一种褐藻来源的高硫酸化岩藻半乳聚糖在预防和治疗肺纤维化药物和保健品中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及褐藻多糖的一种新用途，具体涉及一种高硫酸化岩藻半乳聚糖在预防和治疗肺纤维化药物和保健品中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由一种新的β冠状病毒-新型冠状病毒引起，以血管紧张素转化酶2(ACE2)作为受体侵入细胞导致肺损伤，病情加重与继发引起的全身性炎症反应密切相关重症患者会出现急性呼吸窘迫综合征和感染性休克最终出现多器官功能衰竭。COVID-19传染性强,可引起多种严重的并发症，对全球公共安全造成了极大威胁。目前大多数药物如巴利替尼、瑞德西韦、氯喹等尚处于临床试验阶段，尚无特效药治疗。

冠状病毒肺炎疾病的早期表现可能与无法控制的病毒复制有关，而后期肺损伤可能是由于机体免疫反应引起的免疫病理损害。2019-nCoV和2003年爆发的SARS-CoV同样作用于ACE2受体，通过受体介导的内吞作用进入细胞，主要感染纤毛支气管上皮细胞和肺泡细胞，增加肺血管通透性，并诱导急性肺损伤，后期表现为弥漫性肺泡损伤和急性纤维蛋白性机化性肺炎。除病毒直接导致肺组织损伤外，其引发的细胞因子风暴会进一步加重炎症反应，异常升高的细胞因子与过度激活的免疫细胞在肺中激活、募集造成肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞弥漫性损伤，大量渗出液聚集使气道阻塞,肺功能恶化急剧加重，导致ARDS和呼吸-循环衰竭，更严重的病例可发展为不受控制的全身性炎症反应，伴有休克、血管渗漏、弥散性血管内凝血和多器官功能衰竭,是导致新型冠状肺炎重症病人死亡的重要因素。因此除积极的抗病毒治疗外，治疗和改善肺泡损伤和肺纤维化是提高新冠肺炎患者治愈率，改善肺炎患者康复后生存质量的重要途径。

高硫酸化岩藻半乳聚糖(fucoidan)是一类独特的以岩藻糖为主要组成单糖的硫酸化多糖，存在于海洋褐藻和部分海洋棘皮动物中。我们前期研究发现高硫酸化岩藻半乳聚糖具有显著的治疗慢性肾衰的活性，可以显著的减轻和减缓肾纤维化的过程。其作用机制为减少肾小管上皮细胞中纤维连接蛋白(Fn)或结缔组织生长因子(CTGF)的表达，维持肾小管上皮细胞正常的细胞形态，抑制TGF-β1诱导的EMT转化。我们研究表明高硫酸化岩藻半乳聚糖可以竞争性地抑制SARS-CoV-2病毒或SARS病毒的受体结合域(S蛋白)与靶细胞表面受体(ACE2)结合，有效阻断病毒进入细胞，具有显著的抗SARS-CoV-2病毒或SARS病毒能力。进一步研究发现高硫酸化岩藻半乳聚糖一方面抑制Akt通路诱导的TGF-β依赖的EMT，进而下调β-catenin和COL2A1，减轻胶原堆积。另一方面，高硫酸化岩藻半乳聚糖可抑制TGF-β引发的炎症通路。

本专利报道了一种褐藻来源的高硫酸化岩藻半乳聚糖可有效抑制TGF-β诱导的细胞上皮到间叶的转移并对博来霉素诱导的肺纤维化及炎症因子导致的肺纤维化具有显著的治疗作用，可以应用于预防和治疗肺纤维化。

发明内容

本发明的目的是提供一种褐藻来源的高硫酸化岩藻半乳聚糖在预防和治疗肺纤维化药物和保健品中的应用。高硫酸化岩藻半乳聚糖经细胞和动物实验表明高硫酸化岩藻半乳聚糖能够减少肺组织结构破坏和功能丧失。

所述的高硫酸化岩藻半乳聚糖其主要组成单糖包括岩藻糖和半乳糖，此外还包括少量的葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸等中的一种或多种；其水解硫酸基含量在25-45％之间，岩藻糖含量在25％-45％之间，糖醛酸含量在0.5％-5％之间，分子量范围为20kDa-150kDa。

所述的高硫酸化岩藻半乳聚糖来源于海洋褐藻，海洋褐藻包括该褐藻多糖系从海洋褐藻包括海带、裙带菜、马尾藻、墨角藻、鹿角菜、泡叶藻、昆布、枝管藻、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、海黍子、海蒿子等中的一种或多种。

所述的高硫酸化岩藻半乳聚糖褐藻多糖可以用于治疗和预防肺纤维化相关症状/疾病的药品、保健品及食品。

所述的肺纤维化包括由湿寒湿热、炎症反应、病毒环境以及吸入PM2.5等引起的肺纤维化。

所述预防和治疗纤维化相关症状/疾病的药品、保健品、食品及生物材料中可添加药学及生物学上可接受的载体或辅料。

附图说明

图1.岩藻多糖减轻了博莱霉素(BLM)诱导的小鼠肺纤维化。肺部照片(A)，纤维化评分(B)，炎症评分(C)，存活率(D)，测定血清(E)中的IL-6，小鼠肺组织HE染色(F)和Masson三色染色(G)肺切片的代表性图像。

图2.在BLM诱导的小鼠模型中，岩藻多糖减弱了肺EMT表型。对每个实验组进行胶原蛋白1，β-连环蛋白，P-PI3K，PI3K，P-AKT，AKT，TGF-β,TNF-α和IL-6的蛋白质印迹分析。

图3.岩藻多糖改善了TGF-β1诱导的A549细胞纤维化状态。将A549细胞与10ng/ml的TGF-β1和不同浓度的岩藻多糖(25、50、100、200μg/mL)孵育36小时。细胞细胞毒性测定(A)，A549细胞在普通光学显微镜(B)和扫描电子显微镜(C)下的细胞形态。

图4.在TGF-β1诱导的A549细胞模型中，岩藻多糖减弱了细胞的EMT表型。对每个实验组的Collagen 1，β-catenin，P-PI3K，PI3K，P-AKT，AKT，TGF-β，smad 4和smad 2/3进行蛋白质印迹分析。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明方案作进一步的具体说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。

实施例1高硫酸化岩藻半乳聚糖的制备及化学组成分析

(1)将5kg海带除去泥沙，用20倍海带重量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃，提取2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇沉淀，过滤得粗多糖，多糖粗品得率为：4.84％。

(2)将粗多糖溶于水配成质量浓度为1.5％的溶液，加入2mol/L MgCl

(3)取上述冻干得到的褐藻多糖溶于水，配成浓度为2.5％的水溶液，上样到以DEAE-Sepharose-CL-6B为载体柱层析，依次用0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl、1.0mol/LNaCl、1.5mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液洗脱，收集各洗脱液，分别装入3500Da透析袋内透析、浓缩透析袋内溶液冻干。其中由1.0mol/L NaCl洗脱所得的白色絮状沉淀即为高硫酸化岩藻半乳聚糖。其化学组成结果如表1所示。

表1高硫酸化岩藻半乳聚糖(SGF)的化学组成分析(重量％)

由结果可知，高硫酸化岩藻半乳聚糖的分子量为82100Da，岩藻糖和硫酸基含量较高，分别为43.43％和41.80％，葡萄糖醛酸含量较低，仅有0.86％。中性单糖组成结果表明除岩藻糖和半乳糖外，还含有少量的甘露糖、葡萄糖和鼠李糖。

应用例1：一种防治肺纤维化的褐藻多糖可减轻博莱霉素(BLM)诱导的小鼠肺部炎症和纤维化病变

该实验使用一种防治肺纤维化的褐藻多糖提取自海带，其中，岩藻糖的含量为34.8％，糖醛酸的含量为2.5％，高硫酸化岩藻半乳聚糖的均分子量为80.1kDa.

选择八周龄C57BL/6J雄性小鼠，体重25±2g，分为5组(空白组-Neg、BLM模型组-BLM、岩藻多糖高剂量组-BLM+DFPSH、岩藻多糖低剂量组-BLM+DFPSH、尼布达尼组-BLM+Nintedanid)，每组8只。模型组及给药组进行气管给以博来霉素(5mg/kg)，空白组进行假手术，给以等量生理盐水。空白组灌胃生理盐水，低剂量组灌胃40mg/kg/天，高剂量组灌胃80mg/kg/天，阳性药选择尼布达尼200mg/kg/天。灌胃期间监测小鼠体重以及存活情况。用药14天后，小鼠解剖取血清、肺液氮处理之后置于-80℃冰箱备用，用于生化测定及组织形态观察。

图1显示，褐藻多糖可减轻小鼠气管灌注BLM后引发的小鼠存活率降低和肺部肿胀。褐藻多糖可改善肺的病理情况，减少细胞增殖，减轻胶原沉积，减轻肺泡腔和肺结构的。褐藻多糖可减轻BLM引发的小鼠炎症，减轻小鼠血清中IL-6的含量。

实施例2：一种防治肺纤维化的褐藻多糖减轻了BLM诱导的小鼠模型中的肺EMT和TGF-β表型

图2显示，一种防治肺纤维化的褐藻多糖减轻了BLM诱导的小鼠模型中的肺EMT和TGF-β表型。该褐藻多糖可下调PI3K-AKT通路。一方面Akt通路的抑制，下调了β-catenin和COL2A1，这减轻了EMT的发生，减轻胶原堆积。另一方面，该岩藻多糖减轻了TGF-β可引发炎症通路。

实施例3：一种防治肺纤维化的褐藻多糖减轻了TGF-β1诱导的A549细胞纤维化状态

将A549细胞在补充有10％胎牛血清和5％CO

图3显示，一种防治肺纤维化的褐藻多糖可减少A549细胞增殖，增加细胞之间的接触和连接，减少纺锤状的成纤维细胞外观。电子显微镜观察显示，该褐藻多糖可保护A549细胞的上皮外观。

图4显示，该岩藻多糖可在细胞水平减轻EMT表型。该岩藻多糖下调PI3K-AKT通路，一方面Akt通路的抑制，下调了β-catenin和COL2A1，这减轻了EMT的发生，减轻胶原堆积。另一方面，该岩藻多糖减轻了TGF-β可引发smad通路。

补充内容

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案精神和范围。