用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通道阻断剂的组合物和方法
文献发布时间：2023-06-19 13:48:08
本申请要求2019年8月14日提交的美国临时专利申请系列号62/886,733、2019年8月6日提交的美国临时专利申请系列号62/883,637、2019年5月30日提交的美国临时专利申请系列号62/854,688、2019年4月5日提交的美国临时专利申请系列号62/830,142和2019年3月28日提交的美国临时专利申请系列号62/825,784的权益，这些申请通过提及而以其整体合并入本文。
本公开内容尤其提供了遗传编码的高电压激活钙通道(High-Voltage ActivatedCalcium Channel；HVACC)抑制剂(包括靶向Ca
本发明用在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的基金号GM107585、DK118866和HL142111之下的政府资助来完成。政府拥有本发明中的某些权利。
本申请包含对于已经作为序列表TXT文件“CU19283-pro4-seq.txt”(文件大小43KB，于2019年8月6日创建)与本文同时提交的氨基酸和/或核酸序列的引用。上面提及的序列表依照37C.F.R.§1.52(e)(5)通过提及而以其整体合并入本文。
高电压激活钙通道(HVACC)对于可兴奋细胞例如神经元的功能是关键性的。它们允许神经递质、激素的释放，并且起始骨骼肌和心肌两者的收缩。因此，钙通道阻断剂已成为用于各种不同疾病诸如高血压、心律失常、糖尿病、帕金森病和慢性疼痛的突出的药物靶标。最后一种疾病据估计影响全球人口的20％，具有巨大的经济和社会后果。尽管该大的流行率，但是目前用于慢性疼痛的治疗仍然是不适当的，如用导致阿片样物质流行的用于慢性疼痛的常见治疗所例示的。
在HVACC之中，N-型钙通道是用于治疗慢性疼痛的主要靶标。已确立，这些通道在传递疼痛感觉的感觉神经元中表达，阻断这些通道可以使疼痛知觉中断，并且这些通道在多种疼痛模型中被上调。源自海洋蜗牛毒液的N-型钙通道阻断剂(Prialt)目前在有限的情形下用于疼痛管理，但是受限于狭窄的治疗窗。在特定组织中减少/抑制HVACC的治疗潜力超出了疼痛范围：钙通道阻断剂目前在临床试验中用于治疗糖尿病以及帕金森病。所有目前的药物都通过破坏其允许钙进入细胞的能力而在其功能位置(质膜)处阻断所述通道。鉴于它们在许多细胞中的中枢重要性，对于所有目前的药理学HVACC阻断剂的主要关切是脱靶效应。
大多数针对HVACC的药物靶向所述通道的孔形成性α
目前，还不存在有特异性地阻断所有HVACC的遗传编码的分子或工具。天然出现的遗传编码的抑制剂例如RGK蛋白结合其他蛋白质并且影响其他细胞过程，例如调节细胞骨架。这意味着，必须共施用HVACC阻断剂的混合物，其中一些是昂贵的源自毒液的肽。
因此，对于遗传编码的HVACC抑制剂以及用于治疗各种与HVACC相关的疾病的组合物和方法存在需要。本公开内容旨在满足这些和其他需要。
抑制高电压激活钙通道(HVACC；Ca
因此，本公开内容的一个实施方案为能够与Ca
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的E3泛素连接酶的催化结构域。
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含遗传编码的钙通道阻断剂，所述遗传编码的钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)E3泛素连接酶的催化结构域。
本公开内容的一个进一步的实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触。
本公开内容的另一个实施方案为选择性地靶向受试者中的细胞群体的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
本公开内容的另一个实施方案为用于在细胞中可诱导地抑制高电压激活钙通道(HVACC)的组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1
本公开内容的一个另外的实施方案为组合物，其包含遗传编码的诱导型钙通道阻断剂，所述遗传编码的诱导型钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1
本公开内容的另一个实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括下列步骤：(i)使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触；和(ii)使所述细胞与佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)相接触；其中步骤(i)和(ii)的接触对于将所述HVACC从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。
本公开内容的另外一个实施方案为用于治疗或改善在受试者中疾病的影响的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
申请文件包含至少一张以彩色制作的照片。在提出要求并支付必要的费用后，将由专利局提供带有彩色照片的该专利申请的副本。
图1A-1G显示了泛-Ca
图2A-2L显示，nb.F3对于重构的Ca
图3A-3J显示了嵌合nb.F3-Nedd4L蛋白(Ca
图4A-4D显示，Ca
图5A-5H显示了在心肌细胞中内源性Ca
图6A-6G显示了在DRG神经元和胰腺β-细胞中HVACC的Ca
图7显示，nb.F3结合在哺乳动物细胞的胞质溶胶中的所有四种Ca
图8A-8F显示了关于具有YFP-Ca
图9A-9E显示，nb.F3对于重构的Ca
图10A-10H显示了关于用YFP-Ca
图11A-11D显示了嵌合nb.F3-Nedd4L蛋白(Ca
图12A-12D显示，Ca
高电压激活钙通道(HVACC)的抑制对于各种各样的心血管疾病(高血压、心律失常、脑血管痉挛)和神经病学疾病(癫痫、慢性疼痛、帕金森病)来说是一种重要的盛行或有潜力的疗法(Zamponi等人,2015)。小分子HVACC抑制剂包括Ca
存在七种不同的HVACC(Ca
Rad/Rem/Rem2/Gem/Kir(RGK)蛋白是内源性的小Ras-样G-蛋白，其当在异源细胞或天然组织中过表达时，极大地抑制所有HVACC(Béguin等人,2001；Finlin等人,2003；Chen等人,2005；Xu等人,2010)。它们通过结合至作为组成部分的β亚基而与HVACC形成三级复合物，并且通过多种机制(包括去除表面通道和削弱门控)来抑制电流(Yang和Colecraft,2013；Yang等人,2010)。尽管它们具有效力，但是RGK作为遗传编码的HVACC抑制剂的功用被潜在的脱靶效应搅乱，因为它们与其他结合伙伴例如细胞骨架蛋白、14-3-3、钙调蛋白和CaM激酶II相互作用并且调节它们(Yang和Colecraft,2013；Correll等人,2008；Royer等人,2018；Béguin等人,2005；Ward等人,2004)。一个关键的未满足的需要是开发遗传编码的HVACC抑制剂，其具有高的RGK效力，但没有成问题的与其他信号传导蛋白的相互作用。本公开内容通过下述方式而达成了该目标：将E3泛素连接酶(神经前体细胞在发育上被下调的蛋白4(neural precursor cell developmentally down-regulated protein 4；Nedd4-2或此后称为Nedd4L))的E6-AP羧基末端(HECT)催化结构域的同源物与Ca
泛素(Ub)是一种小的9kD的蛋白质，其作为翻译后修饰而共价附着至靶蛋白质。胞质溶胶Ub转移到蛋白质上是一个多步骤反应，其以介导Ub附着的最后步骤的称为E3泛素连接酶的一类酶结束。在人类基因组中存在超过600种E3泛素连接酶；该多样性可以部分地通过泛素密码子的多样性质来解释：Ub链通过随后将Ub添加到与靶蛋白质相结合的现存Ub上来形成。出现了复杂性，因为Ub本身具有7个可以潜在地被泛素化的赖氨酸残基(以及其N-末端甲硫氨酸)。所得的多聚泛素链的形状可以改变靶蛋白质的下游命运。例如，在体外已证明K48 E3连接酶将Ub添加到现存Ub的第48位残基上，形成K48多聚泛素链，其已被表征为关于靶蛋白质的蛋白体降解的信号。已经表征了关于泛素的另外的信号传导作用，例如协调质膜蛋白质的胞吞作用的K63分支。特别地，已充分表征了HECT家族连接酶Nedd4-2靶向质膜，在那里它介导许多包含PY的跨膜蛋白质例如ENaC、KCNQ1和NaV1.5的胞吞作用和最终溶酶体降解。
本公开内容尤其提供了用于遗传编码HVACC抑制剂的策略，从而提供了用于通过利用泛素途径来将疗法在空间上限制于某个组织或细胞群体的工具。根据一些实施方案，本公开内容的某些方面靶向β亚基并且利用泛素途径来从细胞表面上移除HVACC。
在一些实施方案中，本公开内容包含两个要素：1)新型纳米抗体，其能够结合所有四种Ca
为了将泛素机器引导至HVACC，在一些实施方案中，本公开内容提供了针对HVACC的辅助性β亚基(Ca
根据一些实施方案，本公开内容提供了用于通过与典型的HVACC阻断剂根本不同的机制来阻断所有HVACC的新型工具。在一些实施方案中，本公开内容的HVACC阻断剂可以用于治疗糖尿病和帕金森病，并且用作用于许多疾病的基因疗法方法。在一些实施方案中，本公开内容进行了遗传编码以在空间上准确地进行递送，从而使脱靶效应最小化。
根据一些实施方案，本公开内容提供了识别一些或所有Ca
根据一些实施方案，本公开内容提供了：1)用于在无需几种药理学试剂(包括昂贵的源自毒液的肽)的情况下阻断所有HVACC以取得相似功能效果的工具；2)用于取得HVACC阻断的遗传编码的工具，其可以靶向特殊组织并且可以经由腺病毒/AAV或转染方法进行递送，从而提供用于靶向特定组织的工具；3)通过选择性地靶向介导疼痛感觉的神经元群体的基因疗法；和4)可以用于将其他活性蛋白质部分靶向HVACC的纳米抗体归巢装置。
根据一些实施方案，本公开内容提供了遗传编码的HVACC阻断剂(与几种昂贵的药理学试剂不同)。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在特定细胞群体中选择性地下调HVACC的功能的基因疗法。
特别地，开发了二十五种独特的Ca
因此，本公开内容的一个实施方案为能够与Ca
在一些实施方案中，所述纳米抗体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:98。
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的E3泛素连接酶的催化结构域。在该情景下，术语“可操作地相连”意指，一个功能通过在例如单个多肽上与多肽序列的联合而被另一个事物所调节。
在一些实施方案中，所述组合物对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。在一些实施方案中，所述HVACC选自由下列各项组成的组：Ca
本公开内容的另一个实施方案为组合物，其包含遗传编码的钙通道阻断剂，所述遗传编码的钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)E3泛素连接酶的催化结构域。
在一些实施方案中，所述E3泛素连接酶包含Nedd4-2的催化结构域。在一些实施方案中，所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域是可操作地相连的，即在功能上相连接的。在该情景下，术语“可操作地相连”意指，一个功能通过在例如单个多核苷酸上与多核苷酸序列的联合而被另一个事物所调节。在一些实施方案中，表达所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域以形成连续多肽。在一些实施方案中，所述连续多肽对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。在一些实施方案中，所述HVACC选自由下列各项组成的组：Ca
本公开内容的一个进一步的实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触。
在一些实施方案中，所述细胞为神经元或心肌细胞。
本公开内容的另一个实施方案为选择性地靶向受试者中的细胞群体的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述细胞为介导疼痛感觉的神经元，或心肌细胞。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者为人。
本公开内容的另一个实施方案为用于在细胞中可诱导地抑制高电压激活钙通道(HVACC)的组合物，其包含：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1
在一些实施方案中，所述组合物对于实现所述HVACC的功能敲低来说是有效的。在该情景下，术语“功能敲低”意指使用试剂例如根据本公开内容的组合物来造成HVACC的正常功能(包括例如，使神经元兴奋，释放神经递质、激素，或者起始骨骼肌和心肌两者的收缩等)的短暂丧失。HVACC的“功能敲低”可以通过常规技术例如RT-qPCR来进行定量。
本公开内容的另外一个实施方案为组合物，其包含遗传编码的诱导型钙通道阻断剂，所述遗传编码的诱导型钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)在本文中所公开的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的来自蛋白激酶Cγ的C1结构域(C1
在一些实施方案中，表达所述纳米抗体和所述C1结构域以形成连续多肽。在一些实施方案中，编码(i)和(ii)的核酸被携带于表达载体上。在一些实施方案中，所述表达载体进一步包含组织特异性启动子。在本公开内容中，非限制性的示例性的组织特异性启动子包括例如，天然启动子例如B29启动子、CD14启动子、CD43启动子、CD45启动子、CD68启动子、结蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、内皮糖蛋白启动子、纤连蛋白启动子、flt-1启动子、GFAP启动子、GPIIb启动子、ICAM-2启动子、小鼠INF-β启动子、Mb启动子、NpshI启动子、OG-2启动子、SP-B启动子、SYN-1启动子、WASP启动子，和复合启动子例如SV40/bAIb启动子、SV40/hAIb启动子、SV40/CD43启动子、SV40/CD45启动子、NSE/RU5’启动子。
本公开内容的另一个实施方案为在细胞中阻断高电压激活钙通道(HVACC)的方法，其包括下列步骤：(i)使所述细胞与有效量的在本文中所公开的组合物相接触；和(ii)使所述细胞与蛋白激酶Cγ诱导试剂例如佛波醇-12,13-二丁酸酯(PdBu)相接触；其中步骤(i)和(ii)的接触对于将所述HVACC从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。如在本文中所使用的，术语“阻断”意指部分地或完全地干扰HVACC以便取得所希望的临床效果。
在一些实施方案中，所述细胞为神经元或心肌细胞。
本公开内容的另外一个实施方案为用于治疗或改善在受试者中疾病的影响的方法，其包括向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者为人。
在一些实施方案中，所述疾病与高电压激活钙通道(HVACC)的失调相关联。在一些实施方案中，所述HVACC选自由下列各项组成的组：Ca
在一些实施方案中，所述疾病选自由下列各项组成的组：心血管疾病、神经病学疾病及其组合。心血管疾病的非限制性例子包括：心绞痛、心肌梗死、中风、心力衰竭、高血压、心律失常、脑血管痉挛、风湿性心脏病、心肌病、异常心节律、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、心内膜炎、心肌炎、嗜酸性粒细胞性心肌炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病、静脉血栓形成及其组合。在一些实施方案中，所述心血管疾病选自由下列各项组成的组：高血压、心律失常、脑血管痉挛及其组合。
神经病学疾病的非限制例子包括：癫痫、慢性疼痛、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、动脉瘤、背痛、贝尔麻痹、脑和脊髓的出生缺陷、脑损伤、脑肿瘤、脑性瘫痪、慢性疲劳综合征、震伤、痴呆、颈和腰的椎间盘疾病、头晕、吉-巴综合征、头痛和偏头痛、多发性硬化、肌营养不良、神经痛、神经病、神经肌肉及相关疾病、严重抑郁、强迫症、脊柱侧凸、癫痫发作、脊髓损伤、脊柱畸形和病症、脊柱肿瘤、中风、眩晕及其组合。在一些实施方案中，所述神经病学疾病选自由下列各项组成的组：癫痫、慢性疼痛、帕金森病及其组合。
如在本文中所使用的，术语“治疗”及其语法变化形式意指使个体受试者经历这样的方案、制度、过程或治疗法，其中希望在那个受试者例如患者中获得生理学应答或结果。特别地，本公开内容的方法和组合物可以用于减缓疾病症状的发展或者延迟所述疾病或状况的开始，或者使疾病发展的进程停止。然而，因为每个经治疗的受试者可以对于特殊的治疗方案、制度、过程或治疗法不发生应答，因此治疗并不要求在每个受试者或受试者群体(例如患者群体)中取得所希望的生理学应答或结果。因此，给定的受试者或受试者群体(例如患者群体)可以对治疗没有应答或应答不足。
如在本文中所使用的，术语“改善”及其语法变化形式意指降低在受试者中疾病症状的严重性。
如在本文中所使用的，“受试者”为哺乳动物，优选地人。除了人之外，在本公开内容的范围内的哺乳动物类别包括例如农业动物、兽医学动物、实验室动物等。农业动物的一些例子包括牛、猪、马、山羊等。兽医学动物的一些例子包括狗、猫等。实验室动物的一些例子包括灵长类动物、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等。
如在本文中所使用的，术语“接触”意指使组合物和任选地一种或多种另外的治疗试剂与需要调节例如阻断或抑制HVACC活性的细胞密切接近。这可以通过使用向受试者递送药物的常规技术，或者在体外情况下通过例如向细胞所位于其中的培养基提供所述化合物和任选地其他治疗试剂来完成。
在本公开内容中，组合物的“有效量”或“治疗有效量”是此类组合物的这样的量，所述量在当向受试者施用或与细胞相接触时足以实现在本文中所描述的有益的或所期望的结果。有效剂型、施用方式和用药量可以凭经验来确定，并且做出这样的决定是在本领域技术的范围之内。本领域技术人员将会理解，用药量将会随施用途径，排泄速率，治疗持续时间，正在施用的任何其他药物的身份，受试者的年龄、尺寸和物种，以及例如医学和兽医学领域中熟知的类似因素而变化。通常，根据本公开内容的组合物的合适剂量将会是所述组合物的这样的量，其是对于产生所希望的效应(没有或具有最小的副作用)来说有效的最低剂量。根据本公开内容的组合物的有效剂量可以作为在整个一天中以适当间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量来进行施用。
根据本公开内容的组合物的用量的合适的、非限制性的例子为大约1ng/kg至大约1000mg/kg，例如大约1mg/kg至大约100mg/kg，包括大约5mg/kg至大约50mg/kg。本公开内容的组合物的其他代表性用量包括大约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg。
本公开内容的组合物可以以任何所希望的和有效的方式进行施用：用于口服摄入，或者作为用于向眼睛局部施用的软膏或滴剂，或者用于以合适的方式(例如，腹膜内、皮下、局部、真皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内或淋巴管内)的肠胃外或其他施用。进一步地，可以将本公开内容的组合物与其他治疗相联合地进行施用。可以对本公开内容的组合物进行包囊或者针对胃或其他分泌物进行保护(如果希望)。
提供下面的实施例以进一步举例说明本公开内容的方法。这些实施例仅是举例说明性的而不意在以任何方式限制本公开内容的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
蛋白质纯化
使用BacMam表达系统来纯化Ca
对于等温滴定量热法实验，将Ca
如先前所描述的(McMahon等人,2018)那样来纯化nb.F3：简而言之，收获细胞，并且将其重悬浮在100mL的包含(mM)500蔗糖、200Tris(pH 8)、0.5EDTA的缓冲液中并且通过在搅拌下添加200mL水来进行渗透压休克。将裂解物带至(mM)150NaCl、2MgCl
对于Ca
纳米抗体产生
对美洲驼进行免疫接种，其中进行600μg经纯化的Ca
等温滴定量热法
使用MicroCal Auto iTC 200(Malvern Panalytical)在25℃下进行等温滴定量热法测量。将样品透析入300mM NaCl,20mM HEPES,5％甘油,pH 7.5中，并且事先进行过滤。将2μL nb.F3注射入400μL的Ca
分子生物学和质粒构建
用位于其保守的构架(FW)区FW1和FW4侧翼的引物来对潜在的nb进行PCR扩增，并且使用HindIII和EcoRI位点将其插入哺乳动物表达质粒pcDNA3(Invitrogen)中。在PCR中包括额外的GSG连接体，并且将插入片段连接在增强型CFP和人PKCγ的C1结构域(残基51-180)的上游。
PCR扩增大鼠Ca
在pUC57载体中合成定制的双顺反子载体(xx-P2A-CFP)，其中将P2A肽的编码序列夹在上游多克隆位点和增强型青色荧光蛋白(CFP)(Genewiz)之间。通过PCR来扩增xx-P2A-CFP片段并且使用NheI/NotI位点克隆入PiggyBac CMV哺乳动物表达载体(SystemBiosciences)中。为了产生nb.F3-P2A-CFP，我们PCR扩增了nb.F3的克隆序列并且使用NheI/AflII位点将其克隆入xx-P2A-CFP中。在PiggyBac CMV哺乳动物表达载体中创建相似的骨架，其中CFP-P2A-xx包含在P2A位点下游的多克隆位点(Genewiz)。PCR扩增nb.F3并且用BglII/AscI位点连接入该载体中。PCR扩增由残基594-974组成的人Nedd4L的HECT结构域(Gao等人,2009)并且使用AscI/AgeI位点插入在nb.F3的下游。使用位点定向诱变来完成C942S的诱变。
获得了在结构域IV S5-S6细胞外环中具有两个串联的13残基银环蛇毒素结合位点(SWRYYESSLEPYPD)的α
细胞培养和转染
获得人胚肾(HEK293)细胞。细胞是无支原体的，如通过MycoFluor支原体检测试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)所测定的。将低传代HEK293细胞在37℃下在补充有5％胎牛血清(FBS)和100mg/mL的青霉素-链霉素的DMEM中进行培养。使用磷酸钙沉淀法来完成HEK293细胞转染。简而言之，将质粒DNA与7.75μL的2M CaCl
成年豚鼠心肌细胞的分离按照哥伦比亚大学动物护理和使用委员会(ColumbiaUniversity Animal Care and Use Committee)的指南来进行。在分离之前，用15μg/mL层粘连蛋白(Gibco)预包被铺板平皿。用5％异氟烷麻醉成年雌性Hartley豚鼠(CharlesRiver)，切下心脏，并且分离心室肌细胞，这通过使用Langendorff灌注设备首先在KH溶液(mM)：118NaCl、4.8KCl、1CaCl
获得鼠类背根神经节(DRG)神经元。如先前所描述的(Albuquerque等人,2009)那样来分离DRG神经元。将DRG神经元铺在包被有15μg/mL层粘连蛋白(Corning)的玻璃盖玻片上，并且维持在补充有1x B-27(Thermo Fisher Scientific)、100μg mL
胰腺β细胞分离和培养
获得来自与Rosa26-tdTomato(Jackson Laboratories Stock#007909)小鼠杂交的Rip-Cre(Jackson Laboratories Stock#003573)小鼠的鼠类胰腺β-细胞。如先前所描述的(Stull等人,2012)那样来分离胰岛，用0.05％胰蛋白酶EDTA(Gibco)进行分散，并且铺在用10mg/mL纤连蛋白(Sigma Aldrich)预包被的具有10mm微孔的35mm玻璃底平皿(Cellvis)上。将胰岛维持在补充有15％FBS和100μg mL
腺病毒产生
如先前所描述的(Kanner等人,2017；Subramanyam,2013)那样，使用pAdEasy系统(Stratagene)，按照制造商的说明书来产生表达GFP和CFP-P2A-nb.F3-Nedd4L[C942S]的腺病毒载体。用PmeI将包含关于CFP-P2A-nb.F3-Nedd4L[C942S]的cDNA的质粒穿梭载体(pShuttle CMV)线性化，并且电穿孔入用pAdEasy-1病毒质粒(Stratagene)预先转化的BJ5183-AD-1电感受态细胞中。将PacI限制酶切消化用于鉴定重组成功的转化体。使用XL-10-Gold细菌来扩增阳性重组体，并且通过PacI消化来使重组腺病毒质粒DNA线性化。用经PacI消化的经线性化的腺病毒DNA转染以70-80％汇合在60mm直径平皿中培养的HEK细胞。就致细胞病变效应(CPE)和腺病毒空斑来监测经转染的平板。收获细胞并且使其经历三个连续的冷冻-解冻循环，随后进行离心(2,500×g)以去除细胞碎片。将上清液(2mL)用于感染10cm平皿的90％汇合的HEK293细胞。在2-3天后观察到CPE之后，将细胞上清液用于再次感染HEK293细胞的新平板。病毒扩展和纯化如以先所描述的(Colecraft等人,2002)那样来进行。简而言之，用如上面所描述的那样获得的病毒上清液(1mL)感染在15cm培养平皿(x8)上生长的汇合的HEK293细胞。在48小时后，收获来自所有平板的细胞，通过离心形成粒状沉淀，并且重悬浮在8mL的包含(以mM)20Tris HCl、1CaCl
总和表面钙通道的流式细胞术测定法
如先前所描述的(Kanner等人,2017；Aromolaran等人,2014)那样，通过流式细胞术在活的、经转染的HEK293细胞中测定细胞表面和总离子通道池。简而言之，在转染后48小时，用包含Ca
电生理学
使用由Pulse软件(HEKA)控制的EPC-10膜片钳放大器(HEKA Electronics)，在转染后48小时进行HEK293细胞的全细胞记录。使用P97微电极拉制器(Sutter Instruments)从1.5mm薄壁玻璃(World Precision Instruments)制备微量移液管。内部溶液包含(mM)：135甲磺酸铯(CsMeSO
在感染后48小时进行心肌细胞和DRG神经元的全细胞记录。将HEK细胞内部和外部溶液用于DRG实验。对于豚鼠心肌细胞的全细胞记录使用包含(mM)下列成分的内部溶液：150CsMeSO
免疫荧光染色
腺病毒感染后大约48小时，在室温下在4％低聚甲醛(wt/vol,在PBS中)中固定豚鼠心肌细胞20分钟。用PBS洗涤细胞两次，然后在室温下在0.1M甘氨酸(在PBS中)中温育10分钟以封闭游离的醛基团。然后，将经固定的细胞在室温下用0.2％Triton X-100(在PBS中)渗透化20分钟。通过在室温下在包含3％(vol vol
共聚焦显微术
将细胞铺在35mm MatTek成像平皿(MatTek Corporation)上。在Nikon A1RMP共聚焦显微镜上用40x油浸物镜(1.3N.A.)来捕获图像。分别使用458、488、514和639nm激光线来对CFP、Alexa-488、YFP和Alexa-647进行成像。
Pulldown测定法
将在60mm平皿中培养的经转染的HEK293细胞收获于PBS中，以2,000g(4℃)离心5分钟，将粒状沉淀重悬浮在RIPA裂解缓冲液中，该RIPA裂解缓冲液包含(mM)：150NaCl、20Tris HCl、1EDTA、0.1％(wt vol
对于Ca
钙成像
将DRG神经元在包含(mM)：145NaCl、5KCl、2CaCl
用类似的实验方案对胰腺β-细胞进行成像。将细胞维持在包含(mM)下列成分的基础KRBH溶液中：134NaCl、3.5KCl、1.2KH
数据和统计学分析
使用FloJo、PulseFit(HEKA)、Microsoft Excel、Origin和GraphPad Prism软件离线分析数据。使用内置函数在Origin或GraphPad Prism中进行统计学分析。对于两个组之间的比较使用Student t检验或者对于三个组之间的比较使用单因素ANOVA来确定平均值之间的统计学上显著的差异(p<0.05)，其中采用Tukey事后分析。数据以“平均值±s.e.m.”呈现。
实施例2
Ca
本公开内容开发了靶向Ca
采用小分子诱导的荧光共转位测定法来同时测定：(1)当在哺乳动物细胞中表达时，独个纳米抗体是否表现良好(即，不聚集)，和(2)是否结合Ca
对于总体策略来说重要的是，nb.F3掺入经装配的HVACC复合物中而不影响通道功能或亚基稳定性。使用流式细胞术测定法来评估nb.F3对于重组Ca
为了检查nb.F3对于Ca
最后，使用膜片钳电生理学来评价nb.F3对于通过在HEK293细胞中重构的重组Ca
总之，这些结果表明，nb.F3在细胞中结合β
实施例3
F3-Nedd4L嵌合蛋白对于Cav1/Cav2通道的强有力的功能影响
假设将E3泛素连接酶的催化结构域融合至nb.F3将会产生遗传编码的分子，其通过降低它们的表面密度来抑制Cav1/Cav2通道(Kanner等人,2017)。因此，通过将Nedd4L的催化性HECT结构域融合至nb.F3的C-末端来产生嵌合构建体(nb.F3-Nedd4L)。我们还产生了该嵌合构建体的在催化上无作用的突变体(nb.F3-Nedd4L[C942S])，以区分泛素化依赖性和非依赖性效应。这两种构建体均在P2A-CFP表达载体中产生，从而使得能够使用CFP荧光来确证蛋白质表达。
在模拟对于nb.F3所描述的那些的实验中，检查了nb.F3-Nedd4L和nb.F3-Nedd4L[C942S]对于重构的Ca
鉴于nb.F3-Nedd4L对于通道的表面群体的引人注目的效应而不影响Cavβ的总水平，接下来评估nb.F3-Nedd4L对于总α
最后，检查了nb.F3-Nedd4L对于重构的Ca
鉴于其通过经功能化的Ca
实施例4
在心肌细胞中内源性Ca
接下来测定Ca
在心肌细胞中的Ca
相比于未感染的或表达nb.F3-Nedd4L[C942S]的细胞而言，表达Ca
实施例5
在背根神经节(DRG)神经元和胰腺β细胞中的Ca
接下来测试Ca
使用全细胞膜片钳来进一步表征Ca
最后，测试了Ca
实施例6
讨论
本公开内容介绍了作为新型的遗传编码的分子的Ca
Ca
Ca
用小分子阻断特定HVACC的活性是用于许多心血管疾病和神经病学疾病(包括疼痛、高血压、心律失常、癫痫和帕金森病)的盛行或有潜力的疗法(Zamponi,2016)。用于HVACC的小分子或毒素阻断剂的限制是脱靶效应的倾向，这归因于当施用给患者时其不可避免的广泛分布。在一些情况下，这样的脱靶效应可能限制治疗窗，从而足以不利地影响治疗效力。遗传编码的HVACC抑制剂具有很大的潜力成为有用的治疗剂，优点是其表达可以被限制于靶组织/细胞类型，或者甚至在单个细胞内在空间上离散的通道(Murata等人,2004；Makarewich等人,2012)。鉴于其在使HVACC活性沉默方面的效能，Ca
最后，一个令人兴奋的前景是Ca
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在本申请中所引用的所有文献均通过提及而合并入本文，如同在本文中全文记述一样。
虽然在本文中已描述了本公开内容的举例说明性实施方案，但是应当理解，本公开内容并不限于所描述的那些，并且可以由本领域技术人员做出各种其他变化或修饰而不背离本公开内容的范围或精神。
序列表
<110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK
<120> 用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通道阻断剂的组合物和方法
<130> Provisional
<140> US 62/883,637
<141> 2019-08-06
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 1
Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 2
Val Ser Cys Phe Ser Ser Ser Asp Gly Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 3
Ile Glu Gly Met Arg Ile Ser Pro Val Val Thr Gly Ile Pro Ala Phe
1 5 10 15
Asp Phe Gly Ser
20
<210> 4
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 4
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
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Ser Cys Phe Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Asp Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Ala Phe Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 5
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 6
Ile Ser Trp Ser Gly Gly
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
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<220>
<223> 纳米抗体
<400> 7
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<220>
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<400> 8
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<223> 纳米抗体
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 69
Cys Ala Val Gly Gly Asp Trp Arg Val Tyr Asp Ile Ser Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
Thr Ala His Gln Tyr Glu
20
<210> 70
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ala Ser His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Gly Gly Asp Trp Arg Val Tyr Asp Ile Ser Phe Tyr Tyr Thr
100 105 110
Ala His Gln Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 71
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn Ala
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 72
Ile Ser Trp Ser Gly Arg Asn
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 73
His Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Ser Ala Leu Ala
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<210> 74
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 74
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 75
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Phe Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 76
Ile Thr Trp Ser Arg Gly Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 77
Gly Leu Trp Arg Tyr Tyr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Thr Glu Asp Arg
1 5 10 15
<210> 78
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 79
Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Ile
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<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 80
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 81
Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 82
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
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Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Asp Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val
100 105 110
Glu Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 83
Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 84
Ile Asp Trp Ser Gly Gly Thr Ala Ser His
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 85
Ser Ser Tyr Trp Ser Arg Ser Val Asp Glu
1 5 10
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 86
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 87
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 88
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 89
Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Asp Asp
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<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 90
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
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Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
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Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Glu Arg Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 91
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr Ala Ile Gly
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 92
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 93
Thr His Glu Gln Val Trp Lys Thr Leu Phe Ser Ser Cys Thr Val Glu
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 94
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
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Ser Ser
130
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 95
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
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<211> 10
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<220>
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<220>
<223> 纳米抗体
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1 5 10
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体
<400> 98
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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