用于肝细胞低氧培养的培养液、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及肝细胞低氧培养技术领域，具体而言，涉及用于肝细胞低氧培养的培养液、其制备方法及其应用。

背景技术

肝脏是人体重要的代谢和解毒器官，然而多种因素可导致肝脏细胞发生低氧损伤，多见于肝脏外科手术及临床肝移植手术中存在的肝脏缺血再灌注。而缺血再灌注损伤很大程度上影响着手术以及肝移植的成败。因此，如何有效预防肝脏细胞发生低氧损伤是临床亟待解决的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供用于肝细胞低氧培养的培养液、其制备方法及其应用。本发明实施例提供的培养液可以降低肝细胞的低氧损伤，对肝脏细胞有良好的保护作用，继而可以治疗肝损伤，特别是，缺氧导致的肝损伤。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种用于肝细胞低氧培养的培养液，其包括肝细胞培养基、白藜芦醇和间充质干细胞条件培养基，其中，所述间充质干细胞条件培养基与所述肝细胞培养基的体积比为1:1-2，所述白藜芦醇在所述培养液中的浓度为10-20μmol/L。

在可选的实施方式中，所述间充质干细胞条件培养基是间充质干细胞经过培养后分离得到的无细胞的上清液；

优选地，所述间充质干细胞条件培养基是间充质干细胞经过低氧培养后分离得到的无细胞的上清液；

优选地，低氧培养中氧气浓度低于6%，优选为1%。

在可选的实施方式中，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞。

在可选的实施方式中，所述肝细胞培养基为DMEM培养基。

第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的用于肝细胞低氧培养的培养液的制备方法，包括：将肝细胞培养基、白藜芦醇和间充质干细胞条件培养基混合。

在可选的实施方式中，所述间充质干细胞条件培养基的制备包括：利用干细胞专用培养基对间充质干细胞进行培养，且当培养的所述间充质干细胞的融合度达到75-85%后，将所述干细胞专用培养基更换为肝细胞培养基，而后进行低氧培养，接着，分离得到无细胞的上清液。

在可选的实施方式中，低氧培养的条件包括：氧气浓度低于6%，优选为1%，培养时间36-48小时；

优选地，所述间充质干细胞为2-10代中任意一代的间充质干细胞。

在可选的实施方式中，分离的步骤包括：低氧培养结束后，进行第一次离心收集细胞上清液，而后对所述细胞上清液进行第二次离心，接着，进行过滤。

在可选的实施方式中，第一次离心的条件包括：速度250-350g，时间10-15分钟；

第二次离心的条件包括：速度2000-3000g，时间10-15分钟；

过滤时采用的滤膜为孔径为0.22 -0.45μm的滤膜。

第三方面，本发明提供一种肝细胞低氧培养的培养方法，包括：利用前述实施方式所述的用于肝细胞低氧培养的培养液对肝细胞进行培养；

优选地，进行低氧培养。

第四方面，本发明提供一种前述实施方式所述的用于肝细胞低氧培养的培养液在制备治疗肝脏损伤的药物中的应用；

优选地，肝脏损伤包括肝脏缺血再灌注；

优选地，肝脏损伤包括低氧环境下导致的肝脏缺氧损伤。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供的培养液利用肝细胞培养基、间充质干细胞条件培养基内丰富的营养成分和白藜芦醇配合，减轻缺氧情况下肝细胞的氧化应激，同时，预防肝脏细胞的低氧损伤，继而对肝细胞有良好的保护作用，继而可以治疗肝损伤，特别是，缺氧导致的肝损伤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的培养代数为P4的脐带间充质干细胞的细胞图；

图2为本发明实施例1提供的Oil Red O染色结果图；

图3为本发明实施例1提供的茜素红染色结果图；

图4为本发明实验例1提供的HepaRG细胞的细胞活性结果图；

图5为本发明实验例1提供的L-02细胞的细胞活性结果图；

图6为本发明实验例2提供的HepaRG细胞的细胞TUNEL染色结果图；

图7为本发明实验例2提供的L-02细胞的TUNEL染色结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种用于肝细胞低氧培养的培养液的制备方法，包括：

S1、制备间充质干细胞条件培养基；

利用干细胞专用培养基对2-10代中任意一代的间充质干细胞进行培养。此时采用的干细胞专用培养基为常规的干细胞专用培养基，且此时的培养条件为现有公知的常规的培养条件。

其中，间充质干细胞包括脐带间充质干细胞。

培养至间充质干细胞的融合度达到75-85%后，将所述干细胞专用培养基更换为肝细胞培养基，而后进行低氧培养。此处采用的肝细胞培养基为常规的肝细胞培养基，例如DMEM。

进一步地，低氧培养的条件包括氧气浓度低于6%，优选为1%，培养时间48小时；具体地，氧气浓度低于6%，二氧化碳浓度为5%，其余气体采用氮气补充。

进一步地，低氧培养结束后，对培养体系进行分离得到无细胞的上清液，即为间充质干细胞条件培养基。具体地，低氧培养结束后，进行第一次离心收集细胞上清液，而后对所述细胞上清液进行第二次离心，接着，进行过滤。其中，第一次离心的条件包括：速度250-300g，例如，250g、260 g、270 g、280 g、290 g和300 g等250-300 g之间的任意数值，时间10-15分钟，例如，10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟以及15分钟等10-15分钟之间的任意数值；第二次离心的条件包括：速度2000-3000g，例如，2000 g、2100 g、2150 g、2300g、2450 g、2500 g、2600 g、2750 g、2850 g、2900 g以及3000 g等2000-3000 g之间的任意数值，时间10-15分钟，例如，10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟以及15分钟等10-15分钟之间的任意数值；过滤时采用的滤膜为孔径为0.22-0.45μm的滤膜，优选为0.22μm的滤膜。

过滤后得到的间充质干细胞条件培养基在-80℃条件下保存，使用时取出。

形成的间充质干细胞条件培养基中含有丰富的营养成分，例如：生长因子和其他细胞因子等，既保留了MSCs功能，又具备精准高效的传递方式和易于保存和调控的结构优势，继而能够预防肝细胞低氧损伤。同时，其并且容易获得，使得间充质干细胞条件培养基成为肝脏损伤潜在治疗选择，有极大的应用前景。

S2、形成培养液；

将上述制备得到的间充质干细胞条件培养基与肝细胞培养基混合，且二者的体积比为1:1-2，例如为1:1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2等1:1-2之间的任意数值。

而后将白藜芦醇加入上述间充质干细胞条件培养基与肝细胞培养基混合形成的混合培养基中形成培养液，且白藜芦醇在培养液中的浓度为10-20μmol/L，例如10μmol/L、11μmol/L、12μmol/L、13μmol/L、14μmol/L、15μmol/L、16μmol/L、17μmol/L、18μmol/L、19μmol/L以及20μmol/L等10-20μmol/L之间的任意数值。

通过采用肝细胞 培养基、白藜芦醇和间充质干细胞条件培养基，以及限定其含量，能够减轻缺氧情况下肝细胞的氧化应激反应，同时，预防肝细胞低氧损伤，显著提高肝细胞缺氧条件下的细胞存活率，继而可以治疗肝损伤，特别是，缺氧导致的肝损伤。

其中采用的肝细胞培养基可以是现有技术中的肝细胞培养基，例如DMEM培养基。

第二方面，本发明实施例提供一种上述用于肝细胞低氧培养的培养液，其包括肝细胞培养基、白藜芦醇和间充质干细胞条件培养基，其中，所述间充质干细胞条件培养基与所述肝细胞培养基的体积比为1:1-2，所述白藜芦醇在所述培养液中的浓度为10-20μmol/L。

间充质干细胞条件培养基是间充质干细胞经过培养（例如低氧培养）后分离得到的无细胞的上清液。肝细胞培养基为DMEM培养基。

第三方面，本发明提供一种肝细胞低氧培养的培养方法，包括：利用前述实施方式所述的用于肝细胞低氧培养的培养液对肝细胞进行培养；

优选地，进行低氧培养。

第四方面，本发明提供一种前述实施方式所述的用于肝细胞低氧培养的培养液在制备治疗肝脏损伤的药物中的应用；

优选地，肝脏损伤包括肝脏缺血再灌注；

优选地，肝脏损伤包括低氧环境下导致的肝脏缺氧损伤。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1、间充质干细胞的分离、培养

采用组织块直接贴壁法分离脐带间充质干细胞：在无菌操作台下用PBS多次漂洗脐带中血液，将脐带切成1-2cm长度大小的片段。用组织剪和血管钳剥离脐带的血管（一条静脉和两条动脉）及外层羊膜以防止内皮细胞污染。将脐带中的华通胶部分切成小块，体积为0.5-1cm

将脐带间充质干细胞传至4-10代用于制备所述间充质干细胞条件培养基（记为：MSC-CM）。传代后细胞生长加速，细胞排列规则，以梭形为主，生长均匀，参见图1，图1为培养代数为P4的脐带间充质干细胞。

2、间充质干细胞向脂肪细胞分化

将上述脐带间充质干细胞按照1*10

参见图2，图2中P4（图2左侧）和P6（图2右侧）代脐带间充质干细胞经过3W的成脂诱导均有脂肪液滴产生，表明脐带间充质干细胞有向脂肪细胞分化的潜能。

3、间充质干细胞向骨细胞分化

将脐带间充质干细胞按照1*10

参见图3，图3中P4（图3左侧）和P6（图3右侧）代脐带间充质干细胞经过3W的成骨诱导均呈茜素红染色阳性，表明脐带间充质干细胞有向成骨细胞分化的潜能。

图2和图3表明脐带间充质干细胞有多向分化潜能，继而证明本发明实施例制备得到脐带间充质干细胞。

4、间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）的制备

将P4代的脐带间充质干细胞用干细胞专用培养基进行培养至融合度达到80%，吸弃干细胞专用培养基，PBS清洗细胞两次，更换成等体积的肝细胞培养基（DMEM）。而后，将脐带间充质干细胞于低氧培养箱中（1%O

5、用于肝细胞低氧培养的培养液的制备

将上述制备得到的间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）和肝细胞培养基（DMEM）体积按照1-2的比例混合后加入终浓度为10μmol/L白藜芦醇制备而成。

肝细胞缺氧损伤模型

肝细胞缺氧模型是通过将肝细胞放在低氧（1%O

实验例1

细胞CCK-8检测

通过CCK-8试剂盒检测细胞活力。细胞活性变化可以反应低氧环境下肝细胞的损伤情况。

方法：将HepaRG细胞和L-O2细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，加入完全培养基（DMEM+10%FBS）100μL于常氧培养箱（20%）中培养24h后，吸弃完全培养基，用PBS清洗两遍。

将细胞分为以下几组：细胞常氧培养对照组（图4和图5从左至右的第一个柱形），细胞低氧培养对照组（图4和图5从左至右的第二个柱形），细胞低氧培养+MSC-CM实验组（图4和图5从左至右的第三个柱形），细胞低氧培养+肝细胞低氧培养液实验组（图4和图5从左至右的第四个柱形）。其中，所述常氧培养对照组是指细胞中加入肝细胞培养基（DMEM）100μL于常氧培养箱中培养，所述细胞低氧培养对照组是指细胞中加入肝细胞培养基（DMEM）100μL于低氧培养箱中培养，所述细胞低氧培养+MSC-CM实验组是指细胞中加入干细胞条件培养基（MSC-CM）100μL于低氧培养箱中培养，所述细胞低氧培养+肝细胞低氧培养液实验组是指细胞中加入肝细胞低氧培养液与低氧培养箱中培养。

对细胞进行常氧（氧气浓度为20%）和低氧（氧气浓度为1%）处理48h后，吸弃培养液。将10ul的CCK8溶液添加至每个孔，37℃孵育2h后用酶标仪测定450nm处的吸光度。

结果参见图4和图5。图4为HepaRG细胞的细胞活性结果图，从图4中可以看出与HepaRG细胞低氧组相比，干细胞条件培养基（MSC-CM）组可以明显提高HepaRG细胞的细胞活性，肝细胞低氧培养液相比于干细胞条件培养基（MSC-CM）可以更高程度防止HepaRG细胞低氧损伤。图5为细胞为L-02细胞的细胞活性结果图，从图5中可以看出与L-02细胞低氧组相比，干细胞条件培养基（MSC-CM）组可以明显提高L-02细胞的细胞活性，肝细胞低氧培养液相比于干细胞条件培养基（MSC-CM）可以更高程度防止L-02细胞低氧损伤。

实验例2

细胞TUNEL染色

通过TUNEL染色试剂盒对细胞进行凋亡染色。TUNEL染色可以反应低氧情况下细胞的凋亡情况，从而反应细胞的损伤情况。

方法：将HepaRG细胞和L-O2细胞以2*10

将细胞分为以下几组：细胞常氧培养对照组（图6和图7从左至右的第一个张图），细胞低氧培养对照组（图6和图7从左至右的第二张图），细胞低氧培养+MSC-CM实验组（图6和图7从左至右的第三张图），细胞低氧培养+肝细胞低氧培养液实验组（图6和图7从左至右的第四张图）。所述各组和CCK-8实验分组一致，仅加入的培养液的量由100μL增加至2mL。对细胞进行常氧和低氧处理48h后，根据试剂盒操作进行染色，染色后在激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)的荧光显微镜下观察，其中蓝色为细胞核，绿色则为凋亡细胞。

结果参见图6和图7。图6为HepaRG细胞的细胞TUNEL染色结果图，从图6中可以看出与HepaRG细胞低氧组相比，干细胞条件培养基（MSC-CM）组可以明显降低HepaRG细胞的凋亡，肝细胞低氧培养液相比于干细胞条件培养基（MSC-CM）可以更高程度降低HepaRG细胞的凋亡水平。图7为细胞为L-02细胞的细胞TUNEL染色结果图，从图7中可以看出与L-02细胞低氧组相比，干细胞条件培养基（MSC-CM）组可以明显降低L-02细胞的凋亡，肝细胞低氧培养液相比于干细胞条件培养基（MSC-CM）可以更高程度降低L-02细胞的凋亡水平。

综上，图4-图7的结果表明本发明实施例提供的用于肝细胞低氧培养的培养液可以有效防止肝细胞低氧情况下的细胞损伤，保持细胞活性，可作为肝细胞缺氧损伤的治疗药物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。