一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合及其应用

技术领域

本发明属于真菌的分子生物学检测领域，具体涉及一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合及其应用。

背景技术

棘白菌素类药物作为抗真菌药物，包括卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净等，对念珠菌表现出良好的杀菌活性，与其他种类的抗真菌药物相比，该类药物的毒副作用较小，更基于该类药物良好的抗菌活性，使其成为临床常规真菌用药治疗失败时的一个很好的选择。然而，随着应用时间的延长和应用范围的扩大，也出现不同的耐药机制导致抗念珠菌活性降低。

白念珠菌(Candida albicans)又称白假丝酵母菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。

对棘白菌素类药物产生耐药性的白念珠菌的基因突变主要发生在是编码β-1,3-D-葡聚糖合成酶的基因FKS1(又称GSC1基因)的两个热点区(hot spot regions)氨基酸残基641至649(hot spot regions 1，HS1)之间和残基1345至1365(hot spot regions 2，HS2)之间，导致对该类药物的亲和力降低从而产生耐药性。其中，临床中最常见的突变位点是FKS1 F641S和FKS1 S645F，并导致最显著的耐药表型。

目前，白念珠菌耐药基因的检测方法多为基于培养的真菌药敏试验法，但是，菌培养法分离周期长，过程繁琐，易污染，不利于早期的快速诊断。因此，研发一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药基因的试剂盒及检测方法是本领域亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测白念株菌棘白菌素类耐药相关基因FKS1的3个突变靶点的引物探针，并根据所述引物探针构建检测方法和PCR试剂盒。与现有技术相比，本发明提供的方法无需经过培养步骤，直接利用采集到的样本作为检材，一次检测确定是否为耐药突变，同时锁定耐药突变靶点，快速准确，对临床的治疗等方面提供有力的支持。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合，所述引物探针组合包括第一引物对、第二引物对、第一检测探针、第二检测探针和第三检测探针；

其中，所述第一检测探针包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，应用检测突变位点F641S；所述第二检测探针包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，应用检测突变位点S645P；所述第三检测探针包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，应用检测突变位点R1361H。

本发明提供的引物探针组合用于检测白念株菌棘白菌素类耐药相关基因FKS1的3个突变靶点，所述引物探针组合设计合理，能够准确、无遗漏的扩增靶标区域，且相互之间不影响；所述引物探针组合中，特殊设计的Taqman探针可以用于溶解曲线的分析鉴定，进而根据溶解曲线的变化判断靶标区域是否发生突变，得到待测目标物的突变情况。依据所述引物探针组合构建的方法不需要经过培养，直接以采集到的样本为检材，就可以得到待测样本中的白念珠菌是否为棘白菌素类耐药突变，同时锁定耐药突变靶点。

同样的，作为对本发明的进一步改进，可通过进一步增加靶点的数目，提高耐药检测的覆盖率。但是在引物探针的设计方面，要保证引物探针之间不会相互影响，保证结果的准确性。

需要注意的是，本发明中所述“样本”或“检材”是指需要进行白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点检测的物质，其可以来自于个体(如人或动物)，也可以是其它来源的，例如一些经处理或未经处理的实验室材料，或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“检材”的检测并非仅涉及诊断或治疗目的，还可涉及其它非诊断或治疗目的。

作为本发明优选的技术方案，所述第一引物对用于扩增突变位点F641S和突变位点S645P，其上游引物包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，下游引物包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

优选地，所述第二引物对用于扩增突变位点R1361H，其上游引物包括如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列，下游引物包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。所述各条核苷酸序列如下表1所示：

表1核苷酸序列

作为本发明优选的技术方案，所述检测探针为Taqman探针，携带荧光基团和淬灭基团。

优选地，所述荧光基团包括ALEX-350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供一种基于探针溶解曲线法的检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的方法，所述方法包括：

(1)合成如第一方面所述的引物探针组合；

(2)使用所述引物探针组合对待测样品进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)在所述实时荧光定量PCR扩增反应后进行溶解曲线分析，根据所述检测探针的熔点判断所述待测样品中白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的突变情况。

本发明提供一种基于探针溶解曲线分析的白念株菌棘白菌素类耐药多重PCR检测方法，其中，引物探针组合可以对特异性靶点进行单重、多重单色和多重多色的实时荧光定量PCR扩增反应；再通过特殊设计的Taqman探针溶解曲线分析鉴定，实现对于3个常见的白念株菌棘白菌素类耐药靶点的多重检测。

作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述实时荧光定量PCR扩增反应为不对称实时荧光定量PCR扩增反应。

优选地，所述引物探针组合中各条上游引物的浓度相同或不同，所述上游引物的浓度为50～500nM，例如可以是50nM、80nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM等。

优选地，所述引物探针组合中各条下游引物的浓度相同或不同，所述下游引物的浓度为0.5～25μM，例如可以是0.5μM、0.8μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM或25μM等。

本发明中采用多重不对称PCR同时扩增白念株菌棘白菌素类耐药突变基因FKS1的不同靶基因序列，引物探针组合中，上下引物的浓度差是扩增的关键，浓度差太高或者太低都不利于扩增的进行。

优选地，所述引物探针组合中各引物对的上游引物与下游引物的浓度比为1:(10～50)，例如可以是1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50等。

优选地，所述物探针组合中各条探针的浓度相同或不同，所述各条探针的浓度为50～500nM，例如可以是50nM、80nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM等。

作为对本发明的进一步改进，可通过进一步增加上下游引物的比例，提高与探针互补的目的片段的产量，放大溶解曲线的信号。

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件包括：

第一阶段，95℃加热10min；第二阶段，95℃下10s，55℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；第三阶段，温度由35℃升温至95℃，连续采集荧光信号，5次/℃；

优选地，步骤(3)所述溶解曲线分析的结果如下：

F641S靶点，野生型的溶解温度范围为66.0℃～67.0℃，突变型的溶解温度范围为64.0℃～65.0℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为1℃～3℃；

S645P靶点，野生型的溶解温度范围为64.0℃～65.0℃，突变型的溶解温度范围为62.5℃～63.5℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为0.5℃～2.5℃；

R1361H靶点，野生型的溶解温度范围为62.0℃～63.0℃，突变型的溶解温度范围为56.0℃～57.0℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为5℃～7℃。

第三方面，本发明还提供一种基于探针溶解曲线法的检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

优选地，所述阴性对照品包括：含有检测靶序列的野生型白念株菌DNA片段的质粒。

优选地，所述阳性质控品包括：含有F641S和S645P基因突变DNA序列的质粒和含有R1361H基因突变DNA序列的质粒。

优选地，所述含有F641S和S645P基因突变DNA序列的质粒和含有R1361H基因突变DNA序列的质粒的摩尔比为1:(0.5～1.5)，例如可以是1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5等，优选为1:1。

优选地，所述试剂盒还包括质控品和PCR反应液。

优选地，所述质控品包括引物对和探针，所述引物对包括如SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列，所述探针包括如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

优选地，所述PCR反应液包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl

优选地，所述Taq聚合酶的终浓度为0.5～5U，例如可以是0.5U、0.8U、1U、1.2U、1.5U、1.8U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U或5U。

优选地，所述dNTP的终浓度为0.1～5mM，例如可以是0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.5mM、2.8mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、4.8mM或5mM。

优选地，所述MgCl

优选地，所述DMSO的质量百分比为1～15％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl。

优选地，所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15～20mM，例如可以是15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。

优选地，所述KCl在缓冲液中的浓度为100～200mM，例如可以是100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。

本发明中，反应体系中模板的终浓度可以为0.1pg～10ng，例如可以是0.1pg、0.5pg、1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、10pg、20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、2ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng或10ng，优选为0.5ng～2ng。

本发明中，所述PCR反应体系可以如下表2所示，再对所述PCR反应体系进行单重、多重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应。

表2 PCR反应体系

其中，N表示引物数量或探针数量。

第四方面，本发明还提供一种如第一方面所述的引物探针组合、如第二方面所述的方法或如第三方面所述的试剂盒在白念珠菌耐药突变靶点检测或白念珠菌分型中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的引物探针组合及检测试剂盒，用于检测白念株菌棘白菌素类耐药相关基因FKS1的3个突变靶点，所述引物探针组合设计合理，能够准确、无遗漏的扩增靶标区域，且相互之间不影响；其中，Taqman探针属于水解探针，在PCR扩增过程中被消耗，在本发明中，通过在反应体系中加入过量的Taqman探针，利用扩增结束后剩余的探针与扩增产物进行溶解曲线分析，能够同时分析和检测多种白念株菌耐药突变靶点，根据Taqman探针熔点的变化可在同一反应体系中区分多种白念株菌耐药突变的特异靶序列；同时，溶解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析，对于样本量较少的待测物，该方法有效避免了细胞培养的步骤，提高检测效率；

(2)本发明提供的检测方法，其利用分子生物学方法，首先通过PCR技术对特异性的病原体核酸片段进行扩增，利用特异性的带有荧光信号的探针对检测片段进行检测，通过检测溶解曲线的Tm值判断检测样本中的病原体是否发生基因突变；同时，溶解曲线分析可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析；因此，该方法步骤简单、准确度高并且检测效率高，在白念株菌棘白菌素类耐药突变的临床分析、鉴定和分型等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为F641S靶点野生型和突变型对应的溶解曲线图。

图2为S645P靶点野生型和突变型对应的溶解曲线图。

图3为R1361H靶点野生型和突变型对应的溶解曲线图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

本实施例提供用于检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合，所述引物探针组合包括第一引物对、第二引物对、第一检测探针、第二检测探针和第三检测探针。

本实施例在导致白念株菌棘白菌素类耐药的常见基因突变中，选择两个热点突变区的3个突变热点作为检测靶点，分别是HS1区的F641S(其对应的核苷酸突变位点为T1922C)、S645P(其对应的核苷酸突变位点为T1933C)；HS2区的R1361H(其对应的核苷酸突变位点为G4082A)。

针对3个靶点设计并制备3条Taqman探针，同时根据探针序列在外围分别设计一对引物序列，包括一条上游引物和一条下游引物；且F641S、S645P靶点的两条探针共用一对引物序列。

其中，所述第一检测探针(SEQ ID NO.1)用于检测突变位点F641S：

5'-CCAAATTGGTTGAATCTTATTTCTTCT-3'；

所述第二检测探针(SEQ ID NO.2)用于检测突变位点S645P：

S645P靶点探针为5'-TGTCTTTAAGAGATCCTATTAGAAAC-3'；

所述第三检测探针(SEQ ID NO.3)用于检测突变位点R1361H；

R1361H靶点探针为5'-TGATTGGATTAGACGTTATACTTTGTCT-3'。

所述第一引物对用于扩增突变位点F641S和突变位点S645P，其上游引物(SEQ IDNO.4)为5'-gtggatgtcttatttgtta-3'；

下游引物(SEQ ID NO.5)为5'-cttggtttctacaaacaa-3'；

所述第二引物对用于扩增突变位点R1361H，其上游引物(SEQ ID NO.6)为5'-ggtgttggctaacttgaa-3'；

下游引物(SEQ ID NO.7)为5'-caaccaatggaatgaaagaaa-3'。

实施例2

本实施例使用实施例1中提供的引物探针组合构建不对称荧光定量PCR扩增体系。所述不对称荧光定量PCR扩增体系如表3所示：

表3不对称荧光定量PCR扩增体系

此外，所述扩增体系中还加入内部质控品，包括内部控制的上游引物、下游引物和对应的探针，浓度分别为200nM、2μM和100nM，具体序列如下：

内部控制上游引物(SEQ ID NO.8)为5'-CTGTGAATGCCATTTCTC-3'；

内部控制下游引物(SEQ ID NO.9)为5'-ACACCTCCTTTGGAATAG-3'；

内部控制探针(SEQ ID NO.10)为5'-CCTAACCTACCCGCCTTGGATATT-3'；

使用上述反应体系检测待测样本时，模板即为待测样本；

使用上述反应体系检测阳性对照品和阴性对照品时，将模板替换为相应对照品即可。

所述阳性对照品包括含有F641S、S645P基因突变DNA序列的质粒PUC57-F641S/S645P和含有R1361H基因突变DNA序列的质粒PUC57-R1361H。

所述含有F641S、S645P基因突变基因片段的序列(SEQ ID NO.11)如下所示：

TCGAAATCGGCATATGCTGTGTCGATTGTTGGATTTTTCATTGCTGTGGCCACTTTAGTATTCTTTGCCGTCATGCCATTGGGTGGTTTATTCACTTCATACATGAACAAGAGATCAAGAAGATATATTGCATCACAAACATTTACTGCCAACTACATTAAATTGAAAGGTTTAGATATGTGGATGTCTTATTTGTTATGGTTTTTGGTTTTCCTTGCCAAATTGGTTGAATCTTATTTCTCCTTGACTTTGCCTTTAAGAGATCCTATTAGAAACTTGTCGACCATGACAATGAGATGTGTTGGTGAAGTTTGGTACAAAGATATTGTTTGTAGAAACCAAGCCAAGATTGTCTTGGGGTTGATGTATCTTGTTGATTTGTTATTGTTCTTTTTGGATACTTATATGTGGTACATTATTTGTAACTGTATCTTCTCCATTGGTCGTTCATTCTATTTGGGTATTTCCATTTTGACTCCT

所述含有R1361H基因突变基因片段的序列(SEQ ID NO.12)如下所示：

TATTTGGGTACTCAACTTCCATTGGATAGATTTTTGTCATTTTACTATGGTCATCCAGGTTTCCATATTAATAACTTGTTTATTCAATTGTCTTTACAAGTGTTTATTTTGGTGTTGGCTAACTTGAATTCATTAGCTCATGAAGCTATCATGTGTTCTTACAACAAAGATGTCCCAGTTACTGATGTTTTGTATCCATTTGGTTGTTACAATATTGCTCCTGCCGTTGATTGGATTAGACATTATACTTTGTCTATTTTCATTGTTTTCTTCATTTCTTTCATTCCATTGGTTGTACAAGAATTGATTGAAAGAGGGGTATGGAAAGCGTTCCAAAGATTTGTTAGACATTTTATTTCCATGTCACCATTTTTCGAAGTTTTCGTTGCCCAAATTTATTCATCATCGGTTTTCACTGATTTGACCGTTGGTGGTGCTAGATATATTTCCACTGGTAGAGGTTTTGCCACTTCAAGAATT。

所述阴性对照品为含有检测靶基因FKS1(GenBank：GQ456066.1)序列的野生型白念株菌ATCC 90028DNA片段的质粒PUC57-FKS1。

通过上述不对称荧光定量PCR扩增体系，能够扩增和检测待测样品中白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点；扩增后结合溶解曲线分析，根据Taqman探针熔点的变化来判断待检测样品中是否存在基因突变。

实施例3

本实施例通过实施例2中构建的不对称荧光定量PCR扩增体系进行扩增，检测待测样品的溶解曲线。

具体反应过程如下：

第一阶段：95℃预变性10min；1个循环；

第二阶段：95℃变性10s；55℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；

第三阶段：95℃1min，35℃2min；温度由35℃升温至95℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。

F641S靶点野生型和突变型对应的溶解温度如图1所示，S645P靶点野生型和突变型对应的溶解温度如图2所示，图3为R1361H靶点野生型和突变型对应的溶解温度如图3所示。

利用上述方法检测带有不同耐药基因突变的样本，检测得到的Tm值如下表4所示。

表4不同白念株菌棘白菌素类耐药突变靶点与其Tm值对照表

综上所示，本发明提供了一种利用分子生物学在检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的方法。首先，提取检测样本中的病原体核酸，通过PCR技术对特异性的病原体核酸片段进行扩增，利用特异性的带有荧光信号的探针对检测片段进行检测，通过检测溶解曲线的Tm值判断检测样本中的病原体是否发生基因突变；该检测方法应用范围广泛，在临床分析、鉴定和分型等领域具有广泛的应用前景。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 丹娜（天津）生物科技股份有限公司

<120> 一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合及其应用

<130> 20210617

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccaaattggt tgaatcttat ttcttct 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgtctttaag agatcctatt agaaac 26

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgattggatt agacgttata ctttgtct 28

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtggatgtct tatttgtta 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cttggtttct acaaacaa 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggtgttggct aacttgaa 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

caaccaatgg aatgaaagaa a 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctgtgaatgc catttctc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acacctcctt tggaatag 18

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cctaacctac ccgccttgga tatt 24

<210> 11

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tcgaaatcgg catatgctgt gtcgattgtt ggatttttca ttgctgtggc cactttagta 60

ttctttgccg tcatgccatt gggtggttta ttcacttcat acatgaacaa gagatcaaga 120

agatatattg catcacaaac atttactgcc aactacatta aattgaaagg tttagatatg 180

tggatgtctt atttgttatg gtttttggtt ttccttgcca aattggttga atcttatttc 240

tccttgactt tgcctttaag agatcctatt agaaacttgt cgaccatgac aatgagatgt 300

gttggtgaag tttggtacaa agatattgtt tgtagaaacc aagccaagat tgtcttgggg 360

ttgatgtatc ttgttgattt gttattgttc tttttggata cttatatgtg gtacattatt 420

tgtaactgta tcttctccat tggtcgttca ttctatttgg gtatttccat tttgactcct 480

<210> 12

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tatttgggta ctcaacttcc attggataga tttttgtcat tttactatgg tcatccaggt 60

ttccatatta ataacttgtt tattcaattg tctttacaag tgtttatttt ggtgttggct 120

aacttgaatt cattagctca tgaagctatc atgtgttctt acaacaaaga tgtcccagtt 180

actgatgttt tgtatccatt tggttgttac aatattgctc ctgccgttga ttggattaga 240

cattatactt tgtctatttt cattgttttc ttcatttctt tcattccatt ggttgtacaa 300

gaattgattg aaagaggggt atggaaagcg ttccaaagat ttgttagaca ttttatttcc 360

atgtcaccat ttttcgaagt tttcgttgcc caaatttatt catcatcggt tttcactgat 420

ttgaccgttg gtggtgctag atatatttcc actggtagag gttttgccac ttcaagaatt 480