一种高产叶酸的乳酸菌、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及乳酸菌技术领域，具体为一种高产叶酸的乳酸菌、其制备方法及其应用。

背景技术

叶酸是B族维生素的一种，可以改善记忆力，延缓大脑认知能力退化，具有预防老年痴呆的功能；可以软化血管，预防高血压与动脉硬化；预防胎儿神经管缺陷的发生及心脏缺陷、上唇裂缺陷的发生。人体无法自主合成叶酸，主要通过食物获得天然的叶酸，叶酸摄入不足或吸收不良会引起贫血等症状。而市售的叶酸片主要为化学合成，安全性不高，不具有还原性，长期服用会引起一些不良的反应。天然B组维生素，如叶酸、生物素、硫胺素、烟酸、维生素B6、核黄素、维生素B12等对人体无副作用。一些微生物能够合成高活性的四氢叶酸直接为人体利用，具有良好的食品工业应用前景。因此筛选出能高产叶酸的益生菌菌株具有很高的社会价值。

由于人体内的叶酸主要是靠食物摄取，因此，当人体叶酸摄入不足或者叶酸利用率降低时，便会出现叶酸缺乏的状况。天然的叶酸主要来源于绿色食物的叶酸，动物肝脏、大豆及小麦，但是通过这些天然原材料提取叶酸成本高，且不利于工业化的生产。一些微生物具有合成B组维生素的能力，包括叶酸、生物素、硫胺素、烟酸、维生素B6、核黄素、维生素B12等，通过微生物获得的叶酸对人体无副作用，因此筛选出能高产叶酸并能很好定植在体内的益生菌菌株具有很高的社会价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高产叶酸的乳酸菌、其制备方法及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种高产叶酸的乳酸菌，所述乳酸菌为长双歧杆菌BL21，其保藏号为 CGMCCNo.10452。

为制得高产叶酸的乳酸菌，本发明还提供了制备方法，包括以下步骤：

S1.筛选：从自然界和婴幼儿的唾液及粪便中获取待筛选样品，将待筛选样品放入装有的生理盐水的瓶中，震荡混匀，所得产物记为菌液，所述生理盐水的质量为待筛选样品质量的15-20倍；

S2.稀释：将步骤1得到的菌液倒入装有生理盐水的试管进行10倍梯度逐步稀释，所得产物记为稀释菌液；

S3.涂布：将100μL步骤2得到的稀释菌液用涂布棒涂布于琼脂固体平板上，倒置放入培养箱中厌氧培养36-60h；

S4.纯化：培养结束后，挑取琼脂固体平板上单菌落个数大于50的琼脂固体平板，对在琼脂固体平板上的单菌落多次划线纯化，直至整个平板上菌落镜检形态一致。

进一步地，步骤3中所述的琼脂固体平板由以下步骤制得：将葡萄糖20g、蛋白陈l0g、牛肉浸膏10g、酵母膏5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、吐温80 1g、硫酸镁0.59g、一水硫酸锰0.19g、L-半胱氨酸1g、蒸馏水1000mL和15g琼脂混合均匀，并用氢氧化钠调pH 6.8，于121℃灭菌15min。

进一步地，步骤3中所述的琼脂液体培养基由以下步骤制得：将葡萄糖 20g、蛋白陈l0g、牛肉浸膏10g、酵母膏5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、吐温80 1g、硫酸镁0.59g、一水硫酸锰0.19g、L-半胱氨酸1g、蒸馏水1000mL和15g琼脂混合均匀，氢氧化钠调pH 6.8，121℃灭菌15min。

进一步地，在步骤4纯化完成后，挑取步骤4得到的单菌落至琼脂液体培养基中扩培，并将菌株在含有30％甘油的琼脂液体培养基中保种，置于-80℃的冰箱中冷冻保存。

本发明还公开了高产乳酸菌的在叶酸生产中的应用，采用所述乳酸菌合成叶酸。

有益效果：

1.本发明提供的高产叶酸的乳酸菌通过微生物产物获得的叶酸对人体无副作用，因此筛选出能高产叶酸并能很好定植在体内的益生菌菌株具有很高的社会价值，且所得的叶酸产率也高于现在菌株。

2.本发明公开的高产叶酸的乳酸菌也具备耐酸耐胆盐的能力。

附图说明

图1本发明高产叶酸的乳酸菌的菌株平板培养16h后镜检图片；

图2本发明高产叶酸的乳酸菌菌株的碱基序列；

图3高产叶酸的乳酸菌菌株的耐酸性实验；

图4本发明高产叶酸的乳酸菌菌株的耐耐胆盐实验；

图5本发明高产叶酸的乳酸菌菌株的生长曲线。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

MRS液体培养基的配制方法：葡萄糖20g，蛋白陈l0g，牛肉浸膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，吐温80 1g，硫酸镁0.59g，一水硫酸锰0.19g，L-半胱氨酸1g，蒸馏水1000mL，氢氧化钠调pH 6.8，121℃灭菌15min。

MRS固体培养基的配制方法：葡萄糖20g，蛋白陈l0g，牛肉浸膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，吐温80 1g，硫酸镁0.59g，一水硫酸锰0.19g，L-半胱氨酸1g，蒸馏水1000mL，15g 琼脂，氢氧化钠调pH 6.8，121℃灭菌15min。

发酵输液瓶培养基的配制方法：葡萄糖25g，蛋白陈l0g，牛肉浸膏2 g，酵母膏15g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，吐温80 1g，硫酸镁0.59g，一水硫酸锰0.19g，L-半胱氨酸1g，蒸馏水1000mL，氢氧化钠调pH 6.8，121℃灭菌15min。

实施例1.菌种的分离纯化及保藏

从自然界和婴幼儿的唾液及粪便中筛选乳酸菌。取2g待分离的样品放入装有38mL生理盐水的蓝盖瓶中，震荡混匀，用装有生理盐水的试管进行10 倍梯度逐步稀释，用移液枪吸取稀释的菌液100μL用涂布棒涂布于MRS固体平板上，倒置放入培养箱中厌氧培养48h。培养结束后，挑取平板上单菌落个数大于50的平板，用接种环挑取单菌落在琼脂固体平板上多次划线纯化，直至整个平板上菌落镜检形态一致。挑取单菌落至MRS液体培养基中扩培，并将菌株在含有30％甘油的MRS液体培养基中保种，置于-80℃的冰箱中冷冻保存。经过该方法筛选出一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，编号BL21。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.10452。

实验例1.产叶酸菌种的初步筛选

在去叶酸培养基FACM(Folic Acid Casei Medium，购于Difco公司)中加入溴甲酚紫作为指示剂，调节pH至6.8，用移液枪吸取活化好的菌株液体滴1-2滴接种，置于37℃培养2d。该培养基溶液变黄，指示为阳性，表示该菌株能够合成叶酸。

实验例2.菌株的鉴定

3.1菌落形态

参照图1，菌株在MRS固体培养基中培养16h后，平板上菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳白色、质地柔软。挑选单菌落镜检观察菌株形态，镜检如图1所示。

3.2 16S rRNA的鉴定

参照图2，目标菌株的基因组DNA用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行提取，用提取的乳酸菌菌株基因组DNA作为模板进行扩增，然后进行 PCR实验，PCR的引物为细菌的通用引物27F和1492R。PCR扩增反应结束后，取产物稀释至适当的梯度后进行琼脂凝胶拍照检测。将扩增的产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行检测。碱基序列附图2所示。检测结果与NCBI 网站上进行BLAST进行序列比对，结果显示与长双歧杆菌16S rDNA序列同源性超过99％。根据菌株的形态观察及序列比对相结合，确定筛选的乳酸菌菌株为长双歧杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为保藏号为CGMCC No.10452。

实验例3.叶酸含量的测定

1)菌液制备：挑取平板上的菌种活化后，接入MRS液体培养基中24h，培养好后，再以2％接种量接入发酵输液瓶培养基中，培养温度为32℃，培养时间是16h。

2)待测样品的制备：将培养好的菌株发酵液用高速离心机离心(10000 rpm，10min)，取离心后的上清液，上清用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱检测上清中的叶酸含量，减去MRS培养基中的叶酸含量值。结果显示叶酸含量为4.1μg/mL。

实验例4.生长曲线测定

参照图5，MRS液体培养基接种2％的乳酸菌种子液后，每隔2h取发酵液用分光光度计测定发酵液OD600值。根据测定的数据绘制菌株的生长曲线：菌株2h左右进入对数生长期，在15h左右结束对数生长期，转入稳定期。

实验例5.菌株耐酸实验

参照图3，活化后的BL21菌种和对照实验组菌种分别按3％(v/v)接种量接种到pH值为2.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的MRS液体培养基中，37℃恒温培养，分别在培养2h后，采用涂布平板计数法测定培养基中活菌数，以 pH值为7.0的MRS培养基为空白，试验重复2次，分别计算其有效活力。BL21 在pH3.0条件下作用2h，存活率达到72％。

实验例6.菌株胆盐实验

参照图4，将活化后的BL21菌种和对照实验组菌种分别按3％(v/v)接种量接种到含有3mg/mL和6mg/mL胆盐的MRS培养基中，37℃恒温培养，分别在培养2h后，采用涂布平板计数法测定培养基中活菌数，以不加胆盐的MRS 培养基为空白，试验重复2次，分别计算其有效活力。BL21在胆盐浓度0.3％条件下作用2h，存活率为78％。

上述发明保藏单位地址为中国北京,保藏日期2015年01月27日。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。