一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于体外基因检测技术领域，具体涉及一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

SARS-CoV与SARS-CoV-2(COVID-19)分别引起传染性非典型肺炎和严重急性呼吸综合征两种不同传染病。两种病毒均属于β属B亚群冠状病毒，形态上多以椭圆形或球形的单链RNA病毒，且其具体基因结构有明显差异。根据现有研究结果表明SARS-CoV与SARS-CoV-2两种病毒的氨基酸同源性仅为76％左右，但都通过细胞受体血管紧张素转化酶II(ACE2)对宿主细胞进行入侵。因此推测两种病毒可能具有类似的致病机理。除此之外，其余四种人源冠状病毒分别为人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)和人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，仅能引起轻微上呼吸道症状，故受到关注度较为有限。MERS-CoV是一种β属C亚群冠状病毒，全名中东呼吸综合征冠状病毒，引发中东呼吸综合征导致严重的呼吸系统相关疾病。虽然对于新发传染病开展的各项研究工作十分重要，可以给疫苗设计以及药物靶点带来十分重要的证据参考，但对于这类新发传染病诊断方法的研究同样重要。

目前对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2的检测方法主要基于核酸检测法为主。核酸检测法是针对病毒RNA基因序列中的保守序列设计引物进行检测，包括基因测序(Singer测序)、荧光定量PCR、微滴式数字PCR(ddPCR)、基因芯片和环介导等温扩增(LAMP)等检测技术。但是相关技术表明，基因测序技术具有高敏感性、高准确性的优势，但是仪器成本较高，依赖专业人士对序列的解读分析，且检测时间较长，目前还未适用于大规模检测。荧光定量PCR具有优异的灵敏度和特异性，但也存在仪器昂贵，需要专业人士对结果进行分析，检测成本较高等不足。微滴式数字PCR技术具有绝对定量和高灵敏度的优势，由于这些优势大大降低了假阴性风险，提高检测的准确性。但该技术依赖于昂贵的仪器，成本较高，因此较难大规模普及。环介导等温扩增技术虽然灵敏度高、不需要特殊仪器，但实验过程中由于开盖造成的气溶胶污染，以及部分实验室功能分区不明确等，导致假阳性问题影响结果判断；并且该方法对引物设计要求较高，从而限制某些靶基因不适宜此法。基因芯片通过不同探针阵列、使用特定分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值。目前基于基因芯片使用固相主要为聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜、玻片等)，在其表面对核酸探针或cDNA片段进行固化，再使用经由同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测成像。该方法具有所需检测设备与目前分子生物学采用基于放射显影技术相同。但其不足为同位素标记检测需要专用仪器进行读数，且读数结果也依赖专业人员进行处理分析，且对冠状病毒的检测效果不好。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测冠状病毒的引物探针组合。

本发明还提出一种上述引物探针组合在制备基因芯片中的应用。

本发明还提出一种上述引物探针组合在制备冠状病毒检测的试剂盒中的应用。

本发明还提出一种检测冠状病毒的试剂盒。

本发明还提出一种检测冠状病毒的方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种检测冠状病毒的引物探针组合，所述引物探针组合，包括：

用于检测冠状病毒SARS-CoV的引物探针组合，包括检测ORF1ab基因的第一引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的第一反向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的第一探针和/或检测RdRp基因的第二引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物、核苷酸序列如SEQID NO.4所示的第二反向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的第二探针；

用于检测冠状病毒MERS-CoV的引物探针组合，包括检测ORF1ab基因的第三引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第三正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第三反向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的第三探针和/或用于检测N2基因的第四引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的第四正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的第四反向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的第四探针；

用于检测冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组合，包括检测ORF1ab基因的第五引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的第五正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第五反向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的第五探针和/或检测E基因的第六引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的第六正向引物、核苷酸序列如SEQID NO.12所示的第六反向引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的第六探针。

在本发明的一些实施方式中，所述引物探针组合还包括阳性指示探针和阳性指示上样探针。

在本发明的一些实施方式中，所述引物探针组合还包括核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示的阳性指示探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的阳性指示上样探针。

阳性指示探针可以阳性指示上样探针进行配对，杂交，显示信号。阳性指示探针与阳性指示上样探针的作用是提示扩增的片段在芯片上进行杂交、显色都是成功的，过程及试剂组分都没有失效，能够正产工作，产生信号。所述阳性指示探针与阳性指示上样探针均为一段随机序列，长度在30-40bp之间，与ORF1ab基因、N2基因、RdRp基因和E基因无同源性序列。

根据本发明的第二方面，本申请提供一种上述的引物探针组合的应用，所述应用为在制备用于冠状病毒检测的芯片中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于冠状病毒检测的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒为SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2中的一种或多种。

根据本发明的第三方面，本申请提供一种用于冠状病毒检测的试剂盒，包括上述引物探针组合或上述基因芯片。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括Streptavidin-HRP孵育液、TMB双组分显色液、膜封闭液、杂交缓冲液和洗涤液中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述基因芯片包括生物传感器及固定在生物传感器上的检测探针。

在本发明的一些实施方式中，所述检测探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13-18所示的检测探针序列。

在本发明的一些实施方式中，所述基因芯片上还包括阳性指示探针和阳性指示上样探针。

在本发明的一些实施方式中，上述基因芯片的制备方法包括以下步骤：使用微阵列芯片点样系统，将探针点样在微阵列芯片点样系统上，经紫外处理后制得基因芯片。

在本发明的一些实施方式中，所述探针包括特异性探针和阳性指示探针，所述特异性探针的浓度为100-300ng/μL；所述阳性指示探针的浓度为5-15μM。

在本发明的一些实施方式中，膜封闭液包括1-8％的脱脂奶粉溶液。

在本发明的一些实施方式中，洗涤液包括洗涤液I：1×SSC 0.1％SDS；洗涤液II：0.2×SSC 0.1％SDS；洗涤液III：0.2×SSC。

根据本发明的第四方面，本申请提供一种检测冠状病毒的方法，包括以下步骤：利用上述的试剂盒对待测核酸样品进行检测。

根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：利用本申请的引物探针组合能够准确的对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的基因片段进行检测；且本申请的试剂盒能同步检测3种冠状病毒，特异性、稳定性良好，批间批内变异系数CV值均低于15％。表明该方法对于实现可视化、高通量、平行化检测，及结果快速、准确，阅读方便性能稳定。采用本申请的试剂盒进行冠状病毒的检测具有快速精准的特点，在制备病原检测、进出口检疫、流行病学分析等方面具有广阔的前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的寡核苷酸可视化基因芯片工作原理图；

图2为本发明实施例1中的基因芯片阵列图，其中，A为阳性指示探针；B为SARS-CoV-2-ORF-1ab检测探针；C为SARS-coV-2-E检测探针；D为MERS-coV2-ORF1b检测探针；E为MERS-CoV-N检测探针；F为SARS-CoV-ORF1ab检测探针；G为SARS-CoV-RdRp检测探针；

图3为本发明实施例2中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图4为本发明方案测试例中的引物筛选结果图；

图5为本发明方案测试例中的引物筛选结果图；

图6为本发明方案测试例中的寡核苷酸探针筛选结果图；

图7为本发明方案测试例中的寡核苷酸探针筛选结果图；

图8为本发明方案测试例中的寡核苷酸探针筛选结果图；

图9为本发明方案测试例中的寡核苷酸探针筛选结果图；

图10为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图11为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图12为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图13为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图14为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图15为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图16为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图17为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图；

图18为本发明测试例中的检测冠状病毒的结果图；其中，图A为检测SARS-coV-2病毒的结果图；图B为检测MERS-CoV病毒结果图；图C为SARS-coV病毒检测结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1一种SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2联合共检可视化基因芯片

本实施例制备了一种SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2联合共检可视化基因芯片，寡核苷酸可视化基因芯片工作原理如图1所示，具体过程为：

1、特异性引物的设计

根据GenBank数据库上公布SARS-CoV-ORF-1b、SARS-CoV-RdRp、MERS-CoV-ORF-1b、MERS-CoV-N2、SARS-CoV-2-ORF-1ab、SARS-CoV-2-E基因的保守序列，其中，SARS-CoV-ORF-1b的基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO.21所示，SARS-CoV-RdRp的基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO.22所示，MERS-CoV-ORF-1b的基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO.23所示，MERS-CoV-N2的基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO.24所示，SARS-CoV-2-ORF1ab的基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO.25所示，SARS-CoV-2-E的基因序列如核苷酸序列SEQ ID NO.26所示，分别设计特异性引物，并在上游引物5’端添加生物素标记。引物核苷酸序列如表1所示。

表1

2、寡核苷酸探针的设计

根据GenBank数据库中已有数据筛选标准参考毒株SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2基因序列，针对SARS-CoV-ORF-1b、SARS-CoV-RdRp、MERS-CoV-ORF-1b、、MERS-CoV-N2、SARS-CoV-2-ORF-1ab、SARS-CoV-2-E保守基因序列设计特异性寡核苷酸探针、阳性指示探针和阳性指示上样探针并交由生工生物工程(上海)有限公司进行合成，寡核苷酸探针(特异性核酸探针)、阳性指示探针和阳性指示上样探针的核苷酸序列如表2所示。

表2

3、基因芯片的制备

(1)分别将表2所示的特异性探针与阳性指示探针与点样缓冲液充分混合，分别稀释到终浓度为200ng/μL与10μM；

(2)使用微阵列芯片点样系统，设计芯片阵列，在尼龙膜上喷点1μL探针稀释液，置于紫外灯照射交联30min；

(3)将处理后的芯片密封，4℃保存。设计的基因芯片阵列如图2所示。

实施例2

一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括实施例1中的基因芯片、Streptavidin-HRP孵育液、TMB双组分显色液、膜封闭液、杂交缓冲液和洗涤液。

膜封闭液为：5％的脱脂奶粉溶液。

洗涤液包括洗涤液I：1×SSC 0.1％SDS；洗涤液II：0.2×SSC 0.1％SDS；洗涤液III：0.2×SSC。

该试剂盒的使用方法为：

(1)待测核酸样品PCR扩增

以市购核酸样品作为模板，分别使用表1所述引物进行PCR扩增，扩增体系如表3所示。

表3 PCR扩增反应体系

执行反应程序：95℃，3min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，40s，40cycles；72℃，10min。

(2)PCR产物杂交

将所有制备完成的待检样品的PCR扩增产物置于PCR仪中95℃变性10min后立即冰浴冷却5min，迅速用移液枪将PCR产物以及阳性指示上样探针混合均匀并加样至各探针区域，待整个基因芯片润透后将杂交缓冲液加入平皿中覆盖住基因芯片；将平皿放在湿盒内并置于水平摇床上20rpm摇动，在65℃下杂交30min。杂交完成后在室温下，放置水平脱色摇床100rpm摇动，依次用洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III中各洗涤3次，每次3min，洗涤液用量以覆盖住基因芯片为准，每次洗涤结束吸除洗涤液。

(3)封闭

向干燥完成的基因芯片中加入膜封闭液，用量为洗涤液用量的2倍，放置水平脱色摇床70rpm封闭30min。结束后吸弃封闭液。

(4)酶联

避光条件下加入streptavidin-HRP(0.2M PBS buffer按1：2000倍稀释)孵育液，37℃下20rpm孵育30min后弃酶联液。重复步骤(2)产物杂交加入洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III洗涤过程。

(5)显色

将TMB双组份显色系统A液与B液等体积混合为工作液，加入芯片预设位点，使得工作液覆盖住芯片，显色1-2min即可观察(显色时间超过2min则表示结果不可信)。

(6)结果判断：

①当A探针处出现较深蓝色斑点则表明该基因芯片工作正常；

②当B、C探针处出现较深蓝色斑点则表明待检样品中存在SARS-CoV-2核酸；

③当D、E探针处出现较深蓝色斑点则表明待检样品中存在MERS-CoV核酸；

④当F、G探针处出现较深蓝色斑点则表明待检样品中存在SARS-CoV核酸；

⑤当上述检测探针处出现淡蓝色或不显色则表明待检样品中不存在上述病毒核酸或核酸量低于该基因芯片的最低检测值。

实验结果如图3所示，从图中可以看出，本发明方案制备的基因芯片可以实现同步检测SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2三种冠状病毒，检测效果稳定性好，特异性高。

测试例1引物核苷酸序列的筛选

根据GenBank数据库上公布SARS-CoV-ORF-1b、SARS-CoV-RdRp、MERS-CoV-ORF-1b、MERS-CoV-N2、SARS-CoV-2-ORF-1ab、SARS-CoV-2-E基因的保守序列，分别设计特异性引物，并在上游引物5’端添加生物素标记。

1、SARS-CoV-ORF-1b特异性引物的筛选

SARS-CoV-ORF-1b特异性引物核苷酸序列如表4所示。

2、SARS-CoV-RdRp基因特异性引物的筛选

SARS-CoV-RdRp特异性引物核苷酸序列如表5所示。

表5

3、MERS-CoV-ORF1b基因特异性引物的筛选

MERS-CoV-ORF1b特异性引物核苷酸序列如表6所示。

表6

4、MERS-CoV-N2基因特异性引物的筛选

MERS-CoV-N2基因的特异性引物核苷酸序列如表7所示。

表7

5、SARS-CoV-2-ORF1ab基因特异性引物的筛选

SARS-CoV-2-ORF1ab基因的特异性引物核苷酸序列如表8所示。

表8

6、SARS-CoV-2-E-F基因特异性引物的筛选

SARS-CoV-2-E-F基因的特异性引物核苷酸序列如表9所示。

表9

实验方法与实施例2中的试剂盒的使用方法的区别仅在于引物不同，实验结果如图3-图5所示，图3为采用SEQ ID NO.1-12所示的引物核苷酸序列扩增得到的3种冠状病毒的PCR扩增产物使用实施例1制备得到的基因芯片进行检测得到的实验结果图，图4-图5为筛选采用的特异性引物核苷酸序列扩增得到的3种冠状病毒的PCR扩增产物，使用实施例1制备得到的基因芯片进行检测得到的实验结果图，从图中可以看出，本发明方案所采用的引物组合物具有高特异性。

测试例2寡核苷酸探针序列的筛选

根据GenBank数据库中已有数据筛选标准参考毒株SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2基因序列，针对SARS-CoV-ORF-1b、SARS-CoV-RdRp、MERS-CoV-ORF-1b、、MERS-CoV-N2、SARS-CoV-2-ORF-1ab、SARS-CoV-2-E保守基因序列设计特异性寡核苷酸探针、阳性指示探针和阳性指示上样探针并交由上海生工生物工程有限公司进行合成。

1、SARS-ORF-1b寡核苷酸探针序列的筛选

SARS-ORF-1b基因的寡核苷酸探针核苷酸序列如表10所示。

表10

2、SARS-RdRp基因寡核苷酸探针序列的筛选

SARS-RdRp基因的寡核苷酸探针核苷酸序列如表11所示。

表11

3、MERS-CoV-ORF-1b基因寡核苷酸探针序列的筛选

MERS-CoV-ORF-1b基因的寡核苷酸探针核苷酸序列如表12所示。

表12

4、MERS-N2基因寡核苷酸探针序列的筛选

MERS-N2基因的寡核苷酸探针核苷酸序列如表13所示。

表13

5、SARS-CoV-2-ORF-1ab基因寡核苷酸探针序列的筛选

SARS-CoV-2-ORF-1ab基因的寡核苷酸探针核苷酸序列如表14所示。

表14

6、SARS-CoV-2-E基因寡核苷酸探针序列的筛选

SARS-CoV-2-E基因的寡核苷酸探针核苷酸序列如表15所示。

表15

实验方法与实施例2的区别仅在于采用寡核酸探针制备的基因芯片不同，实验结果如图3和图6-9所示，图3为采用SEQ ID NO.13-18所示的寡核苷酸探针序列制备的基因芯片检测得到的3种冠状病毒的实验结果图；图6-9为筛选采用的寡核苷酸探针序列制备的基因芯片进行检测得到的3种冠状病毒的实验结果图，从图中可以看出，设计探针并非容易的事情，本发明方案制备的探针特异性高，检测效果好。

3、重复性检测

采用本发明实施例2中所制得的试剂盒对同一份待测样本(包括SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2病毒核酸)重复测试9次，结果如图10-18所示，从图中可以看出，本申请的试剂盒能同步检测3种冠状病毒，特异性、稳定性良好，批间批内变异系数CV值均低于15％，符合变异系数CV≤15％的要求，证实将本发明所制得的冠状病毒检测试剂盒用于实际检测时具备良好的重复性。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actatgtctt tactggttac cgt 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagcagttg tttctggcaa t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<210> 9

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 14

<211> 210

<212> DNA

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<400> 14

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<210> 15

<211> 197

<212> DNA

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<210> 16

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgacgagtg gcggacgggt gagtattttt tttttttttt 40

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tactcacccg tccgccactc gtcag 25

<210> 21

<211> 1360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cttttcgcag cagaaacgct caaagccact gaggaaacat ttaagctgtc atatggtatt 60

gctactgtac gcgaagtact ctctgacaga gaattgcatc tttcatggga ggttggaaaa 120

cctagaccac cattgaacag aaactatgtc tttactggtt accgtgtaac taaaaatagt 180

aaagtacaga ttggagagta cacctttgaa aaaggtgact atggtgatgc tgttgtgtac 240

agaggtacta cgacatacaa gttgaatgtt ggtgattact ttgtgttgac atctcacact 300

gtaatgccac ttagtgcacc tactctagtg ccacaagagc actatgtgag aattactggc 360

ttgtacccaa cactcaacat ctcagatgag ttttctagca atgttgcaaa ttatcaaaag 420

gtcggcatgc aaaagtactc tacactccaa ggaccacctg gtactggtaa gagtcatttt 480

gccatcggac ttgctctcta ttacccatct gctcgcatag tgtatacggc atgctctcat 540

gcagctgttg atgccctatg tgaaaaggca ttaaaatatt tgcccataga taaatgtagt 600

agaatcatac ctgcgcgtgc gcgcgtagag tgttttgata aattcaaagt gaattcaaca 660

ctagaacagt atgttttctg cactgtaaat gcattgccag aaacaactgc tgacattgta 720

gtctttgatg aaatctctat ggctactaat tatgacttga gtgttgtcaa tgctagactt 780

cgtgcaaaac actacgtcta tattggcgat cctgctcaat taccagcccc ccgcacattg 840

ctgactaaag gcacactaga accagaatat tttaattcag tgtgcagact tatgaaaaca 900

ataggtccag acatgttcct tggaacttgt cgccgttgtc ctgctgaaat tgttgacact 960

gtgagtgctt tagtttatga caataagcta aaagcacaca aggataagtc agctcaatgc 1020

ttcaaaatgt tctacaaagg tgttattaca catgatgttt catctgcaat caacagacct 1080

caaataggcg ttgtaagaga atttcttaca cgcaatcctg cttggagaaa agctgttttt 1140

atctcacctt ataattcaca gaacgctgta gcttcaaaaa tcttaggatt gcctacgcag 1200

actgttgatt catcacaggg ttctgaatat gactatgtca tattcacaca aactactgaa 1260

acagcacact cttgtaatgt caaccgcttc aatgtggcta tcacaagggc aaaaattggc 1320

attttgtgca taatgtctga tagagatctt tatgacaaac 1360

<210> 22

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagagccatg cctaacatgc ttaggataat ggcctctctt gttcttgctc gcaaacatag 60

cacttgctgc aacttatcac accgtttcta taggttagct aacgagtgtg cgcaagtatt 120

aagtgagatg gtcatgtgtg gcggctcact atatgttaaa ccaggtggaa catcatcagg 180

tgatgctaca actgcttatg ctaatagtgt ttttaatatt tgtcaagctg ttacagctaa 240

tgtaaacgca cttctctcag ctgatggtaa taagatagct gacaagtatg tccgcaatct 300

acaacacaga ctttacgagt gtctctacag aaatagggat gtagatcatg aattcgtgga 360

tgaattttac gcatatttgc gcaaacattt ttctatgatg at 402

<210> 23

<211> 1520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

actgttgatt cctcacaggg ttcagaatac cagtacgtta tcttctgtca aacagcagat 60

acggcacatg ctaacaacat taacagattt aatgttgcaa tcactcgtgc ccaaaaaggt 120

attctttgtg ttatgacatc tcaggcactc tttgagtcct tagagtttac tgaattgtct 180

tttactaatt acaagctcca gtctcagatt gtaactggcc tttttaaaga ttgctctaga 240

gaaacttctg gcctctcacc tgcttatgca ccaacatacg ttagtgttga tgacaagtat 300

aagacgagtg atgagctttg cgtgaatctt aatttacccg caaatatccc atactctcgt 360

gttatttcca ggatgggctt taaactcgat gcaacagttc ctggatatcc taagcttttc 420

attactcgtg aagaggctgt aaggcaagtt cgaagctgga taggcttcga tgttgagggt 480

gctcatgctt cccgtaatgc atgtggcacc aatgtgcctc tacaattagg attttcaact 540

ggtgtgaact ttgttgttca gccagttggt gttgtagaca ctgagtgggg taacatgtta 600

acgggcattg ctgcccgtcc tccaccaggt gaacagttta agcacctcgt gcctcttatg 660

cataaggggg ctgcgtggcc tattgttaga cgacgtatag tgcaaatgtt gtcagacact 720

ttagacaaat tgtctgatta ctgtacgttt gtttgttggg ctcatggctt tgaattaacg 780

tctgcatcat acttttgcaa gataggtaag gaacagaagt gttgcatgtg caatagacgc 840

gctgcagcgt actcttcacc tctgcaatct tatgcctgct ggactcattc ctgcggttat 900

gattatgtct acaacccttt ctttgtcgat gttcaacagt ggggttatgt aggcaatctt 960

gctactaatc acgatcgtta ttgctctgtc catcaaggag ctcatgtggc ttctaatgat 1020

gcaataatga ctcgttgttt agctattcat tcttgtttta tagaacgtgt ggattgggat 1080

atagagtatc cttatatctc acatgaaaag aaattgaatt cctgttgtag aatcgttgag 1140

cgcaacgtcg tacgtgctgc tcttcttgcc ggttcatttg acaaagtcta tgatattggc 1200

aatcctaaag gaattcctat tgttgatgac cctgtggttg attggcatta ttttgatgca 1260

cagcccttga ccagaaaggt acaacagctt ttctatacag aggacatggc ctcaagattt 1320

gctgatgggc tctgcttatt ttggaactgt aatgtaccaa aatatcctaa taatgcaatt 1380

gtatgcaggt ttgacacacg tgtgcattct gagttcaatt tgccaggttg tgatggcggt 1440

agtttgtatg ttaacaagca cgcttttcat acaccagcat atgatgtgag tgcattccgt 1500

gatctgaaac ctttaccatt 1520

<210> 24

<211> 920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

accagtgtaa ctgctgttgt aaccaatggt cacctcaaaa tggctggcat gcatttcggt 60

gcttgtgact acgacagact tcctaatgaa gtcaccgtgg ccaaacccaa tgtgctgatt 120

gctttaaaaa tggtgaagcg gcaaagctac ggaactaatt ccggcgttgc catttaccat 180

agatataagg caggtaatta caggagtccg cctattacgg cggatattga acttgcattg 240

cttcgagctt aggctcttta gtaagagtat cttaattgat tttaacgaat ctcaatttca 300

ttgttatggc atcccctgct gcacctcgtg ctgtttcctt tgccgataac aatgatataa 360

caaatacaaa cctgtctcga ggtagaggac gtaatccaaa accacgagct gcaccaaata 420

acactgtctc ttggtacact gggcttaccc aacacgggaa agtccctctt acctttccac 480

ctgggcaggg tgtacctctt aatgccaatt ccacccctgc gcaaaatgct gggtattggc 540

ggagacagga cagaaaaatt aataccggga atggaattaa gcaactggct cccaggtggt 600

acttctacta cactggaact ggacccgaag cagcactccc attccgggct gttaaggatg 660

gcatcgtttg ggtccatgaa gatggcgcca ctgatgctcc ttcaactttt gggacgcgga 720

accctaacaa tgattcagct attgttacac aattcgcgcc cggtactaag cttcctaaaa 780

acttccacat tgaggggact ggaggcaata gtcaatcatc ttcaagagcc tctagcgtaa 840

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<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cattgtggga aatccaacag gttgtagatg cagatagtaa aattgttcaa cttagtgaaa 60

ttagtatgga caattcacct aatttagcat ggcctcttat tgtaacagct ttaagggcca 120

attctgctgt caaattacag aataatgagc ttagtcctgt tgcactacga cagatgtctt 180

gtgctgccgg tactacacaa actgcttgca ctgatgacaa tgcgttagct tactacaaca 240

caacaaaggg aggtaggttt gtacttgcac tgttatccga tttacaggat ttgaaatggg 300

ctagattccc taagagtgat ggaactggta ctatctatac agaactggaa ccaccttgta 360

ggtttgttac agacacacct aaaggtccta aagtgaagta tttatacttt attaaaggat 420

taaacaacct aaatagaggt atggtacttg gtagtttagc tgccacagta cgtctacaag 480

ctggtaatgc aacagaagtg cctgccaatt caactgtatt atctttctgt gcttttgctg 540

tagatgctgc taaagcttac aaagattatc tagctagtgg gggacaacca atcactaatt 600

gtgttaagat gttgtgtaca cacactggta ctggtcaggc aataacagtt acaccggaag 660

ccaatatgga tcaagaatcc tttggtggtg catcgtgttg tctgtactgc cgttgccaca 720

tagatcatcc aaatcctaaa ggattttgtg acttaaaagg taagtatgta caaataccta 780

caacttgtgc taatgaccct gtgggtttta cacttaaaaa cacagtctgt accgtctgcg 840

gtatgtggaa aggttatggc tgtagttgtg atcaactccg cgaacccatg cttcagtcag 900

ctgatgcaca atcgttttta aaccgggttt gcggtgtaag tgcagcccgt cttacaccgt 960

<210> 26

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60

cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120

gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180

cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228