一种干细胞培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞培养基技术领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其制备方法。

背景技术

干细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。因此采用的基础培养基常常要添加血清，如马血清或胎牛血清；因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本身血清中还富含有丝分裂因子，也利于细胞系和原代培养。

但血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。尤其是在干细胞培养的过程中，血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，其中复杂的蛋白和多重的细胞因子，会导致本身就容易分化的干细胞生出多种完全不同的细胞表型，而产生多种完全不同的细胞分化趋势，也给细胞培养表达产品分离纯化和结果的重复性带来很大的困难。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种干细胞培养基及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种干细胞培养基，包括基质培养基与添加剂，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向所述基质培养基中添加的添加剂成分及其浓度，如下：转铁蛋白9-12μg/mL、胰岛素1-3mg/mL、生长因子2-4μg/mL、维生素C 8-10mg/mL、叶酸2-5mg/mL、葡萄糖1-3mg/mL、金属离子6-8μg/mL、钙离子3-5μg/mL、链霉素0.1-0.2mg/mL、脂肪酸1-3mg/mL、氨基酸1-3mg/mL、和乙基麦芽酚1-3mg/mL。

优选的，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

优选的，所述金属离子包括等量的铁离子、钠离子、钾离子、锌离子以及镁离子。

一种干细胞培养基的其制备方法，包括以下步骤：

S1、取上述浓度的添加剂成分，以及DMEM/F12液体培养基；

S2、向DMEM/F12液体培养基内加入转铁蛋白、胰岛素、维生素C、叶酸、葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、和乙基麦芽酚进行混合搅拌20-40min，然后加入生长因子再次进行搅拌10-15min，最后加入链霉素搅拌10-15min，静止3-4h，得到混合物A；

S3、将各个金属离子溶液以及钙离子溶液进行混合搅拌20-30min，搅拌后静止1-2h，得到混合物B；

S4、将混合物B通过胶头滴管，滴加入到混合物A中，且滴加过程中进行震荡，滴加完毕后静止，得到混合物C；

S5、将混合物C中加入质量分数为6-8％的碳酸钠溶液，调节混合物C的pH至7.0-7.4；

S6、调节pH后的混合物C进行灭菌，灭菌温度为110-120℃，灭菌时间为10-15min，灭菌后得到干细胞培养基。

优选的，所述S3中的金属离子溶液包括等量的铁离子溶液、钠离子溶液、钾离子溶液、锌离子溶液以及镁离子溶液。

优选的，所述S2中的生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

优选的，所述S5中混合物C中加入质量分数为7％的碳酸钠溶液，调节混合物C的pH至7.2。

本发明的有益效果是：

本发明的干细胞培养基组分确定，便于批次化和标准化，不添加动物血清，可以规避动物血清中的异源体，同时可以提高细胞生长对酸、热的稳定性，且可以使细胞生长在培养基中持续、平稳地释放，使细胞平稳扩增。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1中

一种干细胞培养基及其制备方法，包括基质培养基与添加剂，基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向基质培养基中添加的添加剂成分及其浓度，如下：转铁蛋白9μg/mL、胰岛素1mg/mL、生长因子2μg/mL、维生素C 8mg/mL、叶酸2mg/mL、葡萄糖1mg/mL、金属离子6μg/mL、钙离子3μg/mL、链霉素0.1mg/mL、脂肪酸1mg/mL、氨基酸1mg/mL、和乙基麦芽酚1mg/mL。

进一步的，生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

进一步的，金属离子包括等量的铁离子、钠离子、钾离子、锌离子以及镁离子。

一种干细胞培养基的其制备方法，包括以下步骤：

S1、取上述浓度的添加剂成分，以及DMEM/F12液体培养基；

S2、向DMEM/F12液体培养基内加入转铁蛋白、胰岛素、维生素C、叶酸、葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、和乙基麦芽酚进行混合搅拌20-40min，然后加入生长因子再次进行搅拌10min，最后加入链霉素搅拌10min，静止3h，得到混合物A；

S3、将各个金属离子溶液以及钙离子溶液进行混合搅拌20min，搅拌后静止1h，得到混合物B；

S4、将混合物B通过胶头滴管，滴加入到混合物A中，且滴加过程中进行震荡，滴加完毕后静止，得到混合物C；

S5、将混合物C中加入质量分数为6-8％的碳酸钠溶液，调节混合物C的pH至7.0；

S6、调节pH后的混合物C进行灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为10min，灭菌后得到干细胞培养基。

进一步的，S3中的金属离子溶液包括等量的铁离子溶液、钠离子溶液、钾离子溶液、锌离子溶液以及镁离子溶液。

进一步的，S2中的生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

实施例2中

一种干细胞培养基及其制备方法，包括基质培养基与添加剂，基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向基质培养基中添加的添加剂成分及其浓度，如下：转铁蛋白10μg/mL、胰岛素2mg/mL、生长因子3μg/mL、维生素C 9mg/mL、叶酸3mg/mL、葡萄糖2mg/mL、金属离子7μg/mL、钙离子4μg/mL、链霉素0.15mg/mL、脂肪酸2mg/mL、氨基酸2mg/mL、和乙基麦芽酚2mg/mL。

进一步的，生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

进一步的，金属离子包括等量的铁离子、钠离子、钾离子、锌离子以及镁离子。

一种干细胞培养基的其制备方法，包括以下步骤：

S1、取上述浓度的添加剂成分，以及DMEM/F12液体培养基；

S2、向DMEM/F12液体培养基内加入转铁蛋白、胰岛素、维生素C、叶酸、葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、和乙基麦芽酚进行混合搅拌30min，然后加入生长因子再次进行搅拌12min，最后加入链霉素搅拌12min，静止3.5h，得到混合物A；

S3、将各个金属离子溶液以及钙离子溶液进行混合搅拌25min，搅拌后静止1.5h，得到混合物B；

S4、将混合物B通过胶头滴管，滴加入到混合物A中，且滴加过程中进行震荡，滴加完毕后静止，得到混合物C；

S5、将混合物C中加入质量分数为7％的碳酸钠溶液，调节混合物C的pH至7.2；

S6、调节pH后的混合物C进行灭菌，灭菌温度为115℃，灭菌时间为12min，灭菌后得到干细胞培养基。

进一步的，S3中的金属离子溶液包括等量的铁离子溶液、钠离子溶液、钾离子溶液、锌离子溶液以及镁离子溶液。

进一步的，S2中的生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

实施例3中

一种干细胞培养基及其制备方法，包括基质培养基与添加剂，基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向基质培养基中添加的添加剂成分及其浓度，如下：转铁蛋白12μg/mL、胰岛素3mg/mL、生长因子4μg/mL、维生素C10mg/mL、叶酸5mg/mL、葡萄糖3mg/mL、金属离子8μg/mL、钙离子5μg/mL、链霉素0.2mg/mL、脂肪酸3mg/mL、氨基酸3mg/mL、和乙基麦芽酚3mg/mL。

进一步的，生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

进一步的，金属离子包括等量的铁离子、钠离子、钾离子、锌离子以及镁离子。

一种干细胞培养基的其制备方法，包括以下步骤：

S1、取上述浓度的添加剂成分，以及DMEM/F12液体培养基；

S2、向DMEM/F12液体培养基内加入转铁蛋白、胰岛素、维生素C、叶酸、葡萄糖、脂肪酸、氨基酸、和乙基麦芽酚进行混合搅拌40min，然后加入生长因子再次进行搅拌15min，最后加入链霉素搅拌15min，静止4h，得到混合物A；

S3、将各个金属离子溶液以及钙离子溶液进行混合搅拌30min，搅拌后静止2h，得到混合物B；

S4、将混合物B通过胶头滴管，滴加入到混合物A中，且滴加过程中进行震荡，滴加完毕后静止，得到混合物C；

S5、将混合物C中加入质量分数为6-8％的碳酸钠溶液，调节混合物C的pH至7.4；

S6、调节pH后的混合物C进行灭菌，灭菌温度为120℃，灭菌时间为15min，灭菌后得到干细胞培养基。

进一步的，S3中的金属离子溶液包括等量的铁离子溶液、钠离子溶液、钾离子溶液、锌离子溶液以及镁离子溶液。

进一步的，S2中的生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和干细胞生长因子的浓度占比为4:3:3。

按照按照GMP标准对细菌、真菌、pH指标进行检测检测，如表1：

经检测实施例1-3制备的培养基均符合指标。

对实施例1-3内培养基的细胞扩增倍数进行三周监测，如表2：

根据对实施例1-3培养基内的细胞扩增进行监测，本发明中的培养基使细胞生长在培养基中持续、平稳地释放，使细胞平稳扩增。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。