快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，属于人血液中性粒细胞分离技术领域。

背景技术

据申请人了解，中性粒细胞是宿主血液中最为丰富的免疫细胞类型，在抵御诸多病原体入侵的过程中发挥第一道防线的作用。中性粒细胞具有活跃的变形运动和吞噬功能，起到非常重要的防御作用；其吞噬对象以细菌为主，同时也吞噬异物。中性粒细胞在骨髓中产生，经过早幼粒、中幼粒、晚幼粒、杆状核和分叶核粒细胞，最终以成熟形式释放到外周血或组织中。需要注意的是，当病原体的负荷超过机体免疫细胞的承载负荷后，会引发炎性的瀑布反应，对生命造成极大威胁，而在临床多种抗感染治疗中，多数仅针对病原微生物体的干预，而针对免疫细胞激活及其引起的炎性因子瀑布效应的干预较少且效果欠佳。免疫细胞种类繁多，细胞间相互作用，作为免疫细胞最为丰富的细胞类型，如何针对这一最大亚群免疫细胞的干预尤为重要。因此，获得超高纯度(纯度大于99％)的中性粒细胞是靶向研究免疫细胞炎性瀑布反应的迫切需求，亦是研究中性粒细胞炎性反应理论的基础。

目前对于中性粒细胞的分离方法有：梯度离心法(如：Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法)，红细胞裂解法，Dextran细胞沉降法等，但却存在较多缺陷。梯度分离法目前使用较多，但在细胞梯度分层时存在与单核细胞等混合，后期获得中性粒细胞数量少，且较多混杂细胞的缺陷；红细胞裂解法虽然简单，但混合大量免疫细胞，纯度较低，不适合免疫细胞炎性的靶向干预；Dextran细胞沉降法存在分离时间长，分离后中性粒细胞被激活甚至出现死亡的情况。因此，亟待研发能快速分离获得超高纯度人体血液中性粒细胞的技术手段。

经检索发现，专利号CN201280057552.5、授权公告号CN103946373B的发明专利，公开了一种用于从含有红细胞的样品中分离细胞的方法，该方法从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中回收所需的细胞，包括：

a)将样品与组合物相接触，该组合物包含：i)红细胞凝集试剂，ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有至少一种抗原识别部分的颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；b)同时应用i)用于红细胞沉降的重力沉降和ii)磁场梯度于样品以用于固定磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，和c)从上清液相回收所需的细胞。然而，该技术方案并非专门针对中性粒细胞而设计，且成本较高。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的问题，提出一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，能够快速分离获得超高纯度的中性粒细胞，其纯度大于99％，从而为针对中性粒细胞炎性的研究提供技术平台。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、先将中性粒细胞分离液加入分离管，再将人体全血加至中性粒细胞分离液的上方并形成全血层；

第二步、将分离管进行离心，使管内液体分为5层，各层从上至下依次为血浆层、细胞分离液层、单核细胞层、中性粒细胞层、红细胞层，其中血浆层为顶层，红细胞层为底层；先弃去血浆层、细胞分离液层以及单核细胞层，再将中性粒细胞层、以及由中性粒细胞层向红细胞层过渡的液体收集至洁净的分离管中，并弃去作为底层的红细胞层；

第三步、将第二步所得液体进行稀释、离心后，弃去上清，获得细胞团块；加入红细胞裂解液并悬浮细胞，置于冰上进行裂解；之后，离心弃去上清，重悬细胞；

第四步、采用中性粒细胞磁珠分选试剂盒，取试剂盒中的抗体并加至第三步所得重悬细胞中，颠倒混匀；加入磁珠并颠倒混匀；将分离管插入磁铁架中静置；静置后，将分离管中含细胞的缓冲液转移至洁净的分离管，即得超高纯度人体血液中性粒细胞。

该方法能极大程度地解决其他免疫细胞对中性粒细胞的影响，使得中性粒细胞分离的纯度稳定>99％，同时减少了分离时间(全过程约1小时左右)，这对于临床感染性疾病中性粒细胞炎性反应的干预提供了良好的技术平台，具有重要的应用价值。

本发明进一步完善的技术方案如下：

优选地，在第一步之前，将所有试剂静置于室温下，待各试剂温度稳定后再从第一步开始进行分离；所述室温指环境温度。

采用该优选方案，可使后续的分离过程能更顺利地实施。

优选地，第一步中，所述中性粒细胞分离液与人体全血的体积比为1±0.1：1；第二步中，离心条件为500±10g/min离心20-30min，且离心刹车设置为0。

更优选地，第三步中，采用不含钙镁的HBSS缓冲液进行稀释，该HBSS缓冲液与人体全血的体积比为2±0.1：1，颠倒混匀数次使细胞悬浮；稀释后的离心条件为350±5g/min的速度离心10-15min；所述红细胞裂解液与人体全血的体积比为1.6±0.1：1；置于冰上的裂解时间为5-8min；裂解后的离心条件为250±5g/min的速度离心5-10min；重悬细胞时采用不含钙镁的HBSS缓冲液，该HBSS缓冲液与人体全血的体积比为0.6±0.1：1，重悬细胞后将整个液体转移至洁净的分离管中。

更优选地，第四步中，抗体体积与细胞浓度的比例为5±0.5μl：5±0.5×10

更优选地，第四步中，颠倒混匀时采用旋转混合器，在转子转速12±2rpm下匀速转动5-10min；静置时间为8-10min，静置过程中分离管保持开盖；转移过程中保持分离管插在磁铁架中。

更优选地，第三步中，颠倒混匀的动作幅度要轻柔、并保持在确保白细胞不被激活的程度以内；第四步中，将分离管中含细胞的缓冲液转移至洁净的分离管后，加入抗体并置旋转混合器中于转子转速12±2rpm下匀速转动5-10min，加入磁珠并置旋转混合器中于转子转速12±2rpm下匀速转动5-10min，将分离管插入磁铁架中静置至少5min，之后再转移至另一洁净的分离管，即得超高纯度人体血液中性粒细胞。

更优选地，第一步中，所述中性粒细胞分离液为HISTOPAQUE-1119，Catalog#RNBH2808；第三步中，所述红细胞裂解液为Fisher/Gibco-Catalog#A1049201；第四步中，所述中性粒细胞磁珠分选试剂盒为Stem cell kit-Catalog#17957，所述抗体为Cocktail抗体，所述磁铁架为EasySep

采用以上优选方案，可进一步优化各步的具体参数和具体细节。其中，在第三步若红细胞裂解时间长于限定时间则易影响中性粒细胞活性；在第四步颠倒混合可使抗体与细胞充分接触，以免最终所得中性粒细胞纯度下降。

优选地，第一步中，加人体全血过程中保持分离管不晃动；第二步中，若离心后分层不清晰，则重复离心步骤，直至分层清晰；第三步中，重悬细胞后若发现裂解不充分，则重复裂解步骤一次。

采用该优选方案，可进一步确保分离效果。

优选地，所述方法还包括在第四步之后的细胞纯度鉴定步骤。

注：以上的时间单位min为分钟。离心刹车设置为0是指在离心结束时无刹车自然停转。

与现有技术相比，本发明能极大程度地解决其他免疫细胞对中性粒细胞的影响，使得中性粒细胞分离的纯度稳定>99％，同时减少了分离时间(全过程约1小时左右)，这为临床感染性疾病中性粒细胞炎性反应的干预提供了良好的技术平台，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2的流式细胞术鉴定结果图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1

本实施例为快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞。

本实施例的基本过程包括：

在第一步之前，将所有试剂静置于室温下，待各试剂温度稳定后再从第一步开始进行分离；室温指环境温度。

第一步、先将中性粒细胞分离液加入分离管，再将人体全血加至中性粒细胞分离液的上方并形成全血层；

其中，中性粒细胞分离液与人体全血的体积比为1±0.1：1；加人体全血过程中保持分离管不晃动。

第二步、将分离管进行离心，使管内液体分为5层，各层从上至下依次为血浆层、细胞分离液层、单核细胞层、中性粒细胞层、红细胞层，其中血浆层为顶层，红细胞层为底层；先弃去血浆层、细胞分离液层以及单核细胞层，再将中性粒细胞层、以及由中性粒细胞层向红细胞层过渡的液体收集至洁净的分离管中，并弃去作为底层的红细胞层；

其中，离心条件为500±10g/min离心20-30min，且离心刹车设置为0；若离心后分层不清晰，则重复离心步骤，直至分层清晰。

第三步、将第二步所得液体进行稀释、离心后，弃去上清，获得细胞团块；加入红细胞裂解液并悬浮细胞，置于冰上进行裂解；之后，离心弃去上清，重悬细胞；

其中，采用不含钙镁的HBSS缓冲液进行稀释，该HBSS缓冲液与人体全血的体积比为2±0.1：1，颠倒混匀数次使细胞悬浮，颠倒混匀的动作幅度要轻柔、并保持在确保白细胞不被激活的程度以内；稀释后的离心条件为350±5g/min的速度离心10-15min；红细胞裂解液与人体全血的体积比为1.6±0.1：1；置于冰上的裂解时间为5-8min；裂解后的离心条件为250±5g/min的速度离心5-10min；重悬细胞时采用不含钙镁的HBSS缓冲液，该HBSS缓冲液与人体全血的体积比为0.6±0.1：1，重悬细胞后将整个液体转移至洁净的分离管中。重悬细胞后若发现裂解不充分，则重复裂解步骤一次。

第四步、采用中性粒细胞磁珠分选试剂盒，取试剂盒中的抗体并加至第三步所得重悬细胞中，颠倒混匀；加入磁珠并颠倒混匀；将分离管插入磁铁架中静置；静置后，将分离管中含细胞的缓冲液转移至洁净的分离管，即得超高纯度人体血液中性粒细胞；

其中，抗体体积与细胞浓度的比例为5±0.5μl：5±0.5×10

以下是作为示例的具体过程：

(1)采用的具体原料物质。

人全血5ml，中性粒细胞分离液(HISTOPAQUE-1119，Catalog#RNBH2808)，15ml的透明离心管中(Falcon Tube)，不含钙镁的HBSS缓冲液，红细胞裂解液(Fisher/Gibco-Catalog#A1049201)，5ml的分离管(Falcon Tube)，磁珠分选试剂盒(Stem cell kit-Catalog#17957)，磁铁架(EasySep

(2)具体步骤如下：

1、将所有试剂置于室温中，待温度稳定后，进行中性粒细胞的分离。

2、将5ml的中性粒细胞分离液置于15ml的透明分离管中，取5ml全血，小心加到分离液的上层，此时可清晰的观察到血液位于分离液的上层。

3、室温500g/min离心20min(注意离心刹车设置为0，该设置旨在离心后的分层更清晰)，管内液体自上而下分为5层：血浆层，细胞分离液层，单核细胞层，中性粒细胞层，红细胞层(底层)。备注：如果分层不清楚，步骤3需要重复。

4、小心去除最上面三层(血浆层，细胞分离液层，单核细胞层)，丢弃。

5、将中性粒细胞层，中性粒细胞层及红细胞层之间的液体收集，转移到新的分离管中。

6、用10ml不含钙镁的HBSS缓冲液进行稀释，缓慢颠倒混匀3-5次，使细胞悬浮。

7、将细胞以350g/min的速度离心10min，细胞团块沉于管底(包括红细胞及中性粒细胞)，用吸管将离心上清去除。

8、加入8ml的红细胞裂解液，轻轻吹打底部细胞，使其悬浮，置于冰上裂解5min。

9、将细胞以250g/min的速度离心5min，弃上清液(如裂解不充分，该步骤可重复一次)。

10、加3ml不含钙镁的HBSS缓冲液使细胞悬浮。细胞转移至5ml的分离管。

11、利用磁珠分选试剂盒进行分离提纯。加入20μl的Cocktail抗体(5μl per5×10

12、将管子插入磁铁架，静置8min，该过程保持盖子打开。

13、将含有细胞的缓冲液倒入另一洁净的分离管(5ml)，转移缓冲液的过程确保试管在磁铁架中，细胞悬液转移后，原先分离管丢弃。

14、向分离管中加入抗体并置旋转混合器中于转子转速12rpm下匀速转动5min，加入磁珠并置旋转混合器中于转子转速12rpm下匀速转动5min，将分离管再次插入磁铁架中，静置5min，之后再转移至另一洁净的分离管，即得人体血液中性粒细胞。

实施例2

本实施例为鉴定实施例1所得人体血液中性粒细胞的纯度。

采用PE anti-human CD66b Antibody(Biolegend，货号：305105)及FITC anti-human CD16 Antibody(Biolegend，货号：302005)。

按照实施例1示例步骤13的方法，将实施例1示例所得含人体血液中性粒细胞的液体倒入另一新的试管(5ml)，计算细胞数量，并通过PE anti-human CD66b Antibody及FITCanti-human CD16 Antibody双标法对细胞进行标记，每管5μl，孵育20min，之后通过流式细胞仪鉴定分离出的中性粒细胞的纯度。结果如图1所示，借助流式细胞术利用PE anti-human CD66b Antibody及FITC anti-human CD16 Antibody双标法对人体血液中性粒细胞进行鉴定，其纯度稳定>99％。

此外，其它由实施例1制得的人体血液中性粒细胞的鉴定结果与以上结果相同或基本相同，且得出的结论与以上结论相同。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。