一株芽孢杆菌及其在促生与降解水稻中毒死蜱的应用

技术领域

本发明涉及一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)及其在促生与降解毒死蜱的应用，该阿氏芽孢杆菌菌剂应用于水稻种植体系中进行植物促生与水稻内农药毒死蜱降解，属于微生物学及环境健康与安全领域。

技术背景

毒死蜱是稻田常用的杀虫剂之一，在防治水稻虫害保证水稻产量方面有重要的作用。作为有机磷农药的代表产品，毒死蜱具有高效、广谱的杀虫特性。农药在实现杀虫防病的同时，也会对作物的生长造成一定的影响，除此之外，农药残留也会对农田土壤及水体生态环境产生负面作用。在农药胁迫下，提高植物的抗逆性，及时清除土壤环境中农药残留是农业生产中迫切需要解决的问题。

目前针对毒死蜱微生物降解主要单纯针对土壤中或者植物中毒死蜱，如文献“两株蜡状芽孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究”和“蜡状芽孢杆菌HY-1降解甲基对硫磷和毒死蜱的影响因素研究”公开了芽孢杆菌在降解环境中毒死稗中的应用；中国专利“CN112226385A“公开了一种具分泌IAA能力、解磷能力和ACC脱氨酶活性的巨大芽孢杆菌，但这些菌株均不涉及促进水稻吸收和降解毒死蜱。

发明内容

本发明提供一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai strain)，该菌株可在水稻根际与植株中定殖并能缓解毒死蜱对水稻的胁迫，促进水稻的生长，同时促进水稻富集和降解毒死蜱，减少农作物和环境中的毒死蜱残留。该菌株还能在毒死蜱胁迫下，通过释放ACC脱氨酶，IAA等促生物质，有效提高水稻生物量，服务于绿色农业。

具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：

首先，本申请提供一株保藏号为CGMCC No.22887的芽孢杆菌(Bacillus sp.)，该菌株未革兰氏阳性菌，菌体为直杆状，有内生芽孢。申请人将其自命名为DJ2。该菌株分离自毒死蜱污染土壤种植水稻植株中，对动植物无害。

其次，本申请还提供了保藏号为CGMCC No.22887的芽孢杆菌在降解毒死蜱中的应用，所述应用包括降解环境中以及水稻植株内毒死蜱的应用。

进一步而言，芽孢杆菌在降解农作物植株内毒死蜱的应用，所述农作物优选水稻。具体步骤如下：利用芽孢杆菌菌剂对农作物进行浸根处理，用以增强水稻中残留毒死蜱的降解；上述芽孢杆菌菌剂包括：MSM培养基以及终浓度为10

进一步而言，上述对农作物进行浸根处理是指对利用芽孢杆菌菌剂对三叶一心期水稻浸根处理6h。

第三，本申请还提供了保藏号为CGMCC No.22887的芽孢杆菌在促进农作物生长，提高生物量中的应用；所述农作物优选水稻。其具体步骤为：利用芽孢杆菌菌剂对水稻进行浸根处理6h，用以应对农药毒死蜱胁迫同时分泌促生物质与活性酶，促进水稻生长，提高水稻生物量。

本申请还提供了一种包括芽孢杆菌和MSM培养基的菌剂。所述菌剂中，芽孢杆菌的菌含量为10

本申请首次在毒死蜱污染土壤种植水稻植株中发现了一株芽孢杆菌，并加以研究和保藏。申请人在后续研发中，进一步检测或者该菌株为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)。经实验证明，该菌株可在水稻根际与植株中定殖，促进水稻吸收和降解毒死蜱，减少农作物和环境中的毒死蜱残留；同时通过释放ACC脱氨酶，IAA等促生物质，有效提高水稻生物量，促进水稻生长。

附图说明

图1为阿氏芽孢杆菌DJ2电镜扫描图。

图2为阿氏芽孢杆菌DJ2定殖于水稻内后荧光示意图。

图3为阿氏芽孢杆菌DJ2对毒死蜱的体外降解功能验证结果示意图。

图4为该微生物菌剂对水稻中残留毒死蜱修复功能展示。

图5-7为阿氏芽孢杆菌DJ2具有的促生功能展示。

图8为阿氏芽孢杆菌DJ2增强植物谷胱甘肽-S-转移酶活力展示。

图9为阿氏芽孢杆菌DJ2定殖水稻后促进生物量提高的展示。

具体实施方式

实施例所涉及的培养基：

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH 7.0；

无机盐液体培养基(MSM)：MgSO

无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/L琼脂；

King B培养基(金氏培养基)：去离子水1000mL，胰蛋白胨32g，磷酸氢二钾1.15g，七水合硫酸镁1.5g，甘油10mL，外加1g左旋色氨酸。

NBRIP培养基：去离子水1000mL，葡萄糖10g，磷酸钙5g，氯化镁5g，硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g。

阿斯毕(Ashby)无氮培养基：去离子水1000mL，葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.2g，七水合硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g。

以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。

实施例1 阿氏芽孢杆菌DJ2的分离鉴定与降解功能验证

1、菌株DJ2(Bacillus aryabhattaistrain DJ2)分离鉴定

申请人于2016年7月采集了江苏省农业科学院实验田(E118°86′，N32°03′)中毒死蜱污染土壤中种植的水稻，对具有毒死蜱降解功能内生菌进行筛选。内生菌筛选方式：75％酒精浸没植物样品60s，1％次氯酸钠浸没120s，每次弃去溶液后无菌水润洗3次。最后一次灭菌水涂布平板，验证灭菌效果。向装有表面消毒完毕的样品管加入灭菌钢珠与200μL灭菌水，震荡机750rpm/min捶打20min，取100μL管内溶液涂布在含有毒死蜱为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，申请人将该菌株命名为DJ2，该菌株呈棒杆状，有内生芽孢。该菌株的电镜图如图1所示。

申请人初步通过生理生化特性和16SrDNA保守序列比对DJ2菌株鉴定为其为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，于2021年7月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.22887,分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。申请人在提交保藏后，进一步对菌株DJ2进行分类研究，或者其分类学名称为芽孢杆菌(Bacillus sp.)属阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)

2、菌株DJ2(Bacillus aryabhattaistrain DJ2)降解毒死蜱功能验证

先用LB培养基培养步骤1筛选获得的DJ2菌株12小时，菌液经离心后(6000rpm，5min，20℃)用灭菌无机盐溶液(pH 7.0)重悬清洗三次，调节(OD

C＝(A-B)/A*100％

A＝CK中毒死蜱浓度，mg/kg；

B＝实验组毒死蜱浓度，mg/kg；

C＝毒死蜱降解率

由该公式计算确定DJ2的毒死蜱离体降解能力。气相色谱法(GC)参数参见文献：

Feng Fayun et al.Enhanced degradation ofchlorpyrifos in rice(OryzasativaL.)by five strains ofendophytic bacteria and theirplant growthpromotional ability.[J].Chemosphere,2017,184:505-513.

检测结果如图3所示，15天内，DJ2菌液(OD

实施例2 DJ2菌剂的制备

所述DJ2菌剂是这样获得的：

A)将如权利要求1所述的DJ2菌种接种至含有10μg/mL毒死蜱的LB培养基富集，先后划线于含有10μg/mL毒死蜱的MSM固体平板与LB固体平板，再从平板中挑取单菌落于LB液体培养基中，30℃，150-220rpm摇床震荡培养12h，连续活化两次获得活化菌液；

B)在超净工作台中将活化菌液置于50ml灭菌离心管，20℃、6000rpm离心5min得沉淀菌体，用灭菌MSM液体培养基润洗3次后再次加入MSM调节菌液OD

实施例3 DJ2定殖促进水稻吸收和降解毒死蜱能力实验

土壤采自江苏省农业科学院大田，晾干后锤碎，过20目筛除杂备用。组成(归一化)：有机质0.03；淤泥0.50；黏土0.21；含沙0.26。

毒死蜱处理：使用45％毒死蜱乳油按照2倍推荐剂量(初始水稻上沉积量约为20ppm)对水稻叶面进行人工喷洒。设置接菌组和对照组，平行处理n＝3。

内生菌定殖水稻：水稻品种南粳9108(江苏省农业科学院粮食作物所)。采用上述实例2中获得的DJ2菌剂，选择长势一致的三叶一心的水稻，用去离子水冲洗干净水稻根部，将水稻根部浸入该菌液中，接菌处理6h后，将水稻转移至水稻营养液中培养，以未接菌的水稻植株作为对照，采集定殖后6d的水稻样品，使用荧光共聚焦显微镜观测转绿色荧光蛋白菌株在水稻不同组织中的分布，观测结果如图2所示。定殖的水稻根(root)、茎(stems)、叶(leaf)部位均散发出较为明显的绿色荧光，表明DJ2能成功定殖到水稻各组织中。

毒死蜱富集与降解：接菌水稻根部富集毒死蜱在3d时高出对照37.2％，9d之后，接菌与对照水稻根部毒死蜱浓度趋于一致，表明接种DJ2可以促进水稻对毒死蜱的富集和降解；而在水稻茎叶中，接菌水稻中毒死蜱降解半衰期从3.5d降低到了2.7d，说明该内生菌定殖能够促进水稻中毒死蜱降解；定期取样用GC测定水稻根、茎叶中毒死蜱的降解动态。实验结果如图4所示，与对照相比，接菌组水稻茎叶中毒死蜱浓度在15d实验周期内最高下降了45.8％。

实施例4 DJ2促生特性及在毒死蜱胁迫下对水稻促生效果实验

DJ2促生特性：

1-IAA：取DJ2菌剂接入含有左旋色氨酸(1g)(IAA合成前体物)的King B培养基中，以未接菌的King B培养基作为对照组，32℃、180r/min摇床培养12h。8000rpm离心5min，取上清液与Salkowski试剂(35％高氯酸50mL加0.5mol/L氯化铁1mL)按照1:2的比例充分混匀，置于暗室反应30min，结果见图5，DJ2组有暗红色物质产生表明该菌能够产生IAA。

2-溶磷性：将DJ2菌剂接种于NBRIP固体培养基，32℃恒温培养7d，结果如图6所示，可以看到三株内生菌周围均有透明圈产生，表明DJ2具有磷溶解特性。

3-ACC脱氨酶活性将DJ2菌剂接种于含有ACC的阿斯毕无氮培养基中，以不添加ACC的培养基为对照组，30℃、180r/min培养14d。结果如图7所示，可以看到DJ2组含有ACC的阿斯毕培养基变得浑浊，说明DJ2能够产生ACC脱氨酶，利用ACC作为氮源生长。

4-谷胱甘肽-S-转移酶活力：谷胱甘肽-S-转移酶是一种普遍存在动植物体内具有多种功能的酶，能够降解某些外界毒素和内源性有毒代谢物。利用DJ2菌剂对三叶一心期水稻浸根处理6h，定殖完毕后，使用45％毒死蜱乳油以2倍推荐剂量对水稻叶面进行喷施，以三株水稻为一组进行计重。

图8结果显示内生菌DJ2定殖的水稻在受到毒死蜱胁迫处理后，谷胱甘肽-S-转移酶活力显著上升，在毒死蜱胁迫下，内生菌DJ2定殖水稻的叶片中谷胱甘肽-S-转移酶活力达到74.50U/kg，相比于毒死蜱胁迫的CK处理组，谷胱甘肽-S-转移酶活力提高了16.50％，该酶与毒死蜱降解相关。

5-DJ2定殖提升水稻生物量:如图9所示，毒死蜱胁迫下DJ2定殖水稻在第30d较CK组鲜重有提升，较未接菌组鲜重提升29.6％。

实验结果说明，该菌种在体外具有良好促生效果，定殖于水稻中后能够在毒死蜱胁迫下促进水稻生物量提升。