益生元组合物及其在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长中的应用

技术领域

本发明涉及一种益生元组合物及其在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长中的应用，属于保健食品技术领域。

背景技术

人体的肠道系统中包含着大量的细菌，总量达到人体细胞的100倍以上，这些细菌构成了人体的肠道微生态。越来越多的研究指出，肠道微生态与人体的疾病健康密不可分，尤其生命早期的肠道微生态对于一生的健康有着重要的影响[1]。

已有的研究指出，不同的喂养方式对于婴儿早期肠道微生态有重要的影响。配方喂养组的婴儿粪便中双歧杆菌与乳酸杆菌占比显著低于母乳喂养组婴儿。通过在婴儿配方奶粉添加益生菌和益生元，可以调节婴儿肠道微生态，接近母乳喂养婴儿的肠道微生态构成，尤其是双歧杆菌的比例[2]。

益生元是一类人体不能消化的碳水化合物，可以在宿主肠道中与肠道菌群相互作用产生对于宿主有好处的物质或者作用[3]。目前研究较多的益生元包括：低聚半乳糖、低聚果糖、菊粉、异构化乳糖、聚葡萄糖、低聚木酮糖等。

异构化乳糖，化学名称是4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，是乳糖在加热条件下经碱或不经碱异构化制得的产物，是乳糖的同分异构体，已有大量临床研究报道了它的健康功效。首先，异构化乳糖有很好的益生元作用，虽然它不属于膳食纤维。最早在1957年，Petuely发现异构化乳糖对双歧杆菌的生长存在显著的促进作用[9]，后来研究发现奶瓶喂养婴儿的结肠菌群组成与成人非常相似，而如果在配方奶中添加异构化乳糖，这些婴儿的组成与母乳喂养婴儿相同[54]。随后在1964年，Hoffman等研究了异构化乳糖在肠道中的细菌代谢，证明了其是一种双歧杆菌促进因子[10]。后来的多个临床实验都验证了异构化乳糖对于成年人群可以起到益生元作用[55-57]。2013年Waston等的体外研究发现很多商业化的益生菌都可以利用异构化乳糖作为生长的碳源[12]。第二，异构化乳糖用于治疗便秘最早可追溯到上世纪60年底，1968年第一次报道了双盲实验中发现异构化乳糖可以治疗慢性便秘[47]。最新的临床研究发现异构化乳糖(3.3g/天)对于中国儿童的慢性便秘症状有改善，包括排便频率和大便硬度，腹部不适和胀气现象与对照组没有差异[48]。慢性便秘的青春期人群服用20ml×2次异构化乳糖可以显著提高排便次数，且复发率更低[49]。异构化乳糖对于孕妇[50-51]和老年人群[52]的便秘问题也有很明确的效果，而且异构化乳糖粉末与糖浆产品效果没有显著差异[53]。第三，异构化乳糖是目前唯一报道的有降低预防早产儿坏死性小肠结肠炎趋势的益生元。2010年Riskin等[11]进行了一项早产儿临床研究，实验结果显示给早产儿喂养添加1％(1g/每100mL喂养物)的异构化乳糖，有利于减少对肠道内喂养的不耐受，使早产儿能够更早出院回家，并倾向于更低的坏死性小肠结肠炎发生率。第四，异构化乳糖有助于矿物质吸收。在健康成年男性，分别补充300mg钙、150mg镁和异构化乳糖(0g/天、2g/天、4克/天)，分析尿液中的钙和镁，结果显示异构化乳糖可以改善钙和镁的吸收。但是异构化乳糖没有影响尿液中的骨吸收标记物[58]。在更年期女性，连续9天的早餐分别补充5g和10g异构化乳糖，结果显示异构化乳糖可以改善钙的吸收，且存在剂量依赖性，高剂量组效果更好[59]。第五，异构化乳糖可以治疗肝性脑病。1959年发现异构化乳糖是双歧因子的文章中提及异构化乳糖可能用于治疗肝性脑病[60]。临床研究证实了异构化乳糖治疗肝性脑病的有效性。后来取代了当时的标准治疗方法，对肝性脑病(HE)的治疗剂量范围高达90克/天，取决于严重程度[61]。每日30-60ml的异构化乳糖可改善肝性脑病患者的认知功能和健康相关的生活质量[62]。第六，异构化乳糖不能被肠道消化液降解，而且会有一部分直接渗透穿过肠壁，所以临床上也常把异构化乳糖用于评估肠道的透过性，安全无害[63]。临床观察发现服用异构化乳糖的人群腹膜炎风险较低[64]，这一结果写入了ISPD腹膜炎预防与治疗的建议[65]。第七，异构化乳糖可以减脂。在中年女性，补充300mg钙、150mg镁和4g异构化乳糖，在第12个月时，体脂比对照组低[66]。最后，还有一些研究报道关于异构化乳糖降低血脂[67-69]、预防婴幼儿湿疹[70]、预防女性阴道炎[71-72]和治疗(非伤寒)沙门氏菌携带者[73]的临床研究。

母乳中天然含有超过200种寡糖，其总浓度高于母乳中蛋白质的浓度，它们是一类人体无法直接吸收的物质，但是对于生命早期的肠道菌群建立有重要作用，成为近年来研究的热点。人类母乳中HMOs由5种单体组成：D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、L-岩藻糖(Fuc)和唾液酸(Sia)。这5种单体以不同比例结合，可构成母乳中上千种HMOs[2]。HMOs可分为中性人乳寡糖和酸性人乳寡糖。中性人乳寡糖是包含岩藻糖基的低聚糖，酸性人乳寡糖是包含唾液酸及其硫酸盐结构的低聚糖。人乳中中性人乳寡糖大约占70％，酸性人乳寡糖大约占30％。目前人们只鉴定出母乳中大约200种HMOs分子，其中，以中性的岩藻糖基化HMOs为主。而在牛奶和羊奶中的寡糖主要以酸性的唾液酸基化的HMOs为主。2'-岩藻糖基乳糖(2'Fucosyllactose，2'FL)是母乳中主要的中性HMOs分子之一，是人类乳汁中独特富含的物质[6]，而传统婴儿食品中尤其是婴儿配方粉产品中是缺乏这种营养素的。2'FL属于中性HMO，是大多数母乳中浓度最高的低聚糖之一。横向对比其他哺乳动物的乳汁，常见的家畜乳均几乎不含2'FL，牛乳和马乳中无法检出，绵羊和山羊乳浓度极低[74]；仅少数灵长动物及动物园的哺乳动物乳汁中有较高浓度的2'FL，Warren等分析13种哺乳动物的乳汁，结果显示，大猩猩乳汁的2'FL最接近母乳，浓度约为母乳的56％，其次是大灰熊，约为母乳的44％。黑熊和黑犀牛乳汁中的2'FL浓度约为母乳的12％，长颈鹿乳汁2'FL约为母乳的4％；狗的乳汁不含2'FL[75]，猴子乳汁亦无2'FL[76]。

现有研究支持2'FL的安全性和耐受性。在小猪模型进行3周的2'FL干预实验(29.30-298.99mg/kg/day)，没有不良反应[78]。用青春期大鼠模型评估2'FL(0-6000mg/kgbw/day)，也未见不良反应[77]。Reverri EJ等综述了目前进行的相关临床研究，认为将2'FL添加到婴儿配方奶粉中是安全的，代谢方式与母乳中的2'FL相似[79]。

2'FL的健康功效涉及很多方面。首先，2'FL对于婴儿出生后肠道菌群组成有重要的影响。Avershina等报道在出生后，双歧杆菌逐渐成为婴儿肠道的优势菌，出生后4月龄时达到最高峰，占总菌量的60％，而成人仅有大约2％[80]。Bunesova等从肯尼亚婴儿肠道分离出多种双歧杆菌菌株，而只有婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌等基因组序列中含有α-岩藻糖苷酶(α-fucosidases)可利用2'FL转化成1,2-PD，供肠道细胞利用[81]。2'FL可抑制肠道有害菌，与坏死性小肠结肠炎密切相关的肠杆菌不能消耗2'FL，6-唾液酸乳糖(6'-SL)和LNnT生长，但可利用低聚半乳糖(galactose oligosaccharides,GOS)生长[82]。短肠综合征动物模型进行盲肠切除术后的补充2'FL，能促进动物体重增加，和适应性的肠粘膜组织学改变[83]，改善症状。

第二，2'FL有抗感染的作用。母乳喂养的婴儿与配方奶粉喂养的婴儿相比，感染性疾病的发生率更低。Morrow等的临床研究发现母乳喂养婴儿中母乳α-1,2岩藻糖基化HMO(包含2'FL)总量更高与空肠弯曲杆菌感染导致的腹泻呈显著的负相关[84]。体外研究发现2'FL可以抑制空肠弯曲杆菌、肠致病性大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌与肠道表皮细胞的黏附，2'FL还能抑制绿脓杆菌与呼吸道上皮细胞的黏附[85]。通过先喂食抗生素再接种空肠杆菌的小鼠模型评价2'FL治疗急性肠道感染和免疫应答的影响，结果显示摄入2-FL可减少空肠杆菌定植和急性期粘膜免疫反应炎症信号分子的诱导50-60％[86]。体外实验发现，2'FL和3’FL能够竞争抑制诺如病毒降低感染风险[87]。2'FL显著降低呼吸道合胞体病毒感染呼吸道上皮细胞，调控细胞因子和炎症因子的表达[88]。

第三，2'FL有调节免疫的作用。Marriage等招募出生后5d的420名健康足月儿随机分为4组喂食不同奶粉，分别为对照组(2.4g/LGOS)、低剂量2'FL组(0.2g/L2'FL+2.2g/LGOS)、高剂量2'FL组(1g/L 2'FL+1.4g/LGOS)及母乳喂养对照组，经过4个月喂养后，四组婴儿生长发育没有差异。母乳喂养和2'FL的配方组的2'FL的吸收情况相似[89]。Goehring等检测受试婴儿6w时血液中的炎症因子，发现普通婴儿配方粉对照组的炎症因子IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高[90]。

革兰氏阴性菌引发的肠道感染大都通过脂多糖(Lipopolysaccharides)结合肠道表皮细胞的TLR4来激发炎症。2'FL可通过对TLR4上游调控因子CD14的mRNA转录和CD14的翻译和运输的抑制，减弱肠道IL-8的诱导表达，降低肠粘膜细胞的炎症反应，效果接近含有等浓度2'FL的人乳HMO[91]。作为肠道表面的主要抗原呈递细胞，树突状细胞的DC-SIGN也可以结合2'FL，推测是调节免疫活性的机制之一[92]。

第四，2'FL可以影响认知功能。饲喂350mg 2′-FL/kg 5周后，可以检测到啮齿动物海马体的长程增强效应增强，相应的认知行为实验表现更好。2'FL组动物脑部与新获得记忆储存有关的蛋白质表达增加[93]。大鼠在哺乳期补充饲喂1g/kg的2'FL，在断奶后(4-6周)的Morris水迷宫实验中2'FL组表现稍好。到1岁时，2'FL组的成年大鼠在新的物体识别和Y迷宫模型中的表现仍然更好。所以2'FL既有短期效果也有长期的作用，脑部LTP的强度和持续时间均高于对照[94]。体外研究也发现L-岩藻糖和2'FL可增加大鼠海马电生理信号指数增强[95]。进一步的动物实验发现，脑肠轴在2'FL介导的认知益处中起关键作用，迷走神经切断术会抑制口服2'FL对LTP和学习认知的作用[96]。

第五，2'FL可以影响过敏。Castillo-Courtade等在卵清蛋白刺激的小鼠食物过敏模型中，评估发现饲喂2'FL的小鼠过敏的反应更轻，更少肠道肥大细胞的数量、Peyer’s淋巴结的CD4+CD25+IL-10+细胞数量[97]。

母乳中不但含有丰富的寡糖物质，还含有活的微生物菌群。对于母乳喂养儿，母乳微生态是婴儿肠道微生态发育的关键影响因素。在生命早期，母乳喂养儿的肠道微生态中丰度最高的是双歧杆菌。更进一步的微生物分析检测发现母乳喂养婴儿肠道菌群不同于成人，富含婴儿双歧杆菌。已有研究显示婴儿双歧杆菌的功效作用主要包括以下几个方面：

首先，婴儿双歧杆菌利用HMO的能力强，在肠道定植有优势，与其他双歧杆菌不同，婴儿双歧杆菌的基因组中包含更广泛的与HMO转运和代谢相关的基因[13-19]，在体外研究中，婴儿双歧杆菌在HMO存在下比其他菌株生长更好[19,25]，所以婴儿双歧杆菌菌株具有超越其他常规益生菌的独特优势。婴儿双歧杆菌还能代谢产生的短链脂肪酸可以减少肠道病原体，促进肠道表皮细胞的生长与发育成熟[36]。短链脂肪酸常见的有乙酸、丙酸、丁酸和乳酸，除了作为能量物质被肠道细胞吸收，有利肠道表皮细胞的完整性[42]，还有其他不同的健康功效。

其次，婴儿双歧杆菌具有抗炎的作用，早产儿肠道炎症是降低早产儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的重要诱因。以肠细胞为模型的研究发现婴儿双歧杆菌可以诱发肠细胞表达抗炎的细胞因子[20-23]，大鼠动物实验发现婴儿双歧杆菌的添加可以降低NEC的炎症[24]。在早产儿肠道中往往缺乏双歧杆菌[26]，母乳喂养的早产儿中NEC的发生率明显低于配方喂养婴儿[27]。不同于足月儿的母乳，早产儿母乳中含有更高浓度的岩藻糖基化HMO[28]。对比在早产儿人群中添加婴儿双歧杆菌和乳双歧杆菌的喂养效果，结果发现不论配方粉喂养还是母乳喂养，婴儿双歧杆菌的定植能力都比乳双歧杆菌更强，而粪便双歧杆菌数量最高的是母乳喂养儿添加婴儿双歧杆菌的组[29]。已有一系列临床研究发现给早产儿补充婴儿双歧杆菌可以降低NEC的发生风险[31-35]。

最后，添加婴儿双歧杆菌的优势还体现在免疫力方面，孟加拉的一项足月儿临床研究中发现，在生命早期的四个月中婴儿肠道的婴儿双枝杆菌数量与疫苗反应呈正相关，也就是婴儿双枝杆菌数量越高疫苗反应对应的指数越高[30-31]，在出生后2年这种趋势仍然存在[31]，推测婴儿双歧杆菌有助于激活免疫功能和免疫记忆功能。

然而，虽然婴儿双歧杆菌具有上述多方面的功能，但是本领域仍然缺少一种能够有效促进婴儿双歧杆菌增殖的婴幼儿食品。

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发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种益生元组合物，该益生元组合物具有促进婴儿双歧杆菌增殖生长的作用。

本发明的目的还在于提供含有上述益生元组合物的营养组合物及食品。

为达到上述目的，本发明提供了一种益生元组合物，其包括异构化乳糖(LOS)与2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)，二者的质量比为1：10-10：1，例如10：1、4：1、1：1、1：4或1：10。在LOS与2'FL的质量比在1：10-10：1的培养基中，长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长的OD

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述益生元组合物中，所述LOS与2'FL的质量比为1：10-4：1。更优选为1：4-4：1，例如1：4或4：1。在LOS与2'FL的质量比在1：10-4：1的范围之内的培养基中，长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长的OD

根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述益生元组合物中，所述LOS与2'FL的质量比为4：1。在LOS与2'FL的质量比控制在4：1的培养基中，长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长的pH值低于其在单独含有LOS的培养基中生长的pH值、显著低于其在单独含有2'FL的培养基中生长的pH值；同时，其OD

根据本发明的具体实施方案，上述LOS与2'FL的质量比范围中的具体质量比可以为1：10、1：4、1：1、4：1、10：1等，例如1：10-4：1的质量比范围包括的具体质量比包括1：10、1：4、1：1、4：1等。

根据本发明的具体实施方案，优选地，上述益生元组合物还含有长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496。

根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中，所述长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496为保藏编号CCTCC No.M2011122的长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072；保藏日期：2011年04月10日；保藏编号：CCTCC NO：M2011122，分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)。

长双歧杆菌婴儿亚种CCTCC No.M2011122具有较佳的自由基清除能力以及还原能力，且能诱发Caco-2细胞增加抗氧化酶的表达，因此，本发明的长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496菌株具有抗氧化的活性效果，且能够减少自由基浓度，以抑制器官老化。

本发明的益生元组合物可以通过将LOS与2'FL直接混合的方式制备，当含有长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496，可以采用常规方式予以添加。

本发明还提供了一种营养组合物，其包含上述益生元组合物。该营养组合物还可以含有其他食品或药物中允许添加的原料、辅料、添加剂。在制备该营养组合物时，益生元组合物可以直接与其他原料、辅料、添加剂混合。

本发明还提供了一种食品，其包含上述益生元组合物和/或上述营养组合物。该食品可以是小儿食品或老年人食品。根据本发明的具体实施方案，上述食品可以包括奶粉、辅食、饮料等中的一种或两种以上的组合，其中还可以含有其他允许添加的原料、辅料、添加剂。

本发明还提供了一种药物，其包含上述益生元组合物和/或上述营养组合物。该药物中还可以含有其他允许添加的原料、辅料、添加剂。

本发明还提供了上述益生元组合物在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长中的应用，尤其是在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的定植、增殖中的应用。

本发明还提供了上述营养组合物在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长中的应用，尤其是在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的定植、增殖中的应用。

婴儿双歧杆菌是一类婴儿肠道中最早的定植菌，寻找有效的益生元增效组合增效的促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496的增殖，对于长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496的肠道定植以及进一步发挥其他功效非常重要。本发明研究发现2'FL与LOS在特定组合比例下能够显著促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496的增殖，显著高于等量的单一益生元。

附图说明

图1为不同质量比的LOS、2'FL组合与单纯使用2'FL、LOS在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长方面的显著性差异分析结果。

图2为不同质量比的LOS、2'FL组合与单纯使用2'FL、LOS在pH值方面的显著性差异分析结果。

用于专利程序的微生物保藏：

本发明的YLGB-1496菌株(曾命名：GB-1496菌株)

保藏日期：2011年04月10日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072

保藏编号：CCTCC NO：M2011122

分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

本发明的长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496来源为人类母乳，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072；保藏日期：2011年04月10日；保藏编号：CCTCC NO：M2011122，分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)。

根据16S rDNA序列分析以及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在形态学及一般性质上的特征详细列于表1。

表1

长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496菌株是以含有20％甘油的MRS培养基保存于-80℃。使用前，以含有0.05％L-cysteine的MRS broth(DIFCO)，37℃下活化(24小时)二次后使用。

实验例

使长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496分别在7种1％MRS+0.05％半胱氨酸的培养基中生长，测定它们的生长情况和短链脂肪酸代谢情况。其中，MRS的组成如表2所示。

表2

实验结果的显著性差异分析结果如图1、图2所示，其中，#表示与单纯使用2'FL的差异，*表示与单纯使用LOS的差异，###代表p<0.001；####代表p<0.0001；*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001。

图1为不同质量比的LOS、2'FL组合与单纯使用2'FL、LOS在促进长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496生长方面的显著性差异分析结果。

图2为不同质量比的LOS、2'FL组合与单纯使用2'FL、LOS在pH值方面的显著性差异分析结果。

由表2、图1、图2可以看出：在培养48小时后，长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在LOS：2'FL＝1：10、1：4、1：1、4：1、10：1的培养基中生长情况均较好；其中：

在LOS：2'FL＝1：10、1：4、1：1、4：1、10：1的培养基中，YLGB-1496相应的OD

在LOS：2'FL＝1：10、1：4、1：1、4：1的培养基中，YLGB-1496相应的OD

以上结果说明LOS与2'FL的组合对于YLGB-1496的生长具有一定的增效效果。

同时，在LOS：2'FL＝1：10、1：4、1：1、4：1、10：1的培养基中，YLGB-1496相应的pH值均显著低于在含LOS和2'FL培养基中生长的pH值，这说明在上述比例下，LOS与2'FL的组合能够显著促进短链脂肪酸的代谢。

实施例1

本实施例提供了一组益生元组合物，其分别含有质量比为1：10、1：4、1：1、4：1、10：1的LOS与2'FL。

实施例2

本实施例提供了一组益生元组合物，其分别含有质量比为1：10、1：4、1：1、4：1、10：1的LOS与2'FL，以及长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496。该营养组合物对于长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的生长、增殖具有显著优于单独的2'FL的促进作用。

实施例3

本实施例提供了一组营养组合物，其分别含有实施例1或实施例2所提供的各益生元组合物。该营养组合物对于长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的生长、增殖具有显著优于单独的2'FL的促进作用。

实施例4

本实施例提供了一组营养组合物，其含有质量比为1：4或4：1的LOS与2'FL。该营养组合物对于长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的生长、增殖具有显著优于单独的LOS和单独的2'FL的促进作用。

实施例5

本实施例提供了一组小儿食品，其分别含有实施例1或实施例2提供的益生元组合物、实施例3提供的营养组合物和实施例4提供的营养组合物中的一种或两种以上的组合，其中，上述益生元组合物、营养组合物可以单独添加，也可以任意组合并以任意的比例添加。该食品可以是小儿食品或老年人食品，例如奶粉、饮料、婴幼儿辅食等。

该食品对于长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的生长、增殖具有显著优于单独的LOS和单独的2'FL的促进作用。

实施例6

本实施例提供了一组药物，其分别含有实施例1或实施例2提供的益生元组合物、实施例3提供的营养组合物和实施例4提供的营养组合物中的一种或两种以上的组合，其中，上述益生元组合物、营养组合物可以单独添加，也可以任意组合并以任意的比例添加。

该药物对于长双歧杆菌婴儿亚种YLGB-1496在肠道中的生长、增殖具有显著优于单独的LOS和单独的2'FL的促进作用。