E3泛素连接酶(UBE3A)蛋白质靶标
文献发布时间:2023-06-19 12:21:13
技术领域
本发明提供了新型生物标志物及其在药物开发中的用途,当泛素-蛋白连接酶E3A(UBE3A)蛋白质水平增加或降低时,所述新型生物标志物的蛋白质表达水平被调节。
背景技术
天使综合征(Angelman syndrome)的特征是严重的智力和发育障碍、睡眠障碍、癫痫发作、不自主运动(jerky movements)、脑电图异常、频繁发笑或微笑以及严重的语言障碍。天使综合征是由UBE3A基因缺失或失活且母系遗传染色体15q11.2上的蛋白质因此而缺失或失活所引起的神经系统遗传性疾病。相反,Dup15q综合征是一种临床可识别的综合征,由染色体15q11-13.1的重复引起的。在Dup15q综合征中,UBE3A过表达。在天使综合征(AS)中,E3泛素连接酶UBE3A的神经元缺失导致多种严重神经功能障碍。
尽管UBE3A的神经元缺失会引起AS,但对下游分子和细胞功能障碍却缺乏了解。相关UBE3A底物的鉴定将有助于更好地了解Ube3a功能在健康和疾病方面的作用,并且支持药物和生物标志物的研发以监测UBE3A功能。
发明内容
本发明涉及新型生物标志物,当泛素-蛋白连接酶E3A(UBE3A)蛋白质水平增加或降低时,所述新型生物标志物的蛋白质表达被调节,而且一些生物标志物与UBE3A形成蛋白质复合物。这些生物标志物包括蛋白质CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、TCAF1和PPID。FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10是LTR反转录转座子衍生基因,含有GAG衣壳结构域,并且PEG10存在于外泌体中。本发明进一步涉及药物生物标志物和基于这些蛋白质检测UBE3A活性的方法,从而用于药物治疗靶向UBE3A的疾病,包括天使综合征、15qdup综合征和其他自闭症谱系障碍。
附图说明
图1:鉴定包括蛋白质CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、TCAF1和PPID的新型Ube3a靶标。
图1A:从对照系(对照系1)和AS系(患者1和患者3)开始的神经元分化的实验设计示意图,其中在神经元分化过程中,对对照系进行UBE3A正义靶向LNA(正义)治疗并且对AS系进行UBE3A ATS靶向LNA治疗2周或6周。
图1B:用于TMT-MS3实验的细胞裂解物上UBE3A的Western印迹(顶部)。LNA治疗2周和6周后从Proteome Discoverer获得的UBE3A比例丰度图显示接受LNA治疗时UBE3A的敲低和恢复。
图1C:相对于对照系和AS系(AS del,AS pt)中的UBE3A水平而反向调节的蛋白质的比例丰度的热图。
图2:通过SRM确认PEG 10和TCAF1为UBE3A靶标
UBE3A、PEG10 RF1/2特异性肽、PEG10-RF1肽和TCAF1在对照细胞和AS细胞中的SRM定量。NA指不治疗,NT指非靶向LNA治疗,正义(Sense):UBE3A正义LNA治疗以及ATS:UBE3AATS LNA治疗。(对于对照,n=2个系,对于AS,n=3,每个3次分化)。
图3:通过Western印迹法确认PEG 10为UBE3A靶标。在不治疗(NA)、非靶向LNA治疗(NT)和Sense/ATS治疗中任一种情况下,对照神经元和AS神经元裂解物中UBE3A、PEG10和ACTB的Western印迹分别示出针对PEG10 RF1/2同工型的显著UBE3A依赖性反比关系。
图4A:PEG10 RF1/2在对照神经元和AS神经元中的代表性免疫染色,其中对照神经元中的UBE3A敲低(正义)并且AS神经元中的UBE3A恢复(ATS)。
图4B:对照神经元和AS神经元中对照和AS HuCD阳性神经元中PEG10强度的定量(数据点是来自对照和AS细胞的两个独立神经元分化的单个神经元,基于Dunn的多重比较检验对P值进行调整以用于多重比较)。
图5A:左侧:在蛋白酶体抑制(MG132,10mM)的时间进程下,在0、4和8小时出现和不出现UBE3A敲低(正义)的情况下,对UBE3A和PEG10表达的Western印迹分析。右侧:利用蛋白酶体抑制进行的UBE3A和PEG10 RF1/2表达的定量。(n=3个独立实验,P值:Dunn的多重比较检验,针对多重检验进行了调整)。
图5B:在对照、AS和AS+ATS治疗中蛋白酶体抑制(MG132、10mM、6h)治疗下对UBE3AIP进行的Western印迹分析。红点代表经MG132治疗稳定的PEG10-UBE3A复合物。
图5C:左侧:利用蛋白酶体抑制(MG132,10mM,6h),在对照、AS、AS+ATS治疗中利用PEG10 IP对PEG10泛素化进行的Western印迹分析。右侧:PEG10泛素化的定量。(n=3个独立实验,P值:Dunn的多重比较检验,针对多重检验进行了调整)。
图6A:从IPSC神经元中分离胞外囊泡(EV)的方案。
图6B:来自AS细胞的Ev中PEG10 RF1/2和TSG101的代表性免疫电镜测量(放大倍数:15,000,插入4倍变焦,比例尺:200nm)。
图6C:来自对照细胞和AS细胞的PEG10 RF1/2阳性Ev的定量(n=3个独立的EV制剂,p值:曼-惠特尼检验)。
图6D:对照裂解物和AS裂解物中PEG10及其结合蛋白质和选定EV标志物的LC-MS热图(值是从Spectronaut获得的基因水平强度,是3个独立裂解物和EV制剂的平均值)。
图6E:针对PEG10 RF1/2和ATXN10以及EV标志物的免疫印迹分析,其中为裂解物和Ev加载了相等的总蛋白质。
具体实施方式
在第一方面,本发明提供了一种用于测量组织样品中UBE3A蛋白质表达调节的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供已用UBE3A调节剂治疗过的动物或细胞培养物的组织样品;
b)测量步骤a)的所述样品中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平,所述蛋白质选自由以下项组成的组:CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10和TCAF1、PPID;
c)将步骤b)中测量的至少一种蛋白质的蛋白质表达水平与对照样品中的至少一种蛋白质的蛋白质表达水平进行比较,其中与对照样品的中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平相比,在步骤b)中测量的至少一种蛋白质的经调节的蛋白质表达水平指示UBE3A蛋白质表达调节。
在本发明的方法的一个实施例中,在步骤b)中测量的蛋白质的蛋白质表达水平与UBE3A蛋白质表达水平呈负相关。
在特定实施例中,该方法涉及一种用于测量组织样品中UBE3A蛋白质表达诱导的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供已用UBE3A诱导剂治疗过的动物或细胞培养物的组织样品;
b)测量步骤a)的所述样品中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平,所述蛋白质选自由以下项组成的组:CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、TCAF1和PPID;
c)将步骤b)中测量的至少一种蛋白质的蛋白质表达水平与对照物中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平进行比较,其中与对照物中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平相比,步骤b)中测量的至少一种蛋白质的蛋白质表达水平的降低指示UBE3A蛋白质表达诱导。
在特定实施例中,该方法涉及一种用于确定UBE3A调节剂的UBE3A靶标接合的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供已用UBE3A调节剂治疗过的动物或细胞培养物的组织样品;
b)测量步骤a)的所述样品中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平,所述蛋白质选自由以下项组成的组:CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、TCAF和PPID;
c)将步骤b)中测量的至少一种蛋白质的蛋白质表达水平与对照物中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平进行比较,其中与对照物中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平相比,步骤b)中测量的至少一种蛋白质的经调节的蛋白质表达水平指示UBE3A调节剂的UBE3A靶标接合。
在特定实施例中,蛋白质选自TCAF1和PEG10。
在特定实施例中,组织样品是血液样品、血浆样品或CSF样品。
在特定实施例中,使用Western印迹法、MS或免疫测定法测量蛋白质表达水平。
在特定实施例中,UBE3A调节剂是反义寡核苷酸,特别是LNA反义寡核苷酸。
在特定实施例中,UBE3A调节剂是用于治疗自闭症谱系障碍、天使综合征或15qdup综合征的UBE3A蛋白质表达水平诱导剂。
在第二方面,本发明涉及一种用于鉴定UBE3A蛋白质表达调节剂的筛选方法,该筛选方法包括以下步骤:
a)提供已用检验化合物治疗过的动物或细胞培养物的组织样品;
b)测量步骤a)的所述样品中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平,所述蛋白质选自由以下项组成的组:CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、TCAF1和PPID;
c)将步骤b)中测量的至少一种蛋白质的蛋白质表达水平与对照物中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平进行比较,其中与对照物中至少一种蛋白质的蛋白质表达水平相比,步骤b)中测量的至少一种蛋白质的经调节的蛋白质表达水平指示UBE3A蛋白质表达调节剂。
在第三方面,本发明涉及选自由CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、TCAF1和PPID组成的组的蛋白质作为用于UBE3A蛋白质表达水平调节的生物标志物的用途。
在本发明的用途的特定实施例中,蛋白质选自TCAF1和PEG10。
在本发明的用途的特定实施例中,UBE3A调节是由UBE3A蛋白质表达水平诱导剂引起。
在本发明的用途的特定实施例中,UBE3A生物标志物的蛋白质表达水平与UBE3A蛋白质表达水平呈负相关。
在本发明的用途的特定实施例中,本发明提供了一种用于确定UBE3A蛋白质表达水平调节剂的UBE3A靶标接合的方法。
在本发明的用途的特定实施例中,UBE3A蛋白质表达水平调节剂是反义寡核苷酸,特别是LNA反义寡核苷酸。
在本发明的用途的特定实施例中,UBE3A蛋白质表达水平调节剂是用于治疗自闭症谱系障碍、天使综合征或15qdup综合征的UBE3A蛋白质表达水平诱导剂。
定义
除非另外指明,否则如本文所用的术语“蛋白质”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白质,该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如,人)和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工蛋白质、通过细胞中加工产生的任何形式的蛋白质,以及源自天然蛋白质的肽。该术语还涵盖天然存在变体,例如剪接变体或等位基因变体。表2中所示的氨基酸序列是本发明的生物标志物蛋白质的示例性氨基酸序列。
在本发明中,UBE3A蛋白质表达水平调节剂是指能够降低或提高UBE3A蛋白质表达水平的分子。能够降低UBE3A蛋白质表达水平的调节剂称为UBE3A抑制剂,并且能够提高UBE3A蛋白质表达水平的调节剂称为UBE3A增强剂。UBE3A调节剂可以是干扰RNA分子的mRNA。在另一实施例中,UBE3A调节剂是双链RNA(dsRNA),例如短干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。双链RNA可以是任何类型的RNA,包括但不限于mRNA、snRNA、microRNA和tRNA。RNA干扰(RNAi)特别适用于特异性地抑制特异性RNA和/或蛋白质的产生。适用于本发明的dsRNA分子的设计和制备在本领域技术人员的技术范围内,特别是关于WO 99/32619、WO99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。优选地,siRNA分子包含具有与靶mRNA相同的约19至23个邻接核苷酸的核苷酸序列。术语“shRNA”是指其中少于约50个核苷酸与同一RNA分子上的互补序列配对的siRNA分子,该序列和互补序列被至少约4至15个核苷酸的未配对区域分隔开(在由两个碱基互补区域产生的茎结构上形成一个单链环)。有完善的siRNA设计标准(参见,例如,Elbashire等人,2001)。
UBE3A调节剂可以是反义寡核苷酸,其能够通过与靶核酸,特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因的表达。反义寡核苷酸基本上不是双链的,因此不是siRNA或shRNA。优选地,本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解的是,单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体),只要其内部或相互间的自身互补程度小于寡核苷酸全长的50%。
术语“对照样品”是指未用UBE3A调节剂治疗的样品。例如,对照样品是未用UBE3A调节剂治疗的细胞培养物样品,或者细胞培养物已用非UBE3A调节剂的化合物加以治疗(阴性对照)。
结果
对AS患者和健康对照个体诱导性多能干细胞(iPSC)衍生神经元进行蛋白质表达谱分析。UBE3A以及蛋白质和通路跨患者系失调。使用ASO,通过分别敲低正义或反义转录物,减少对照系中的UBE3A蛋白质或在患者系中恢复UBE3A蛋白质,从而相互调节这些蛋白质的子集。这些UBE3A依赖性蛋白质包括CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、PPID和TCAF1。FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10是LTR反转录转座子衍生基因的LTR,含有可能在外泌体生理学中起作用的GAG衣壳结构域。
图1鉴定包括蛋白质CCDC88A、DST、FAM127A、FAM127B、FAM127C、PEG10、PPID和TCAF1的新型Ube3a靶标
为了鉴定响应于Ube3a蛋白质水平变化而受到调节的蛋白质,我们在对照IPSC衍生的神经元中进行了Ube3a敲低,并通过敲低Ube3a ATS靶向序列来提高AS系中的Ube3a表达。细胞团块进一步经历使用TMT-SPS-MS3定量进行的蛋白质表达谱分析。在proteomediscoverer 2.1上分析TMT-MS3数据,并进一步对结果表进行统计分析,通过筛选在对照神经元中Ube3a敲低时上调的蛋白质和在AS细胞中Ube3a恢复时下调的蛋白质,获得在Ube3a水平变化时受调节的蛋白质(图1)。
图2:通过SRM确认PEG 10和TCAF1为UBE3A靶标
为筛选到的蛋白质CCDC88A、DST、HERC2、UCHL5、HERC1、MCF2L、PEG10、TCAF1设置了选择反应监测(SRM)测定(Dunkley等人),使用映射到这些蛋白质中的每种蛋白质的独特的肽设置UBE3A(每种蛋白质至少一种肽)。使用两个对照系和3个AS系按照与之前相同的治疗方式执行SRM(对照细胞中的Ube3a敲低且AS细胞中的Ube3a恢复)。图2示出了显示UBE3A、相对于UBE3A水平变化的反向调节的PEG10、TCAF1的条形图。
图3:通过WB确认PEG 10和TCAF1为UBE3A靶标
为了确定PEG10是否显示出任何与由UBE3A进行的调节相关的同工型特异性,我们在对照细胞和AS细胞中对PEG10和UBE3A执行了western印迹法。观察到PEG10同工型RF1/2以UBE3A依赖性方式受到最显著的调节,而PEG10 RF1在UBE3A水平变化时基本保持不变(图3)。
图4:使用免疫细胞化学法证明PEG10受到UBE3A调节
图4A:使用特异性地识别RF1/2的抗体,我们证实了PEG10表达是神经元特异性的(与HuCD共定位),在UBE3A敲低时升高,在AS神经元中升高,并在UBE3A恢复后得到挽救。PEG10 RF1/2在神经元胞体中显示出大量弥散染色。
图4B:对照神经元和AS神经元中对照和AS HuCD阳性神经元中PEG10强度的定量(数据点是来自对照细胞和AS细胞的两个独立神经元分化的单个神经元,基于Dunn的多重比较检验对P值进行调整以用于多重比较)。
图5:证明PEG10和UBE3A可以形成蛋白质复合物,并且PEG10由UBE3A以泛素化依赖性方式调节。
为了评估PEG10在UBE3A下调时的过表达是否依赖于蛋白酶体,我们在对照神经元中蛋白酶体抑制(MG132)持续时间增加的条件下以及在UBE3A敲低(正义)时对PEG10进行了免疫印迹分析(图5A)。利用抗K48 Ub进行的免疫印迹分析显示,经MG132治疗后多泛素化蛋白质显著增加(图5A,顶部)。MG132治疗在MG132治疗的8小时内没有显著改变UBE3A表达。正如预期的,PEG10 RF1/2表达随着UBE3A敲低而升高。通过4小时和8小时的MG132,我们观察到PEG10 RF1/2表达显著增强,而在UBE3A敲低的情况下未观察到PEG10 RF1/2显著增强(图5A,右侧为定量的)。接下来,我们在正常(DMSO)或MG132治疗下,对对照、AS和利用UBE3A恢复的AS(AS+ATS)细胞中的UBE3A进行免疫沉淀反应,然后对UBE3A和PEG10进行western印迹法分析。我们在对照细胞中没有看到针对UBE3A的PEG10富集,而AS细胞中的残留UBE3A显示与PEG10的结合,这随着ATS治疗而减弱。在蛋白酶体抑制下,我们观察到PEG10-UBE3A复合物在所有条件下都发生了富集(图5B,红色星号)。相应地,在MG132治疗时,PEG10 IP-WB在对照神经元中显示PEG10多泛素化带谱,尽管,AS神经元中的PEG10多泛素化带谱在PEG10水平高的情况下仍然减少,并通过UBE3A挽救(ATS LNA)而得到挽救(图5C)。
图6:PEG10分泌于来自天使综合征神经元的胞外囊泡。
为了检验是否像病毒一样,PEG10也可分泌于胞外囊泡(EV),我们从对照神经元和AS神经元中分离出胞外囊泡(图6A)。图6B:使用免疫电镜(immuno-EM)技术,我们证实了来自AS神经元的EV中存在典型的EV标志物TSG101和PEG10 RF1/2。图6C:使用免疫电镜技术对来自对照神经元和AS神经元的EV进行的定量显示,20.73%(±1.27s.e.m)的AS EV对PEG10呈阳性,与此相反,对照神经元中为6.26(±1.68s.e.m)。图6D:接下来,我们对对照细胞裂解物和AS细胞裂解物以及相应的EV分离部位进行了数据非依赖性采集(DIA)质谱分析。DIA分析证实了AS细胞裂解物和EV中PEG10的显著上调(Log2 FC=0.99和0.80,Adj.P=0),而PEG10在EV中的富集并不优先于核心EV标志物(TSG101、Alix、CD81和CD63)等裂解物。在证实是PEG10结合配偶体的蛋白质中,TCAF1水平在AS裂解物和EV中升高,ATXN10水平在来自AS神经元的EV中选择性升高,而RTL8C水平在AS裂解物中显示升高,但在EV中没有升高。图6E:接下来,我们使用WB确认了PEG10RF1/2在EV中的表达和富集。PEG10 RF1/2分泌在EV中并在EV中显示片段化(图4M)。与DIA结果一致,TSG101和Alix(PDCD6IP)在EV中被富集,而ATXN10在AS EV中选择性地被富集。因此,PEG10将其结合配偶体ATXN10、TCAF1和FAM127A/RTL8C招募到EV中。
材料和方法:
根据Costa等人,2016,从IPSC获得的NSC分化为神经元。
利用1μM和5μM的UBE3A正义序列靶向LNA 5'-TTTAcaccctacttcttaaCA-3’(Seq.Id.No.35)治疗从对照样品中获得的神经元,并利用基于专利(WO2017081223A1)的UBE3A反义靶向序列5'-CTttccatttatttccATTT-3'(Seq.Id.No.36)治疗AS细胞。收集神经元分化第42天的细胞并根据Gygi论文进行样品制备。将条件随机分为6组TMT x 10plex,每组TMT x 10plex含有两个合并样品。标记后,将样品合并,并在Agilent 1260infinity系列高效液相色谱(安捷伦科技,瓦尔德布龙,德国)上的YMC-Triart C18色谱柱(0.5mm x250mm、S-3μm粒径、12nm孔径)上进行基本的反相分馏。使用以下梯度以12μl/min对样品进行分馏。2%-23%缓冲液B 5分钟,23%-33%缓冲液B 25分钟,33%-53%缓冲液B 30分钟,53%-100%缓冲液B 5分钟以及100%缓冲液B 5分钟。通过在1分钟内从100%缓冲液B变化为2%缓冲液B,然后2%缓冲液B持续14分钟来平衡色谱柱。从4分钟到84分钟,在96孔样品板中总共收集了36个馏分,每个馏分体积约为26μl。
分馏后,将样品干燥、酸化,并在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid(ThermoFisher Scientific)质谱仪上采集数据。该仪器在数据依赖性采集模式下运行,以120,000(在m/z 200)的分辨率和2E5的自动增益控制(AGC)目标值收集质量范围为350-1400m/z的Orbitrap MS1扫描,其中最大注射时间(IT)为50ms。使用环境空气六环二甲基硅氧烷在m/z445.12002处动态校准数据。在每次MS1扫描之间,在3秒的时间,单一同位素选择电荷状态在2-6之间、最小强度为5E3的N个最强前体离子进行碰撞诱导解离(CID),碰撞诱导解离使用m/z 0.7的四极杆隔离、AGC目标1E4、最大IT 50ms、碰撞能量35%、以及具有涡轮扫描速率的离子阱读出器。使用10ppm作为低质量和高质量容差,在1次出现75秒后排除前体离子。对每个前体离子的单个电荷状态进行依赖性扫描。TMT报告离子的生成如下:使用同步母离子选择(SPS)、m/z 2的MS四极杆隔离窗口、65%的归一化碰撞能量下的高能碰撞解离(HCD)并在质谱仪中读出,其中质谱仪的分辨率为50k(在m/z 200),扫描范围为m/z 100到500,AGC目标为5E4,最大IT为105ms。选择SPS前体离子的质量范围为m/z 400至m/z 2000,不包括具有m/z 40(低)和5(高)公差的MS2前体离子,以及由此产生的任何TMT中性损失。SPS前体离子的数量设置为10。
1.采集后,使用连接到Mascot Server 2.6.1(矩阵科学(Matrix Science),伦敦,英国)的Proteome Discoverer 2.1处理原始数据。
2.处理工作流程使用胰蛋白酶/P作为酶在UniProt人蛋白质数据库搜索MS
3.脲基甲基化半胱氨酸(+57.02146Da)、TMT10标记的赖氨酸和肽N端(+229.16293Da)设置为静态修饰。
4.氧化蛋氨酸(+15.99492Da)和乙酰化蛋白N端(+42.01057Da)设置为动态修饰。
5.使用Percolator进行诱饵数据库搜索,其中目标FDR基于q值阈值设置为0.01。
6.报告离子定量是对HCD-MS
7.调整报告离子强度以使用制造商规范校正不同TMT试剂的同位素杂质。
8.一致的工作流程被定义为将PSM分组为肽和蛋白质。
9.通过将q值阈值设置为0.01并允许软件自动选择PSM q值分组来控制肽FDR。
10.最小长度为6个氨基酸的高可信度独特肽被分组为蛋白质,蛋白质FDR也设置为0.01。
11.通过对每个通道的S/N求和并利用最高的TMT通道总强度对每个值进行归一化来完成肽和蛋白质的定量。单个肽和蛋白质S/N被缩放到平均100,并且只有高FDR可信度蛋白质定量强度被保留用于统计分析。
在6组10-plex TMT中分析样品,每个plex中有两个合并样品。使用ProteomeDiscoverer(2.1版,赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))对数据进行注释和归一化。在肽水平上对每个通道的总强度的最大值进行归一化。利用IRS方法使用常见的合并样品对6个TMT-plex进行归一化:计算每种蛋白质的比例因子,以将它们的参考值调整为合并样品的几何平均值。然后,根据Plubell等人,2017,这些比例因子被用来衡量每个TMT实验中剩余样品中每种蛋白质的丰度。使用limma(Ritchie等人,2015)通过拟合每种蛋白质的线性模型并应用经验贝叶斯方法来调节差异(Phipson等人,2016)来计算蛋白质的差异丰度。通过计算与multcomp(Hothorn等人,2008)和lsmeans(Russel和Length等,2016)的对比,比较了不同的条件。通过控制错误发现率(Benjamini和Hochberg 1995)针对多重校验调整计算的p值。所有计算均在R中执行(R Core team,2018)。
合成了同位素标记的肽(未纯化),其含有L-[U-13C,U-15N]R或L-[U-13C,U-15N]K,对应于表1中所示的26个目标肽(JPT Peptide Technologies),并且它们的序列通过LC-MS/MS确认。来自两个对照神经元和三个AS神经元的细胞团块在3个独立的分化中进行LNA治疗,并使用Preomics试剂盒(Preomics GmBH)进行溶液消化。根据Dunkley等人,2015,在每个样品中加入50fmol的合并肽混合物,并且在Q-Exactive质谱仪(Thermo)上进行测量和分析。数据在Skyline上进行处理,使用重参考标准校正内源性肽丰度,针对ACTB进行归一化。图2表示所选蛋白质,PEG10、TCAF1和UBE3A的丰度。
表1:用于UBE3A的SRM分析和验证UBE3A靶标的合成肽。
针对神经元细胞团块进行western印迹,通过在4℃下与RIPA裂解缓冲液一起孵育20分钟在RIPA缓冲液(赛默飞世尔科技,试剂盒89900)中变性、进行超声处理、进行还原(10X NuPAGE
样品在4-15%Criterion
表2:本发明的生物标志物蛋白
参考文献
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- E3泛素连接酶(UBE3A)蛋白质靶标
- 基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法