sRAGE蛋白在制备预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品中的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及sRAGE蛋白在预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤中的用途。

背景技术

急性肺损伤是由于肺内外多种因素如严重创伤、感染、休克、脓毒症等导致的一种急性呼吸衰竭，其严重阶段被定义为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distresssyndrome,ARDS)。脓毒症并发的ARDS常见于重症监护病房，其死亡率高达40％以上，严重威胁患者生命。尽管有研究表明低潮气量通气策略可以通过减少通气相关的肺损伤从而降低ARDS患者的死亡率，但直到目前为止，ARDS患者的治疗和预后仍是临床面临的极大挑战。因此，需要更多的工作探索ARDS的病理机制及相关分子标志物，从而为ARDS的治疗提供新的思路，改善患者预后。

sRAGE是可溶性晚期糖基化终产物受体，国内外近期研究表明，sRAGE在治疗心肌缺血再灌注和肝纤维化等疾病模型中起到保护作用。我们在探索MMP-9对脓毒症小鼠模型的作用机制时意外发现脓毒症肺损伤加重的小鼠其肺泡灌洗液sRAGE水平下降(如图1所示)，这提示sRAGE可作为脓毒症肺损伤过程中预后的分子标志物，并可能对脓毒症肺损伤起到治疗保护作用，查阅相关资料后发现目前尚无sRAGE蛋白在保护脓毒症肺损伤中的报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供sRAGE蛋白在制备预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品中的用途。

优选地，所述用途为在制备预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤中的炎症反应和/或氧化应激反应中的用途。

优选地，所述sRAGE蛋白可以为天然sRAGE蛋白或重组sRAGE蛋白。

优选地，所述sRAGE蛋白包括为人源、鼠源、犬、牛或猪源sRAGE蛋白。

优选地，所述sRAGE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或与其相似性达60％以上且具备sRAGE蛋白功能的相似蛋白。

优选地，所述sRAGE蛋白为单体蛋白，或者为sRAGE单体蛋白与该蛋白自身、载体蛋白、抗体或其他任意长度的氨基酸片段连接形成的融合蛋白，所述融合蛋白可以和sRAGE的配体结合。

优选地，所述sRAGE蛋白还包括基于基础蛋白或相似蛋白中的任一序列进行修饰产生的蛋白修饰物。

优选地，所述预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品为药物、保健品、食品。

本发明第二方面提供一种预防或治疗脓毒症并发急性肺损伤的药物，所述药物包括sRAGE蛋白或其相似蛋白、融合蛋白或蛋白修饰物与医药上可接受的药物载体。

本发明第三方面提供一种预防或治疗脓毒症并发急性肺损伤药物的使用方法，所述方法包括向气管内注射所述药物。

如上所述，本发明的sRAGE蛋白在制备预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品中的用途，具有以下有益效果：

1)sRAGE蛋白的制备技术成熟，可降低产品生产成本；

2)制备的产品给药方法简单方便且起效迅速；

3)为脓毒症并发急性肺损伤的治疗提供新的思路，改善患者预后。

附图说明

图1为显示为脓毒症肺损伤加重的小鼠其肺泡灌洗液sRAGE水平下降图。

其中，&&代表对照siRNA中，与假手术组相比P<0.01

^^代表MMP-9siRNA假手术组与对照siRNA假手术组相比，P<0.01

$$代表MMP-9siRNA CLP组与对照siRNA CLP组相比，P<0.01

图2-1显示为本发明实施例2中各组HE染色结果图。

图2-2显示为本发明实施例2中各组中肺损伤评分。

图3显示为本发明实施例3中的RT-PCR检测IL-6(左图)和MCP-1(右图)的mRNA含量结果图。

图4显示为本发明实施例4中的ELISA检测IL-6(左图)和MCP-1(左图)的蛋白含量结果图。

图5显示为本发明实施例5中的免疫荧光检测肺组织巨噬细胞比例变化结果图，F4/80为成熟小鼠巨噬细胞标志物，胞核为DAPI染色组，组合为DAPI和F4/80共染组。

以上图中：若无特殊说明，

##代表与假手术组相比P<0.01

**代表与CLP组相比P<0.01)

具体实施方式

本发明提供sRAGE蛋白在制备预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品中的用途。

进一步的，所述用途为在制备治疗脓毒症并发急性肺损伤中的炎症反应和/或氧化应激反应中的用途。

其中，所述脓毒症为机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，具体定义和诊断标准参考如下：2016年2月在第45届危重病医学年会上美国重症医学会(SCCM)与欧洲重症医学会(ESICM)联合发布脓毒症的3.0定义及诊断标准。

其中，所述急性肺损伤包括早期阶段的急性肺损伤和重度阶段的急性呼吸窘迫综合征。

其中，sRAGE(soluble receptor of advanced glycation enproducts，sRAGE)蛋白是RAGE胞外区可溶部分，可竞争性结合RAGE的多种配体，抑制促凝、促炎及生物氧化应激反应，进而对机体产生保护作用。

进一步的，所述sRAGE蛋白可以为天然sRAGE蛋白或重组sRAGE蛋白。

进一步的，所述sRAGE蛋白包括来源于人、鼠、犬、牛、猪等的任一sRAGE蛋白序列形成的蛋白。

进一步的，上述不同来源的基础蛋白序列均可以在NCBI中查询。例如，来源于人的sRAGE蛋白序列可以根据Genbank序列号AAH26069.1查询(SEQ ID NO.1)；来源于鼠的sRAGE蛋白序列可以根据Genbank序列号AAB82007.1查询；来源于犬的sRAGE蛋白序列可以根据Genbank序列号ABA18649.1查询；来源于猪的sRAGE蛋白序列可以根据NCBI序列号NP_001116690.1查询；来源于牛的sRAGE蛋白序列可以根据NCBI序列号NP_776407.1查询。

进一步的，所述sRAGE蛋白还包括与所述sRAGE蛋白相似性达60％以上的相似蛋白。

进一步的，所述sRAGE蛋白还包括以任一基础蛋白或相似蛋白的任一蛋白为基础，与该蛋白自身、载体蛋白、抗体或其他任意长度的氨基酸片段连接形成的融合蛋白。

进一步的，所述sRAGE蛋白还包括基于基础蛋白或相似蛋白中的任一序列进行修饰产生的蛋白修饰物。

更进一步的，所述蛋白修饰物的修饰方法包括括糖基化修饰、脂肪酸修饰、酰基化修饰、Fc片段融合、白蛋白融合、聚乙二醇修饰、右旋糖苷修饰、肝素修饰、聚乙烯吡咯烷酮修饰、聚氨基酸修饰、多聚唾液酸修饰、壳聚糖及其衍生物修饰、凝集素修饰、海藻酸钠修饰、卡波姆修饰、聚乙烯吡咯烷酮修饰、羟丙基甲基纤维素修饰、羟丙基纤维素修饰、乙酰化修饰、甲酰化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰或磺酸化修饰以及其他医药上可用的多肽/蛋白药物修饰方法中的一种或几种。

所述sRAGE蛋白的相似蛋白、融合蛋白或蛋白修饰物均具备sRAGE蛋白的功能、均可以和sRAGE的配体结合。

进一步的，所述预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品为药物、保健品、食品。

所述预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品还可以为表达体系或细胞，所述表达体系或细胞为以慢病毒、腺病毒、质粒作为载体构建的表达体系或细胞。

本发明第二方面提供一种预防或治疗脓毒症并发急性肺损伤的药物。

进一步的，所述药物包括sRAGE蛋白或其相似蛋白、融合蛋白或蛋白修饰物与药学上可接受的药物载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

更进一步的，所述药学上可接受的药物载体包含肠溶衣制剂、胶囊、微球/囊、脂质体、微乳液、复乳液、纳米颗粒、磁颗粒、明胶或凝胶中的一种或一种以上。

更进一步的，药学上可接受的辅料应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

所述药物为呼吸道给药药物，优选为气管内注射所述药物。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂、吸入剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

其中，所述药物通过调节体内的sRAGE蛋白从而预防或治疗脓毒症并发急性肺损伤。

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1构建小鼠脓毒症模型及分组

盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)引起的小鼠脓毒症模型是最接近临床脓毒症表现的动物模型，在探索脓毒症并发急性肺损伤的实验中得到广泛的应用。本实施例中利用清洁级ICR实验小鼠，通过CLP构建小鼠脓毒症模型。

本实验所用重组人sRAGE蛋白购于北京爱迪博生物科技有限公司，将其溶解于PBS溶液中，配制成100μg/ml的工作液。实验中所述重组人sRAGE蛋白的用量为200μg/kg，临床使用时其具体给药剂量取决于多种因素如性别、年龄、体重、脓毒症的严重程度，临床应用可在临床医师的指导下，给予合适的剂量。

将实验小鼠随机分为以下3组(每组7只)，24小时后取材检测相关指标。

假手术组：向小鼠气管内滴注50μl PBS，小鼠打开腹腔找到盲肠后放回，不进行结扎穿孔。

CLP组：向小鼠气管内滴注50μl PBS，对小鼠进行盲肠结扎穿孔诱发其脓毒症的发生。

sRAGE组：向小鼠气管内一次性滴注50μl sRAGE(100μg/ml)，对小鼠进行盲肠结扎穿孔诱发其脓毒症的发生。

CLP 24小时后，麻醉小鼠，进行肺组织取材。

实施例2 HE染色

收集实施例1中小鼠的肺组织，左上叶肺叶用4％多聚甲醛固定，后进行石蜡包埋，切片，对切片进行苏木精-伊红染色(HE染色)，在镜下观察肺组织病理学变化，并进行肺损伤评分。肺组织损伤评分：0分：正常肺组织；1分：轻微炎症改变；2分：轻至中度炎症改变(肺泡壁结构无明显破坏)；3分：中度炎性损伤(表现为肺泡壁增厚)；4分：中至重度炎性损伤(炎性区域的正常肺泡结构破坏)；5分：整个区域破坏，表现为严重炎性损伤。

HE结果如图2-1和2-2所示，气管注射sRAGE重组蛋白的小鼠，可以有效减轻脓毒症引起的肺弥漫性间质水肿，肺泡壁增厚，肺泡间隙变窄，炎性细胞浸润增加等改变。注射sRAGE重组蛋白的脓毒症小鼠同只注射PBS的脓毒症小鼠相比肺损伤评分下降。

实施例3 RT-PCR检测肺组织炎症相关指标mRNA含量变化

1.mRNA提取

取20mg实施例1各组中的肺组织，加入1ml Trizol，在50Hz的频率下研磨，每次30s，研磨3-4次。向匀浆中加入333μl三氯甲烷，充分震荡混匀。12000rpm，4℃，离心20min。吸取400μl左右的上清，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，置于-20℃冰箱过夜。

将样本在12000rpm，4℃的条件下离心20min，Ep管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上层溶液，用DEPC水配制的75％酒精溶液作为洗涤液在12000rpm、5min的条件下洗涤RNA，共三次。最后一次不加洗涤液离心1min，用20微升的移液枪小心吸走多余的酒精溶液。

将Ep管管盖打开，让多余的酒精残液挥发，待RNA变透明时加入20μl无菌DEPC水充分吹打溶解RNA。

测浓度：每个样本取2μl于酶标仪微黑子中，采用紫外分光光度法测定RNA浓度，OD260/OD280均在1.8-2.2，纯度良好。

2.逆转录

按逆转录试剂盒(Thermo)说明书配制反应体系，如表1所示

表1逆转录反应体系

上机，反应条件为：25℃10min，42℃1h，72℃10min，4℃维持

最终cDNA浓度为200ng/μl，用ddH

3.Real-time PCR

按照表2配制反应体系，

表2 Real-time PCR反应体系

其中，3’primer和5’primer分别如下：

IL-6(Forward)5’-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3’

IL-6(Reverse)5’-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3’

MCP-1(Forward)5’-CCCACTCACCTGCTGCTACT-3’

MCP-1(Reverse)5’-TCTGGACCCATTCCTTCTTG-3’

β-actin(Forward)5-CTGTATGCCTCTGGTCGTAC-3’

β-actin(Reverse)5’-TGATGTCACGCACGATTTCC-3’

数据处理：用每个样本目的基因的Ct值减去同组中β-actin的Ct值(ΔCt)，再用对照组的ΔCt减去各处理组的ΔCt得到ΔΔCt值，在Excle中代入公式POWER(2，ΔΔCt)，计算所得即为实验组相对于对照组PCR产物的含量多少，以此来反映目的基因mRNA的表达量的变化。

RT-PCR结果如图3所示，发现CLP所致脓毒症可引起小鼠肺组织炎症相关指标IL-6和MCP-1的mRNA含量显著上升，而注射sRAGE重组蛋白的小鼠IL-6和MCP-1的mRNA含量显著下降。

实施例4 ELISA检测肺组织炎症相关指标蛋白含量变化

本实验采用双抗体夹心法ABC-ELISA法检测小鼠肺组织匀浆中IL-6及MCP-1的含量，采用的试剂盒品牌为westang，检测IL-6含量的货号为F10830，检测MCP-1含量的货号为F11130。

1.试剂与样本准备：

10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释成1×、组织匀浆、配制标准品液(200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、0ng/ml)、洗涤液(双蒸水1:20稀释)；本实验中肺组织匀浆5倍稀释。

2.检测步骤：

(a)加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置于37 40℃分钟；

(b)洗板：用洗涤液充分洗涤反应板4-6次，朝滤纸上印干；

(c)每孔加入双蒸水和第一抗体工作液(生物素化的抗体)各50μl(空白除外)；

将反应板充分混匀后置于37℃20分钟；

(d)洗板：用洗涤液充分洗涤反应板4-6次，朝滤纸上印干；

(e)每孔加酶标抗体工作液100μl，充分混匀后将反应板置于37℃10分钟；

(f)洗板：用洗涤液充分洗涤反应板4-6次，朝滤纸上印干；

(g)每孔加入底物工作液100μl，置于37℃避光反应15分钟；

(h)每孔加入100μl硫酸终止液充分混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处检测吸光度。

3.结果计算与判断：所有样品和标准品的OD值减除空白值，以标准品浓度200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据标准曲线代入样品OD值计算出相应的IL-6或MCP-1浓度

ELISA结果如图3所示，发现CLP所致脓毒症可引起小鼠肺组织炎症相关指标IL-6和MCP-1的蛋白含量显著上升，而注射sRAGE重组蛋白的小鼠IL-6和MCP-1的蛋白含量显著下降。

实施例5免疫荧光检测肺组织巨噬细胞比例变化

取实施例1中小鼠肺组织按照如下步骤进行免疫荧光染色：

1.石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBS漂洗5min,共3次。

2.封闭：滴加10％山羊血清，37℃湿盒封闭45min。

3.一抗：吸去多余液体，加入荧光标记的F4/80抗体，放入湿盒，37℃孵育1h后置于4℃冰箱过夜。(保持在湿盒中)

4.0.01M PBS冲洗5min，共三次

5.二抗：在暗室条件下(以下步骤均在暗室操作)，加入山羊抗兔IgG-FITC(1:200),37℃孵育45min

6.弃二抗，加入DAPI染液(2.5μg/ml)，室温孵育20min

7.0.01M PBS冲洗5min，共6次。

8.加入防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下拍摄，保存图片。

免疫荧光结果如图5所示，CLP可以引起小鼠肺组织巨噬细胞(F4/80为成熟小鼠巨噬细胞标志物)的浸润显著增加，而气管注射sRAGE重组蛋白后，其巨噬细胞阳性百分比显著下降。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 张慧

<120> sRAGE蛋白在制备预防、治疗脓毒症并发急性肺损伤产品中的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Leu Trp Ser Ala Gly Cys Val Phe Tyr Glu Ile Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gln Pro Leu Phe Pro Gly Val Asn Glu Leu Asp Gln Ile Ser Lys Ile

20 25 30

His Asp Val Ile Gly Thr Pro Ala Gln Lys Ile Leu Thr Lys Phe Lys

35 40 45

Gln Ser Arg Ala Met Asn Phe Asp Phe Pro Phe Lys Lys Gly Ser Gly

50 55 60

Ile Pro Leu Leu Thr Thr Asn Leu Ser Pro Gln Cys Leu Ser Leu Leu

65 70 75 80

His Ala Met Val Ala Tyr Asp Pro Asp Glu Arg Ile Ala Ala His Gln

85 90 95

Ala Leu Gln His Pro Tyr Phe Gln Glu Gln Arg Lys Thr Glu Lys Arg

100 105 110

Ala Leu Gly Ser His Arg Lys Ala Gly Phe Pro Glu His Pro Val Ala

115 120 125

Pro Glu Pro Leu Ser Asn Ser Cys Gln Ile Ser Lys Glu Gly Arg Lys

130 135 140

Gln Lys Gln Ser Leu Lys Gln Glu Glu Asp Arg Pro Lys Arg Arg Gly

145 150 155 160

Pro Ala Tyr Val Met Glu Leu Pro Lys Leu Lys Leu Ser Gly Val Val

165 170 175

Arg Leu Ser Ser Tyr Ser Ser Pro Thr Leu Gln Ser Val Leu Gly Ser

180 185 190

Gly Thr Asn Gly Arg Val Pro Val Leu Arg Pro Leu Lys Cys Ile Pro

195 200 205

Ala Ser Lys Lys Thr Asp Pro Gln Lys Asp Leu Lys Pro Ala Pro Gln

210 215 220

Gln Cys Arg Leu Pro Thr Ile Val Arg Lys Gly Gly Arg

225 230 235