一种EGCG衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品学、分子生物学、医学等领域，通过采用由茶叶中提取的EGCG进行位点修饰，发现了一种含吡唑骨架的EGCG衍生物及其制备方法，该药物在表现出显著的抗肿瘤活性的同时，极大的降低毒副作用，具有优异的水溶性。

背景技术

茶，是我国的传统饮品。近年来，在对茶叶的广泛研究中发现，茶叶中具有广谱疾病预防作用的有效成分主要是茶叶中的多酚类物质，其中代表便是儿茶素。

儿茶素(Catechin)，又称茶单宁、儿茶酸。儿茶素是茶叶中黄烷醇类物质的总称，占茶多酚含量的60％-80％。最早儿茶素是由中药材儿茶中提取出来的，在绿茶中含量较为丰富。儿茶素是茶叶中主要活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病等作用。目前已从茶叶中分离纯化鉴定出多种儿茶素单体。例如，茶黄素双没食子酸酯可通过诱导NO合成酶(iNOs)的合成降低，抑制内源性致癌物质的形成进而抑制肿瘤形成和发展。茶色素对T淋巴细胞的转化、自然杀伤细胞的活性有显著地增强作用，还可有效抑制由黄曲霉素、苯并芘等致癌物导致的细胞突变、基因与染色体的突变及由放射线诱导的细胞癌变。

大量的报道表明，COX-2在结直肠癌、食道癌、肺癌、皮肤癌和乳腺癌等多种实体瘤中表达增强，与肿瘤的发生、血管生成、细胞增殖和细胞凋亡等多种过程密切相关。在过去的几十年中，已发现了多种昔布类选择性COX-2抑制剂，如塞来昔布、罗非昔布、帕瑞考昔和伐地考昔等，这些选择性抑制剂可以有效地减少传统tNSAIDs的副作用，并在许多肿瘤研究中显示出一定的活性。但不幸的是，许多临床研究表明，长期和高剂量服用COX-2抑制剂会增加心肌梗塞的风险，严重者甚至会威胁患者的生命。并且，现有的COX-2药物因其水溶性的问题，成药困难。

因此，本发明以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为框架，结合经典的COX-2抑制剂塞来昔布的部分结构，发现了一种含吡唑骨架的EGCG衍生物，对其COX-2抑制作用、抗肿瘤活性、毒性等内容进行了研究。

发明内容

本发明涉及食品学、分子生物学、医学等领域，通过采用由茶叶中提取的EGCG进行位点修饰，发现了一种含吡唑骨架的EGCG衍生物及其制备方法，该药物在表现出显著的抗肿瘤活性的同时，极大的降低毒副作用，具有优异的水溶性，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种具有式Ⅰ结构的EGCG衍生物及其药学上可接受的盐，其结构如下：

具有式Ⅰ结构的EGCG衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：

S1：将EGCG、溴乙酸乙酯和无水碳酸钾溶于无水丙酮中，加热搅拌反应。反应结束后，冷却至室温，过滤得粗产物；将粗产物重新溶于甲醇溶液中，搅拌条件下再加入强碱回流。反应结束后，将反应液倒入冰水中，并用1M稀盐酸调pH为强酸性，析出抽滤得到化合物1。

S2：将丁炔二酸二甲酯溶于乙醚，低温搅拌。另称取一甲基肼溶于乙醚中，加入强碱溶液将pH调节至碱性，将该混合溶液倒入恒压滴液漏斗，滴加入低温反应的丁炔二酸二甲酯乙醚溶液，反应后抽滤、淋洗、烘干，得到化合物2。

S3：将化合物1、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于二氯甲烷中，加热条件下搅拌反应后，然后加入化合物2，继续搅拌反应。反应结束后，用淋洗液洗三次，通过柱层析提纯得到目标化合物式Ⅰ。

其中，在反应步骤S1中：所述EGCG、溴乙酸乙酯、无水碳酸钾、强碱的添加比例为：(1～3)：(1～2)：(1～3)：(1～3)；加热搅拌反应条件为60～90℃；强碱为氢氧化钾、氢氧化钠中的至少一种；强酸性的pH为1～5。

其中，在反应步骤S2中：所述丁炔二酸二甲酯、一甲基肼的添加比例为：(1～3)：(1～3)；强碱溶液为氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液中的至少一种；pH调节的范围为7～10。

其中，在反应步骤S3中：所述化合物1、EDC·HCl、HOBT、DMAP、化合物2的添加比例为：(1～3)：(1～3)：(1～2)：(1～2)：(1～3)；加热条件的温度30～65℃；淋洗液为饱和氯化钠溶液和二氯甲烷比例为：(1～2)：(1～2)。

一种药物组合物包含如权利要求1所述的具有式Ⅰ结构的EGCG衍生物及其药学上可接受的盐。

包括具有式Ⅰ结构的EGCG衍生物及其药学上可接受的盐或包含此类结构的药物组合物作为COX-2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤选自：食道癌、胃癌、胰腺、肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫体癌、皮肤癌和乳腺癌。

本发明具有如下有益效果：

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在良好的抗肿瘤活性、低毒副作用、优异的水溶性方面：

本发明的一种含吡唑骨架的EGCG衍生物式Ⅰ的优势在于：

①式Ⅰ是主要框架结构来自表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的有机衍生物，源于茶叶，相较于塞来昔布、罗非昔布、帕瑞考昔和伐地考昔等化学合成的COX-2抑制剂药物来说，能够明显降低心肌梗塞、心血管疾病、胃或肠道的出血、溃疡和穿孔的风险，降低对患者的毒副作用；

②式Ⅰ对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，相较于式Ⅰ的母框架结构EGCG，式Ⅰ具有更好的抗肿瘤活性；

③式Ⅰ作为具有抗肿瘤活性的EGCG衍生物，一方面，式Ⅰ具有特异性的抑制COX-2的作用，在抗肿瘤之外能够起到镇痛抗炎的作用；另一方面，其对于COX-1没有明显抑制作用，有针对性的COX-2抑制作用能够降低传统的或特异性不强的COX抑制剂抑制COX-1导致的不良反应；

④式Ⅰ拥有较多酚羟基等亲水基团、相较于塞来昔布、罗非昔布等COX-2抑制剂药物具有优异的水溶性。

本发明的一种含吡唑骨架的EGCG衍生物式Ⅰ的制备方法的优势在于：

①EGCG提取不易，使用本发明的制备方法，产率高节省原料；

②通过S1、S2的pH调控可以提高反应速率、析出效率，简化制备流程；

③经过每一步的淋洗能够去除多余杂质，提升所得目标化合物的纯度和产率。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

S1：将EGCG(1mmol)、溴乙酸乙酯(1mmol)和无水碳酸钾(1mmol)溶于10mL无水丙酮中，60℃搅拌反应9h。反应结束后，将反应液冷却至室温，过滤，得粗产物；将粗产物重新溶于10mL甲醇溶液中，搅拌条件下再加入氢氧化钾(1.5mmol)，混合物回流3h。反应结束后，将反应液倒入80mL冰水中，并用1M稀盐酸调pH为1～2，抽滤，得到化合物1。

S2：将丁炔二酸二甲酯(3mmol)溶10ml乙醚，倒入圆底烧瓶，置于低温反应容器中，-20℃搅拌30min。称取一甲基肼(9mmol)溶于10ml乙醚中，在烧杯中加入氢氧化钠溶液，pH调节至7～8，随后将配置好的混合溶液倒入恒压滴液漏斗，每秒1滴左右的速度加入反应体系，滴加完毕后继续搅拌1h。抽滤，用乙醚淋洗，烘干，得到化合物2。

S3：将化合物1(1mmol)、EDC·HCl(2mmol)、HOBT(1mmol)和DMAP(1mmol)溶于10mL二氯甲烷中，在30℃搅拌下反应60min，然后加入化合物2(1.5mmol)，搅拌反应过夜。反应结束后，用饱和食盐水(50mL)和二氯甲烷(100mL)洗三次，通过柱层析提纯得到目标化合物式Ⅰ，产率约39％。

实施例2

S1：将EGCG(2mmol)、溴乙酸乙酯(1mmol)和无水碳酸钾(2mmol)溶于10mL无水丙酮中，70℃搅拌反应6h。反应结束后，将反应液冷却至室温，过滤，得粗产物；将粗产物重新溶10mL甲醇溶液中，搅拌条件下再加入氢氧化钾(2mmol)，混合物回流2h。反应结束后，将反应液倒入100mL冰水中，并用1M稀盐酸调pH为3～4，抽滤，得到化合物1。

S2：将丁炔二酸二甲酯(5mmol)溶10ml乙醚，倒入圆底烧瓶，置于低温反应容器中，-5℃搅拌30min。称取一甲基肼(5mmol)溶于10ml乙醚中，在烧杯中加入氢氧化钠溶液，pH调节至8～9，随后将配置好的混合溶液倒入恒压滴液漏斗，每秒1滴左右的速度加入反应体系，滴加完毕后继续搅拌1h。抽滤，用乙醚淋洗，烘干，得到化合物2。

S3：将化合物1(1mmol)、EDC·HCl(1.2mmol)、HOBT(0.48mmol)和DMAP(0.5mmol)溶于10mL二氯甲烷中，在45℃搅拌下反应30min，然后加入化合物2(1.1mmol)，搅拌反应过夜。反应结束后，用饱和食盐水(50mL)和二氯甲烷(50mL)洗三次，通过柱层析提纯得到目标化合物式Ⅰ，产率约40％。

实施例3

S1：将EGCG(2mmol)、溴乙酸乙酯(2mmol)和无水碳酸钾(3.5mmol)溶于10mL无水丙酮中，90℃搅拌反应8h。反应结束后，将反应液冷却至室温，过滤，得粗产物；将粗产物重新溶于10mL甲醇溶液中，搅拌条件下再加入氢氧化钠(3mmol)，混合物回流3h。反应结束后，将反应液倒入120mL冰水中，并用1M稀盐酸调pH为4～5，抽滤，得到化合物1。

S2：将丁炔二酸二甲酯(7mmol)溶10ml乙醚，倒入圆底烧瓶，置于低温反应容器中，-10℃搅拌45min。称取一甲基肼(4mmol)溶于10ml乙醚中，在烧杯中加入氢氧化钾溶液，pH调节至9～10，随后将配置好的混合溶液倒入恒压滴液漏斗，每秒1滴左右的速度加入反应体系，滴加完毕后继续搅拌2h。抽滤，用乙醚淋洗，烘干，得到化合物2。

S3：将化合物1(1mmol)、EDC·HCl(1.5mmol)、HOBT(0.8mmol)和DMAP(0.8mmol)溶于10mL二氯甲烷中，在65℃搅拌下反应45min，然后加入化合物2(1.2mmol)，搅拌反应过夜。反应结束后，用饱和食盐水(100mL)和二氯甲烷(50mL)洗三次，通过柱层析提纯得到目标化合物式Ⅰ，产率约39％。

上述实施例1-3所得的目标化合物式Ⅰ经过核磁共振氢谱和质谱解析相同，其中之一数据如下：

1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.83(s,1H),8.09(d,J＝7.4Hz,2H),7.66-7.60(m,1H),7.58(t,J＝7.5Hz,3H),7.43-7.35(m,3H),7.35-7.28(m,3H),7.27-7.22(m,2H),7.21-7.16(m,2H),7.06(s,2H),6.89(d,J＝2.3Hz,1H),6.65(s,2H),6.48(d,J＝2.3Hz,1H),5.09(s,4H).,1.56(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:182.58,168.47,164.04,161.70,157.66,147.97,144.12,139.92,132.65,131.00,130.11,129.60,129.56,129.06,128.96,128.81,126.93,125.69,108.09,105.88,105.81,99.07,94.15,65.47,60.68.MS(ESI):654.58[M+H]+.Anal.

由此确认目标化合物式Ⅰ的结构如式Ⅰ结构图所示，二者一致。

附图用来提供对本发明的功效理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

在附图中：

图1是本发明的目标化合物式Ⅰ与COX-2结合模型；

图2是本发明的目标化合物式Ⅰ对HeLa细胞凋亡实验的结果；

图3是本发明目标化合物式Ⅰ和EGCG的水溶性实验结果。

生物活性评价方面：

1、式Ⅰ的COX抑制实验：

我们通过COX-1/COX-2ELISA试剂盒检测了所合成目标化合物式Ⅰ的COX-1和COX-2抑制能力。结果表明式Ⅰ对COX-2表现出一定的抑制活性，其IC

2、式Ⅰ与COX-2结合模型：

如图1所示，目标化合物式Ⅰ与COX-2结合紧密，生物活性的初步评价均表明该药物具有显著的COX-2抑制作用。

3、式Ⅰ的细胞凋亡实验：

考虑到目标化合物式Ⅰ优异的COX-2抑制活性，我们通过流式细胞仪进一步评估了式Ⅰ对HeLa细胞凋亡的影响。在用浓度为0、1.25、2.5、5和10μM的式Ⅰ处理HeLa细胞24h后，凋亡细胞的百分比从4.01％增加到58.30％；这些结果证实了式Ⅰ可以通过以剂量和时间依赖性方式诱导细胞凋亡，进而抑制HeLa细胞的生长。细胞凋亡图如图2所示。

4、式Ⅰ的抗肿瘤活性实验：

取对数生长期的CaES-17、N87、Pan02、HepG2、A549、MC-38、SW-480、HeLa、A431、MCF-7细胞，按7×104细胞/mL的密度接种到96孔板中，培养12h。然后加入不同浓度的被测化合物孵育48h。随后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h。将孔中的原培养液去除，并加入150μL DMSO，震荡15min。最后用酶标仪检测570nm处的吸光度，并根据以下方程计算出相应的细胞毒性：

其中OD

表1

根据上述表1的结果，表明目标化合物式Ⅰ对10株癌细胞(食道癌、胃癌、胰腺、肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、皮肤癌和乳腺癌)相比于阳性对照组的EGCG，具有显著优异的肿瘤细胞增殖抑制作用，即式Ⅰ具有更为优异的抗肿瘤活性。

5、式Ⅰ的水溶性实验

取相同质量的目标化合物式Ⅰ及EGCG，滴加一定体积的纯水，通过二者的对比图，从而显示出式Ⅰ更为优异的水溶性：

如图3所示，左边EP管装有式Ⅰ化合物，右边EP管装有EGCG，式Ⅰ的EP管澄清透明，反而右边EP管略显浑浊，可见式Ⅰ相对于EGCG优异的水溶性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式及生物活性评价，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。