一种用于近平滑念珠菌检测的探针、方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，涉及一种用于近平滑念珠菌检测的探针、方法及应用，具体涉及一种用于沿海人群呼吸道近平滑念珠菌快速检测的探针、方法及应用。

背景技术

在航海过程中，气候变化、环境变化、劳累等使航海官兵发生呼吸道感染的几率增高，而沿海地区，受海洋气候影响，也会有部分海洋环境病原微生物适宜生长。海洋环境相关感染性疾病通常发病率高，不仅影响工作和生活，有时还可伴有严重并发症，并具有一定的传染性，应积极防治。

近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)，是一种真菌，是2002年经全国科学技术名词审定委员会审定发布的新种，目前认识和研究较少。

在对现有文献的分析中，未见呼吸道近平滑念珠菌18S rRNA序列的克隆与特异性核酸分子探针，及其在菌种鉴别中应用的报道，至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于近平滑念珠菌检测的探针、方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，是近平滑念珠菌rDNA的核苷酸序列(18S rRNA)设计探针，该探针准确可靠、操作性强、灵敏度高，可以进行菌种鉴定、临床检测以及分子诊断，对于近平滑念珠菌感染性疾病以及沿海环境中近平滑念珠菌的快速检测具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于近平滑念珠菌检测的探针，所述探针是根据近平滑念珠菌rDNA的核苷酸序列设计，所述探针源自如下任一项所示序列：

1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2)如1)所示序列的其中一段不少于15bp的寡核苷酸序列；

3)由1)或2)所示序列经过缺失、取代或插入得到的具有95％以上同源性的核苷酸序列。

优选的是，所述近平滑念珠菌rDNA的核苷酸序列包含a)或b)：

a)所述近平滑念珠菌rDNA的核苷酸序列为与SEQ ID NO：1所示序列中的第494-693位核苷酸序列具有95％的同源性的序列；

b)所述近平滑念珠菌rDNA的核苷酸序列为可与SEQ ID NO：1所示序列中的第494-693位核苷酸序列杂交的序列。

优选的是，所述探针包括如SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列。

本发明还提供一种近平滑念珠菌检测方法，包括如下S1或S2所示方法：

S1：基于核酸分子杂交技术，利用所述探针检验，获取特征性图谱，以用于疑似近平滑念珠菌的检测；

S2：基于PCR扩增技术，以所述的SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列为引物，或者以所述的SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列中任一条与如SEQ ID NO：4-5所示序列配对成引物组，经扩增获取特征性条带，以用于近平滑念珠菌的鉴定。

进一步地，所述PCR扩增中的所述探针使用规则及判断结果如下：

以rDNA 18S rRNA珠芽蓼特异性分子探针Fcp和Rcp作为上下游寡核苷酸分子探针对(如SEQ ID NO：2-3所示的寡核苷酸序列)，进行PCR反应，扩增产物约199bp。

在本发明中，术语“分离”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“近平滑念珠菌特征性18S rRNA序列”是指，近平滑念珠菌rDNA(即近平滑念珠菌核糖体rRNA基因转录)的核苷酸序列，由于该区高度可变，进化速度最快，在真核生物的种间存在巨大差异(见图1)，因此常被用于真菌的系统分类与进化关系研究。由于种内18S rRNA的可变性，所以与SEQ ID NO.1中第494-693位核苷酸序列同源性低至约95％的变异序列也被认为属于近平滑念珠菌。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从第494-693位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第494-693位的核苷酸序列的同源性至少95％，更佳地至少99％，最佳地100％的核苷酸序列。

本发明还提供一种用于近平滑念珠菌检测的产品，包括所述的探针。

优选的是，所述产品包括试剂盒或检测试剂。

本发明还提供一种所述的探针的应用，用于制备筛查近平滑念珠菌、辅助近平滑念珠菌感染检测或菌种鉴定的试剂盒或检测试剂。

本发明公开了以下技术效果：

1.本发明公开的近平滑念珠菌18S rRNA区是一个高度可变区，其序列差异性反映近平滑念珠菌种间和种内甚至居群间的亲缘关系，即差异越小，亲缘越近，道地性就越强。基于本发明所提供的近平滑念珠菌18S rRNA特征性核苷酸序列，依据待测样品18S rRNA序列的同源性比对(标准差异性<5％范围内)，可以判别样品的道地性程度，这无疑将有助于建立准确高效的近平滑念珠菌病原菌鉴定和快速检测。

2.本发明公开的是近平滑念珠菌菌种特异性核酸的特异性探针，因此在样品未知的前提下，可通过检测能否从样品中获得与此相同的核苷酸序列，快速方便地判断样品是否为近平滑念珠菌，或检测样品的真伪。

3.本发明公开的近平滑念珠菌鉴别方法是一种分子生物学技术，其直接检测样品为DNA分子，即只要能提取DNA的呼吸道组织液，包括肺泡灌洗液、痰液、组织研磨液、血液等，都能采用本发明进行快速便捷、高效准确的检测和鉴别，而且样品需要量极少。

4.本发明在近平滑念珠菌感染性疾病的病原鉴定、快速检测、公卫防控和抗生素合理用药等方面具有重要作用，也有利于推进感染性疾病的精准医疗。因此，本发明具有很大的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明近平滑念珠菌18S rRNA核苷酸序列和原NCBI上近平滑念珠菌18SrRNA核苷酸序列(GenBank Accession No.JF803739)比对结果；

图2为18S-26S rDNA的基本结构及18S rRNA区的分布和定位；

图3.DNA质量检测；

图4.实施例1中近平滑念珠菌样品阳性样本(a)和阴性样本(b)的溶解曲线图；

图5.实施例1中利用本发明的近平滑念珠菌特异性分子探针的PCR示意结果；其中M泳道为空白对照(Marker)，1泳道为阳性样本1，2泳道为阳性样本2，3泳道为阴性对照。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，例如Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1近平滑念珠菌特征性18S rRNA序列的PCR扩增

一、待测样品中DNA提取

分离DNA的样品，以疑似近平滑念珠菌感染性疾病样品的DNA制备为例进行说明。其中，疑似近平滑念珠菌感染样品采自广东医科大学附属医院沿海人群临床ICU患者痰液。利用基因组提取试剂盒提取基因组DNA，具体方法如下：

1.样本预处理

(1)液体样本中加入等体积的4％NaOH；充分震荡混匀，于37℃液化15分钟(样本较浓时可适当增加NaOH量，延长液化时间。)

(2)脓液拭子置于装有500μL 0.9％的生理盐水的1.5mL离心管中震荡涮洗30s,再加入500μL 4％NaOH，震荡混匀，于37℃液化15分钟。

(3)12000rpm离心5分钟，沉淀用1mL 1×TE(PH＝8.0)或用生理盐水清洗一次，12,000rpm离心5min，弃上清。

2.核酸提取

(1)预处理后沉淀加300μL的Lysis buffer充分悬浮，所有液体转入核酸提取管内，恒温金属浴上最大转速、95℃振荡10min，静置至室温。12000rpm离心1min，上清转至新EP管(约200～250μL上清)。

(2)加入10μL Proteinase K，充分混匀，70℃，10min。

(3)加入750μL Binding Buffer混匀，然后加入15μL磁珠(使用前充分混匀磁珠)，室温轻柔颠倒混匀10min。

(4)短暂离心，将离心管置于磁力架上1min，使磁珠吸附侧壁；避开磁珠，吸出管内液体，从磁力架上取下离心管。

(5)吸取500μL Wash Buffer I，从吸住吸附一侧管壁快速打入，轻柔颠倒混匀1min，利用磁力架吸附磁珠，避开磁珠吸出管内液体，取下离心管。

(6)吸取500μL Wash BuffeII，从磁珠吸附一侧快速打入，轻柔颠倒混匀1min，利用磁力架吸附磁珠，避开磁珠吸出管内液体。

(7)重复步骤(6)，离心管仍置于磁力架上。

(8)从离心管另一侧缓慢加入550μLWash BuffeIII，1min后用加样枪吸出管内液体，晾干。

注意：若磁珠吸附位置较高，未能被Wash Buffer III没过，则可酌情增加WashBuffeIII的用量，但注意该步骤时间不要太长，并且不能吹散磁珠。

(9)取下离心管，加入130μL Elution Buffer，使磁珠重新悬浮。恒温振荡器，300rpm，55℃，10min。将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将洗脱液转移至干净的离心管。

(10)磁珠管中再加入130μLElution Buffer，使磁珠重新悬浮，恒温振荡器，300rpm，55℃，10min。将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将洗脱液与(9)中洗脱液合并，洗脱的DNA直接用于检测或-20℃保存。

所提取的DNA，用Nanodrop进行核酸纯度和浓度检测。结果显示DNA色谱图清晰，质量较佳，可用于PCR扩增(图3)。

二、近平滑念珠菌特征性18S rRNA序列的PCR扩增

基于近平滑念珠菌核糖体rDNA的分子结构稳定性、遗传进化保守性和序列信息同源性，以上述提取的DNA作为模板进行扩增近平滑念珠菌18S rRNA区的引物：

上游引物F:5′-GCAGACAAATCACTCCACC-3′；下游引物R:5′-GGGAGTATGGTCGCAAGG-3′；

反应体系均为(20μL)：ddH

PCR反应程序：95℃(30s)，1cycle；95℃(5s)，60℃(30s)，45cycles。融解曲线分析模式为：93℃(5s)，60℃(1min)，1cycle，溶解曲线分析结果显示仅有阳性样品由特征峰出现(见图4)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测，获得199bp的特异性条带(见图5)。

回收后连接到pGEMT-Easy载体上，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列与已知白色念珠菌的18SrRNA序列的同源性很高，故初步认为它是一个近平滑念珠菌18SrRNA序列。因此，我们认为本发明所提供的18SrRNA序列为近平滑念珠菌菌种特征性核苷酸序列。

实施例2近平滑念珠菌病原鉴定的特异性核酸分子探针的制备、鉴定与检测

应用Primer Premier 5软件，针对近平滑念珠菌18SrRNA序列，在排除其与已知亲缘菌种的同源序列后，设计出特异性引物Fca(SEQ ID NO.2)和Rca(SEQ ID NO.3)，其核苷酸组成和排列为进近平滑念珠菌鉴别的最佳特异性寡核酸片段。因此，在DNA自动合成仪上进行化学合成，获得可长期储存和方便使用的核酸干粉制品，即为近平滑念珠菌物种鉴定的特异性核酸分子探针。

然后按照下述PCR反应体系及程序方案：

反应体系均为(20μL)：ddH

PCR反应程序：95℃(30s)，1cycle；95℃(5s)，60℃(30s)，45cycles。融解曲线分析模式为：93℃(5s)，60℃(1min)，1cycle。

用本发明中的该对分子探针作为寡核苷酸引物，扩增近平滑念珠菌感染性疾病的病原样品的DNA模板(样品包括肺泡灌洗液、痰液、组织研磨液、血液)，最终获得近平滑念珠菌特异性电泳条带，约为199bp。再经胶回收纯化和测序比对后，证实扩增产物的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第494-693位核苷酸序列有100％同源性。证实本发明所提供的特异性核酸分子探针具有高度的物种专一性，能用于近平滑念珠菌的病原鉴定和快速检测。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江） 广东医科大学附属医院

<120> 一种用于近平滑念珠菌检测的探针、方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttttac ttcctctaaa 60

tgaccaagtt tgactagctt ctcggttcca agatggagtt gcccccttct ctaaaccaat 120

ccggaagcct cactaagcca ttcaatcggt agtagcgacg ggcggtgtgt acaaagggca 180

gggacgtaat caacgcaagc tgatgacttg cgcttactag gaattcctcg ttgaagagca 240

ataattacaa tgctctatcc ccagcacgac ggagtttcac aagatttccc agacctctcg 300

gccaaggttt atactcgctg gctccgtcag tgtagcgcgc gtgcggccca gaacgtctaa 360

gggcatcaca gacctgttat tgcctcaaac ttccatcgac ttgaaatcga tagtccctct 420

aagaagtgac tataccagca aatgctagca gcactattta gtaggttaag gtctcgttcg 480

ttatcgcaat taagcagaca aatcactcca ccaactaaga acggccatgc accaccaccc 540

acaaaatcaa gaaagagctc tcaatctgtc aatccttatt gtgtctggac ctggtgagtt 600

tccccgtgtt gagtcaaatt aagccgcagg ctccactcct ggtggtgccc ttccgtcaat 660

tcctttaagt ttcagccttg cgaccatact ccccccagaa cccaaagact ttgatttctc 720

gtaaggtgcc gattgcgtca ataaaagaac aacaaccgat ccctagtcgg catagtttat 780

ggttaagact acgacggtat ctgatcatct tcgatcccct aactttcgtt cttgattaat 840

gaaaacgtcc ttggtaaatg ctttcgcagt agttagtctt cagtaaatcc aagaatttca 900

cctctgacta ctgaatactg atacccccga ccgtccctat taatcattac gatggtccta 960

gaaaccaaca aaatagaacc ataacgtcct attctattat tccatgctaa tatattcgag 1020

caaaggcctg ctttgaacac tctaattttt tcaaagtaaa agtcctggtt cgccaaaaag 1080

gctagccaga aggaaaggct cggctgggtc cagtacgcat caaaaaagat ggaccggcca 1140

gccaagccca aggttcaact acgagctttt taactgcaac aactttaata tacgcttttg 1200

gagctggaat taccgcggct gctggcacca gacttgccct ccaattgttc ctcgttaagg 1260

tatttacatt gtactcattc caattacaag acccgaaagg gccctgtatc gttatttatt 1320

gtcactacct ccccgtgtcg ggattgggta atttgcgcgc ctgctgcctt ccttggatgt 1380

ggtagccgtt tctcaggctc cctctccgga atcgaaccct tattccccgt tacccgttga 1440

aaccatggta ggccactatc ctaccatcga aagttgatag ggcagaaatt tgaatgaacc 1500

atcgccagca caaggccatg cgattcgaaa agttattatg aatcatcaaa gagcccgaag 1560

gcattgattt tttatctaat aaatacatcc cttccaaaca gtcgggattt taagcatgta 1620

ttagctctag aattaccacg gttatccaag tagtaaggta ctatcaaata aacgataact 1680

gatttaatga gccattcgca gtttcactgt ataattgctt atacttagac atgcatggct 1740

taatctttga gacaagcata tgactactgg caggatcaac cagata 1786

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagacaaat cactccacc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggagtatgg tcgcaagg 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taggtgaacc tgcggaagga tca 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttccctgttc actcgccgtt act 23