值的测量。图15F示出了BE分数2的分布、均值和中位数，每个测试浓度下PODS内检测到的聚合物的灰度标准偏差的测量。图15G示出了BE分数3的分布、平均值和中位数，每个测试浓度下PODS内检测到的聚合物的灰度最小值的测量。图15H示出了BE分数4的分布、平均值和中位数，每个测试浓度下PODS内检测到的聚合物的灰度最大值的测量。

此外，从PODS的多个测得的参数和/或PODS内的感兴趣特征(例如，聚合物、细胞、其它颗粒等)得出各种POD参数分数作为复合分数。复合POD参数分数可以提供信息(例如，与IgG浓度相关的趋势)，而该信息否则无法从在单个测得参数上得出的POD参数分数获得。例如，图16A-16D图示了从多个测得的POD特性的组合计算出的BE分数和/或从单个POD参数得出的BE分数的示例。从上述测试的IgG样本的图像计算出总共11个BE分数，其中四个被用于将图像特点与IgG浓度相关联，如图16A-16D中所描绘的。BE分数5(图16A中所示)一般是基于二值黑白图像(例如，POD中的对象被描绘为白色，而背景像素为黑色，反之亦然)的凝集程度。例如，BE分数5是基于对象像素与背景像素的比例，缩放至POD区域(例如，由POD区域划分)。BE分数6(图16B中所示)一般是基于二值黑白图像的距离变换(诸如上述)进行凝集的测量的另一种方法，其中BE分数6是基于结果所得的灰度图像的像素值，缩放至POD区域。BE分数7(图16C中所示)一般是基于POD中检测到的分离对象的数量的颗粒计数分数。BE分数8(图16D中所示)一般是颗粒尺寸分数，其与在成像的POD中识别出的所有物体的平均面积有关。一般而言，在实验的检测范围内，发现BE分数5-8随着IgG浓度的增加而增加。如图16A-16D中所描绘的，基于BE分数的IgG检测范围在大约30和大约480ng/mL之间。图16A-16D中的曲线图表明，在IgG检测范围内，BE分数5-8中的每一个都可以与IgG浓度相关。应用于BE分数5-8的数学算法被用于评估每个样本中IgG的浓度。因此，因为PODS内蛋白质块的尺寸一般随蛋白质浓度的增加而增加，所以平台从PODS图像中以2-15μm的水平测量蛋白质块尺寸的能力可能使平台能够使用从无透镜图像传感器生成的图像得出的特征来量化确定蛋白质浓度(例如，基于将一个或多个BE分数与浓度相关联、将一个或多个BE分数与一个或多个预定阈值进行比较等等的经验和/或计算模型)。

这些结果表明，从样本的阴影图像测得的PODS和凝集物的参数可以被用于基于一个或多个BE分数(诸如上述的分数)的组合来量化样本中的蛋白质浓度。因此，本文描述的测定系统可以被用于执行基于蛋白质的测定，以使用抗体缀合的珠子快速地量化样本中蛋白质的浓度，而无需使用荧光标记。

示例3

使用本文描述的系统，在珠子介导的IgG测定中执行测定间精度分析。测定间精度分析使得能够评估本文描述的测定系统的再现性和一致性，以及评价在不同IgG浓度下测定的灵敏度。这个信息被用于计算不同蛋白质浓度下的误差边际。例如，通过测试上述IgG测定中使用的每个IgG浓度的三个重复(R1、R2、R3)，执行测定间精度分析。图17A描绘了在每个测试浓度下三个重复中的每一个中的BE分数8的范围，其是中位数颗粒尺寸分数的测量。图17B描绘了在每个测试浓度下三个重复中的每一个中的BE分数2的范围，其是PODS内检测到的聚合物的中位数灰度标准偏差的测量。如图17A和17B中所证明的，不同IgG浓度水平表现出不同水平的精度，可以通过这些精度来测量这两个参数。例如，图17A和17B证明，对于至少一些BE分数，在检测范围的不同区段，测定系统的灵敏度随检测到的分析物的浓度而变化。例如，图17A和17B表明，颗粒尺寸分数中位数和灰度标准分位数中位数测量的精度一般随着IgG浓度的增加而降低(值的范围随浓度的增加而增加)。

示例4

本文描述的系统被用于测试兔子IgG测定，以确定牛血清是否干扰测定的特异性。用测定系统分别分析对照样本和实验样本。对照样本包括500倍稀释的牛血清。然后将对照样本引入系统的成像室，并且无透镜图像传感器生成包括对照样本的PODS阴影图像(图18A)。通过将960ng/mL兔子IgG血清与500倍稀释的牛血清和对IgG特异性的抗体缀合的珠子混合，并与包封试剂(例如，表面活性剂)组合，将IgG蛋白质包封到PODS中来制备实验样本。将实验用兔子IgG样本引入系统的成像室腔，并且无透镜图像传感器生成包括实验样本的PODS阴影图像(图18B)。

图18C描绘了对照样本和实验样本的BE分数8(如上面关于图16D描述的颗粒尺寸分数)的分布、均值和中位数。对照样本与实验样本之间BE分数8的分布、均值和中位数的差异证明，兔组IgG与牛血清没有显示出显著的种间反应性。换句话说，这个示例表明牛血清不会干扰测定的特异性。

示例5

本文描述的系统已成功用于基于细胞的检测测定(例如，细胞类型和细胞计数测定)。例如，本文描述的测定系统被用于检测样本中白细胞的存在，作为其它基于细胞的检测测定的说明。如图19A的示意图中所示，用抗CD45纳米颗粒(例如，玻璃珠)标记或“装饰”CD-45+白血球(白细胞)。为了识别样本中CD-45+白血球的存在，将包含CD-45细胞的样本与抗CD45纳米颗粒混合。纳米颗粒选择性地结合到CD-45细胞上的独特表面标记物，这提供了将CD-45细胞与其它细胞区分开的手段。将包括与纳米颗粒结合的CD-45细胞的样本与包封试剂混合，并涡旋以将CD-45细胞包封到PODS中。抗CD45纳米颗粒与CD-45细胞的结合导致CD-45细胞的凝集，并在PODS中形成CD-45凝集物。然后将PODS引入设备的成像腔室，无透镜图像传感器在PODS穿过腔室时生成阴影图像。计算机视觉系统分析PODS的图像(图19B)，以基于CD-45凝集物的增加的灰度值来检测CD-45细胞的存在。与其它细胞相比，PODS(1900)中的CD-45细胞凝集物(1910)在阴影图像中呈现为较暗，这允许计算机视觉系统检测和枚举CD-45细胞。使用测定系统识别带有纳米颗粒标记的CD-45细胞证明，该系统可以基于纳米颗粒与细胞表面标记物的选择性结合进行细胞检测和枚举。可以推断，该系统还可以被用于执行表现出表面标记物的各种细胞的检测和枚举。

示例6

本文描述的系统还可以被用于快速且高效地区分样本中的死细胞与活细胞。例如，本文描述的测定系统被用于检测和/或枚举死亡的酵母细胞。图20A描绘了包含死亡的酵母细胞(2010)的PODS(2000)的计算机视觉检测。为了执行死细胞计数测定，将酵母细胞用锥虫蓝染色，并用试剂包封到PODS中。将含有染色的酵母细胞的PODS样本引入测定系统的成像腔室中，并且当PODS穿过腔室时，成像系统生成PODS的阴影图像。基于与活细胞相比，死酵母细胞由于孔隙率增加而吸收更多蓝色染料这一事实，计算机视觉系统识别出阴影图像中的死酵母细胞。染色的酵母细胞在阴影图像中呈现为较暗，从而允许计算机视觉系统基于降低的灰度值识别颜色饱和的死酵母细胞。计算机视觉系统分析图像以提供如图20B中所示的死细胞颗粒计数分数和如图20C中所示的颗粒尺寸分数。测定系统提供死酵母细胞的死细胞计数和尺寸分数的能力证明，系统可以基于细胞染色技术的使用来检测、枚举和/或测量死细胞。可以外推这个能力以使用基于染色的细胞区分来执行各种细胞类型的计数。此外，在区分活细胞与死细胞之后，可以使用如本文所述的流体系统对活细胞和死细胞进行分选(例如，将感兴趣细胞分配到合适的容器(诸如孔板)中，以进行进一步的分析和/或培养)。

示例7

附加地或可替代地，用于处理样本的方法可以包括检测样本(或细胞本身)中的一种或多种细胞分泌物。例如，一般而言，在细胞分泌测定中，可以由一个或多个细胞分泌一种或多种分析物(例如，感兴趣蛋白质，诸如细胞因子或单克隆抗体(mAb))，并且确定(哪种)哪些分析物被分泌是可期望的。参考图22，可以将包括分泌细胞和至少一种检测试剂的样本分散到PODS中，并使其通过如上所述的测定系统来产生PODS的阴影图像。从细胞分泌的一种或多种感兴趣分析物可以对检测试剂具有特异性，使得结果所得的聚合导致在阴影图像中可检测的变暗的阴影物质。因此，POD中的聚合块的识别可以指示已经从细胞分泌了一种或多种感兴趣分析物。此外，多种分析物(例如，特定于与样本混合的不同试剂)可以使用测定系统并行地可识别。

示例8

杂交瘤细胞可以通过将特定的抗原注射到小鼠中、从小鼠体收集产生抗体的B细胞，然后将B细胞与肿瘤细胞融合以使其“永生”而产生。识别和收集产生大量期望抗体的杂交瘤细胞是有价值的。例如，产生大量IgG抗体(Ab)的杂交瘤细胞是要识别和收集的对于治疗目的有价值的细胞，其中IgG Ab是特异性的并且对某些抗原具有高亲和力和/或特异性。但是，用于筛选这种高分泌者杂交瘤细胞的常规方案昂贵且耗时，因为杂交瘤细胞必须在精心控制的环境下复制并繁殖数天。

在一个示例中，使用腔室和成像器阵列系统来处理样本的方法(诸如本文所述的)可以被用于识别作为针对特定目标的抗体的高分泌者或生产者的杂交瘤细胞。通过将杂交瘤细胞(小鼠细胞)与抗小鼠IgG pAb耦合的1μm聚苯乙烯珠以及带有表面活性剂的载体油一起涡旋制备样本，以形成包含PODS的乳剂，其中每个PODS均载有多于一个细胞(使得每个POD的平均细胞数λ>1)。使用上述腔室和成像器阵列系统在t＝0、t＝1小时(孵育1小时之后)和t＝4小时(孵育4小时之后)对样本进行成像。如这些图像中所示(图27，在4倍物镜和10倍物镜放大倍率下)，PODS中的大集群仅在1小时之后即可观察到，在4小时后可进一步观察到。因此，图27的图像表明，即使在短暂的1小时孵育期之后，杂交瘤细胞仍会在PODS内的可检测范围内分泌IgG，使得杂交瘤细胞具有足够强的生物信号(例如，在图像中表现为可识别出的团块)可以在PODS中被识别。在一些变型中，可以进一步分选和收集这种高分泌者杂交瘤细胞，作为具有高浓度的高分泌者杂交瘤细胞的输出。

示例9

图29A是用于电合并腔室布置的示例性变型和具有PODS的示例性样本的示例性系统参数的表格。示例性样本包括以下的混合物：(i)所指示体积的水性细胞介质与近似1000万个B细胞和(ii)所指示体积的载体油与表面活性剂，从而导致图29A中概述的组成，包括总计约1亿5400万个具有所指示的POD特性的PODS。样本中的一些PODS小于35μm的腔间隙间距，并且在腔室中时呈球形(未展平成扁圆形)。由于这些PODS的形状，将更加难以检测其中包含的细胞，并可能造成感兴趣细胞无意中丢失或废弃。

执行概率建模以估计电合并腔室布置未检测到的细胞数量。样本的实际POD直径分布在图29B中示出，并且可以紧密建模为伽玛分布(图29C)。鉴于图29A中所示的平均POD特点使用概率建模，会被忽略掉但实际上并不空的“小”PODS(即，小于35μm并且体积小于22pL)的预期百分比大约为0.017％。换句话说，假设每个被忽略的POD最多容纳1个细胞，那么在腔室中处理样本将导致无法检测每百万PODS近似170个细胞，或总共大约2615个细胞。给定原始样本中的B细胞总数为1540万，这意味着可能无法检测到样本中大约0.017％的细胞。因此，对与图29A-29C相关联的样本和系统的分析表明，使用本文描述的腔室可能仅无意地检测不到小比例的细胞。

示例10

如上所述，可以执行如本文所述的单珠和/或双珠聚类测定，以识别细胞群内的特定感兴趣细胞。感兴趣细胞可以是目标分析物(诸如抗体)的高分泌者，或者可以是对抗原具有高亲和力的目标分析物的高分泌者。执行实验测试以证明B细胞和CHO细胞可以使用本文描述的单珠或双珠测定在指定的时间范围内在PODS中生成可测量和可检测的信号。

图36A-36C描绘了来自单珠测定的测试的4倍物镜显微镜细胞图像。为了证明单珠测定，制备了一批抗小鼠IgG多克隆(pAb)珠(图36A)和两批抗人IgG pAb珠(图36B-36C)以执行单珠测定。图36A-36C示出，当存在10μg/ml的小鼠或人IgG时，所有批次的珠子都示出聚类。每个批次都以无细胞(NC)对照示出。

图37描绘了使用如本文描述的单珠测定执行的测试的图像，其被用于评估PODS中分泌小鼠IgG的单个杂交瘤细胞。在孵育之后的时间＝0、t＝1小时、t＝2小时、t＝4小时和t＝6小时示出了4倍和10倍物镜的显微镜图像。图像示出了从t＝1小时开始的所有时间点的聚类。

图38描绘了使用如本文描述的双珠测定执行的测试的图像，其被用于评估PODS中分泌抗原特异性抗体的单个杂交瘤细胞。在测试中分析了牛IgM抗原特异性抗体。在孵育之后的时间＝0、t＝1小时、t＝3小时和t＝5小时示出了4倍和10倍物镜的显微镜图像。图像示出了从t＝1小时开始的所有时间点的聚类。

使用分泌不针对特异性抗原的抗体的细胞系执行测试以检查非特异性背景聚类。分泌抗牛胰岛素的杂交瘤细胞(HB-123细胞系)在牛IgM抗原双珠测定中用作对照。使用牛IgM抗原珠。CRL-1894细胞系也被用于测试特异性聚类，其中已知CRL-1894细胞分泌抗牛IgM单克隆抗体。添加0.005％的台盼蓝以监视整个测试过程中的细胞活力。

图39A描绘了使用HB-123细胞系进行的测试得出的4倍物镜显微镜图像，其中没有预期聚类。图像示出，在时间＝0、t＝1小时和t＝3小时时，没有发生背景聚类。相反，图39B-39D示出了在时间＝0、t＝1小时和t＝3小时的10倍物镜显微镜图像，示出了从t＝1小时开始发生了聚类。测得细胞活力为大约84％。

为了解释的目的，前面的描述使用特定的术语来提供对本发明的透彻理解。但是，对于本领域的技术人员将清晰的是，不需要具体细节即可实践本发明。因此，出于说明和描述的目的，给出了本发明的特定实施例的前述描述。它们并不旨在是详尽的或将本发明限制到所公开的精确形式；显然，鉴于以上教导，许多修改和变型是可能的。选择和描述实施例是为了解释本发明的原理及其实践应用，因此它们使本领域的其他技术人员能够利用本发明以及具有适于预期的特定用途的各种修改的各种实施例。意图是以下权利要求及其等同物限定本发明的范围。