基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置

技术领域

本发明属于光学超分辨荧光显微成像领域，特别涉及到一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置。

背景技术

在生物医学成像和生命科学研究领域，超分辨荧光成像一直是研究的重点，但受限于衍射极限，其光学分辨率仅为荧光的半波长，使得细胞内更精细的结构无法分辨。因此，近几十年来，科学家们致力于对荧光显微镜分辨率的提升，近年来主流的两类超分辨荧光显微技术是单分子定位技术和结构光照明技术。

单分子定位技术利用特殊荧光染料的稀疏发光特性，每次仅令部分单分子发射荧光，通过拍摄大量稀疏发光单分子图片合成重构出一张超分辨图像。如公开号为CN109407293A的专利申请提供的单分子定位装置，由于单张图片发光单分子分布稀疏，可以利用拟合定位的方法将分辨率提升至10nm量级，然后利用多帧图像的叠加实现超分辨图像重构。这种方法要求荧光标记密度较高，需要特殊染料，而且成像速度慢。

结构光照明技术通过调制照明光激发荧光样品，在傅里叶域对图像频谱进行处理，将普通显微镜无法观测到的高频分量移动到低频范围内，利用多帧图像解算出扩大的样品频谱从而提高图像分辨率。如公开号为CN107907981A的专利申请提供的三维结构光照明超分辨显微成像装置，结构光照明显微镜需要获取的图像数量较少，成像速度高，适用于实时活体细胞成像；所需荧光标记密度较低，无需特异荧光染料，但受限于原理最多只能提升一倍分辨率，大约在100nm量级。

发明内容

本发明提供了一种基于三维照明的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置。本装置将结构光照明技术与单分子荧光成像技术结合，并引入双物镜结构提升接收荧光的能力，使分辨率可以在单分子显微成像技术的基础上提升3倍以上，实现优于5nm的超高分辨率，对亚细胞结构的观测具有重要意义。

本发明本质上仍是一种单分子定位超分辨技术，提升分辨率的核心在于引入调制照明条纹，无需在频域计算，只需通过发光的单个分子能量在条纹移相过程中的强度变化计算出该分子在条纹中的相对位置从而得到相比传统单分子拟合定位法更高的定位精度，实现分辨率的进一步提升。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

所述激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束用于激发荧光；

分束与扫描系统，用于将激光光束分为独立选通或截止的四束线偏振光，并进行成像位置扫描及改变光程差；

双物镜系统，用于将激发光分成对称的两组在像面上干涉并收集荧光；

所述的成像光路模块包括依次布置的：

相位调制系统，用于将两路荧光按照s和p偏振分为四束干涉光且引入指定的相位延迟；

相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述的分束与扫描系统和相机，以精确的时序分别改变干涉条纹相位、方向和拍照，并处理采集的数据，得到超分辨图像。

优选的，所述分束与扫描系统包括：

第一电光调制器和第一偏振分束器，激光器发出的激光光束经过第一电光调制器调整偏振方向后被第一偏振分束器分为两路，第一电光调制器通过控制偏振方向实现两路光的选通与截止；

位于所述第一偏振分束器反射光路上的第二电光调制器和第二偏振分束器，第一偏振分束器的反射光由第二偏振分束器分为两路；

位于所述第一偏振分束器透射光路上的第三电光调制器和第三偏振分束器；第一偏振分束器的透射光由第三偏振分束器分为两路。

本发明中，第二、三电光调制器用于对入射光快速引入指定的相位延迟，配合所述的第二、三偏振分束镜可以实现透射和反射光路的快速选通与截止。

优选的，所述第二偏振分束器的反射光路或透射光路上设置第一压电陶瓷驱动的反射镜，用于改变改变光程差来调整干涉条纹相位；所述第二偏振分束器的反射光路和透射光路上分别设置有第一扫描振镜和第二扫描振镜；所述第三偏振分束器的反射光路或透射光路上设置第二压电陶瓷驱动的反射镜，用于改变改变光程差来调整干涉条纹相位；所述第三偏振分束器的反射光路和透射光路上分别设置有第三扫描振镜和第四扫描振镜。四个扫描振镜均有一对电控摆扫镜上下交错组成，可以实现出射光束一定角度内的精确控制，通过光线扫描实现干涉条纹周期的改变。

优选的，所述第一扫描振镜和第二扫描振镜的出射光路上设置有用于光束合束的第一分束器；所述第三扫描振镜和第四扫描振镜的出射光路上设置有用于光束合束的第二分束器；所述第一分束器和第二分束器的出射光被第三分束器反射和透射进入所述的双物镜系统。

第一、二分束器用于将第二、三偏振分束镜分开的光合束，所述的第三分束镜用于将第一偏振分束镜分开的光合束并进一步分为强度相等的两路，最终进入双物镜系统实现干涉条纹生成。

优选的，所述双物镜系统包括设置在成像位置上下的下物镜和下物镜，所述第三分束器的反射光和透射光分别经下物镜和下物镜产生照明样品的干涉条纹。

优选的，设置有一漂移校正系统，所述漂移校正系统包括：监测激光器，发出940nm的监测激光；探测器，穿过所述下物镜和下物镜的监测激光汇聚在探测器上；双物镜压电调整台组，用于根据所述探测器上的光斑形状校正下物镜和下物镜姿态。

优选的，所述相位调制系统包括分别设置在下物镜荧光光路和上物镜荧光光路上的第一索雷巴比涅补偿器和第二索雷巴比涅补偿器，用于在下物镜和上物镜收集的荧光中引入可控的相位差。

优选的，所述相位调制系统的出射光路上设置有第四分束器，上下物镜收集的偏振荧光分束为上光路s干涉光、上光路p干涉光、下光路s干涉光和下光路p干涉光；

s干涉光和上光路p干涉光与下光路s干涉光和下光路p干涉光经不同的反射镜进入第四偏振分束器，下光路p光反射进入下光路、下光路s光透射进入上光路、上光路p光反射镜进入上光路、上光路s光透射进入下光路；上光路和下光路的四束干涉光被相机接收。

本还发明还提供一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法，包括步骤：

1)激光光束分为可独立快速选通或截止的四束线偏振光；

2)四束线偏振光经过分束器后分为等光强的两部分，经过两个上下对称装配的物镜后在样品平面发生干涉，形成调制照明的条纹图样；

3)样品在照明调制情况下产生的荧光被双物镜接收经过分束和相位延迟系统后在探测器平面形成四幅相位差依次为Π/2的图像，同时被相机接收；

4)依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；

5)在一个单分子发光期间采集不同照明调制下的多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

本发明的方法将单分子显微成像技术与结构光照明技术结合，在空间不同方向上通过记录干涉条纹相位变化引起的单分子发光强度变化计算单分子在干涉条纹中的相对位置，从而显著提升成像分辨率。

优选的，根据需求选择照明调制图像的拍摄数量，每个方向需要三次改变干涉条纹的相位，即二维分辨率提升需要六帧数据(24幅子图像)、三维分辨率提升需要九帧数据(36幅子图像)。

本发明的装置采用模块化设计为系统预留了多功能应用接口，可以方便的改为4pi结构光照明显微成像系统和4pi单分子显微成像系统。装置采用压电陶瓷驱动的反射镜通过改变光程差的方式实现照明条纹的相位移动，采用电光调制器与偏振分束器的组合实现照明条纹方向的快速选通，采用扫描振镜实现三个维度照明条纹的切换与干涉条纹周期的调节。

本发明提升成像分辨率的原理如下：

传统单分子显微成像技术是利用特殊荧光染料让样品稀疏随机发光，即每一张所拍摄的图像只有部分分子在发光且它们互相之间距离较远，因此可以用拟合的方法获得单个分子的精确位置，拍摄大量图像并计算每张图像中单分子的位置坐标，最终将所有单分子坐标绘制在一张高分辨图中实现超分辨图像的重构。这种技术的分辨率与单分子发光强度有关，发光强度(照明光强度)越高，则分辨率越高。由于过高的激发光光强会带来光漂白、光毒性等一系列问题，甚至会给样品细胞带来不可逆的损伤，因此单分子技术的分辨率一直难以降到10nm以下。鉴于此，为了在不提高激发光强的前提下提高分辨率，本发明提出的成像方法引入了调制照明机制来激发荧光。

通过硬件控制形成呈亮暗相间的正弦干涉条纹，条纹强度越高则激发出的荧光强度越高。对于任意一个随机发光的单分子，在其发光期间改变三次干涉条纹的相位将在相机上依次获得三个随照明强度变化的亮度值。通过三个亮度数值可以拟合出该发光分子在干涉条纹中的相对位置，从而计算出其准确位置坐标。为了保证能够准确的在多个图像中定位同一单分子，计算其在条纹中相对位置之前需要获取其粗略位置。在横向上(x,y)，利用传统单分子拟合定位的方法获取粗定位(x,y)坐标；在轴向上(z)，利用探测模块相位调制系统产生的四幅子图像计算发光单分子的相位，将相位结算成光程差从而得出其偏离像面(z＝0)位置的距离从而获取粗定位z坐标。

作为优选的，每一个维度需控制干涉条纹相移0°、120°和240°。此处仅限于作为最优的实例，从理论上来说，相移角度可以是任意的数值，满足相移角度不同即可；作为可选的，二维干涉条纹可用于二维分辨率提升，三维干涉条纹可用于三维分辨率提升。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)将结构光照明技术与单分子技术相结合，相比于传统单分子定位技术，成像分辨率提升3倍以上；

(2)本装置除用于本专利所述方法外，还可适用于4pi结构光照明显微成像和4pi单分子显微成像等宽场显微成像相关的实验研究；

(3)采用电光调制器与偏振分束器的组合实现照明条纹方向的快速选通，采用扫描振镜实现三个维度照明条纹的切换与干涉条纹周期的调节，提高了系统成像速度。

附图说明

图1为本发明一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像装置示意图；

图2为双物镜后焦面成像位置与干涉条纹示意图；

图3为双物镜系统物镜姿态监测光路示意图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

如图1所示的双物镜单分子荧光显微成像装置，包括：激光器1、单模保偏光纤2、第一电光调制器3、第一偏振分束器4、第二电光调制器5、第二偏振分束器6、第一半波片7、第一反射镜8、第二反射镜9、第一扫描振镜10、第一压电陶瓷驱动的反射镜11、第三反射镜12、第二扫描振镜13、第一分束器14、第二电光调制器15、第三偏振分束器16、第二半波片17、第四反射镜18、第五反射镜19、第三扫描振镜20、第二压电陶瓷驱动的反射镜21、第六反射镜22、第四扫描振镜23、第二分束器24、第三分束器25、第一二向色镜26、第一筒镜27、下物镜28、第二二向色镜29、第二筒镜30、上物镜31、双物镜压电调整台组32、第七反射镜33、第八反射镜34、第一索雷巴比涅补偿器35、第二索雷巴比涅补偿器36、第四分束器37、第九反射镜38、第十反射镜39、第四偏振分束器40、第十一反射镜41、第十二反射镜42、三角反射棱镜43和相机44。

本实施例的双物镜单分子荧光显微成像装置主要包括激发光路模块和成像光路模块。

激发光路模块包括依次布置的：激光器1，发出激光光束用于激发荧光；分束与扫描系统，用于将激光光束分为独立可快速选通或截止的四束线偏振光用于生成干涉条纹，并可以通过成像位置扫描改变干涉条纹周期、通过光程差调控改变干涉条纹相位；双物镜系统，用于将激发光分成对称的两组在像面上生成干涉条纹，并收集荧光。

成像光路模块包括依次布置的：相位调制系统，用于将两路荧光按照s和p偏振分为四组干涉光，且引入指定的相位延迟；相机44，用于收集所述的荧光强度信号；计算机，用于控制分束与扫描系统和相机44，以精确的时序分别改变干涉条纹相位、方向和采集数据，并对采集数据进行处理，得到超分辨图像。

本实施例中，分束与扫描系统包括：

依次设置的第一电光调制器3和第一偏振分束镜4，第一电光调制器3用于对入射光快速引入指定的相位延迟，配合第一偏振分束镜4可以实现透射和反射光路的快速选通与截止；第一偏振分束镜的反射和透射光路采用完全对称分布；

依次设置在第一偏振分束镜4反射和透射光路上的第二电光调制器5和三电光调制器15、第二三偏振分束镜6和三偏振分束镜16；第二、三电光调制器用于对入射光快速引入指定的相位延迟，配合第二、三偏振分束镜可以实现透射和反射光路的快速选通与截止；

依次设置在第二偏振分束镜6和三偏振分束镜16透射光路上的第一半波片7、第二半波片17、第一反射镜8、第二反射镜9和第四反射镜18、第五反射镜19、第一扫描振镜10和第三扫描振镜13；半波片用于将入射线偏振光的偏振方向旋转90度从而与第二、三偏振分束镜反射光偏振方向相同达到提升干涉对比度的作用；反射镜用于折转光路将光线入射到所述的扫描振镜上；扫描振镜有一对电控摆扫镜上下交错组成，可以实现出射光束一定角度内的精确控制，通过光线扫描实现干涉条纹周期的改变；

依次设置在第二、三偏振分束镜反射光路上的第一压电陶瓷驱动的反射镜11、第二压电陶瓷驱动的反射镜21、第三反射镜12、第六反射镜22、第二扫描振镜13、第四扫描振镜23；除一个反射镜增加压电驱动器外与第二、三偏振分束镜透射光路完全相同且对称分布；压电陶瓷驱动的反射镜用于折转光路将光线入射到所述的扫描振镜上实现光线扫描，并可改变光程差使干涉条纹产生相位移动，对称分布设计为了使两光路光程差尽可能小从而更容易在像面实现照明干涉；

依次设置的第一分束器14、第二分束器24和第三分束器25，第一、二分束器用于将第二、三偏振分束镜分开的光合束，第三分束镜用于将第一偏振分束镜分开的光合束并进一步分为强度相等的两路，最终进入双物镜系统实现干涉条纹生成。

激光器1和分束与扫描系统之间依次放置有高功率单模保偏光纤2，用于将激光器1发出的高功率线偏振激光传递到分束与扫描系统内且保证其线偏振特性。

激光器1发出的线偏振光经过单模保偏光纤2进入系统中，经过第一电光调制器3调整偏振方向后被第一偏振分束器4分为两路，第一电光调制器可以通过控制偏振方向实现两路光的选通与截止。

双物镜系统包含下物镜28、上物镜31和双物镜压电调整台组32，用于根据双物镜姿态的监控实时反馈调节双物镜以保证其对准精度；双物镜系统包含第一二向色镜26和第二二向色镜29，二向色镜用于将照明激光的波长反射进入物镜且透过从物镜收集到的荧光使其进入探测模块。

相位调制系统包括：依次设置的第一索雷巴比涅补偿器35，第二索雷巴比涅补偿器36，第四分束镜37，第九反射镜38、第十反射镜39，第四偏振分束镜40，第十一反射镜41，第十二反射镜42和三角反射棱镜43；第一、第二索雷巴比涅补偿器对称放置于上下光路中，用于在s偏振光和p偏振光中引入可调的相位差；第四分束镜37置于上下光路交汇处，用于分别将上下光路中的偏振光分为光强相等的两部分，此时分束镜透射和反射光路中包含各自干涉的s和p偏振光；第九、第十反射镜分别将分束镜透射和反射光反射至所述的偏振分束镜处；第四偏振分束镜分别透射和反射各自干涉的s和p偏振光，经由第十一、第十二反射镜错开微小的角度，形成空间上不重叠的四幅具有相位延迟的干涉图像；三角反射棱镜43将四束干涉图像引入相机中。

本实施例中，根据上述的装置，具体实施过程如下：

激光器1发出的线偏振光经过单模保偏光纤2进入系统中，经过第一电光调制器3调整偏振方向后被第一偏振分束器4分为两路，第一电光调制器可以通过控制偏振方向实现两路光的选通与截止。

第一偏振分束器4的反射光进入第二电光调制器5和第二偏振分束器6后继续被分为两路，第二电光调制器同样起到快速选通两路光的作用。第二偏振分束器的透射光经过第一反射镜8和第二反射镜9入射至第一扫描振镜10，第二偏振分束器的反射光经过第一压电陶瓷驱动的反射镜11和第三反射镜12入射至第二扫描振镜13，其中四个反射镜的作用是调节光路指向，确保光线垂直入射到扫描振镜上，特别的压电陶瓷控制的反射镜还可以通过驱动反射镜沿径向实现波长量级位移改变光程差从而起到调整干涉条纹相位的作用。扫描振镜可以在一定角度范围内快速精确控制光线反射方向，配合电光调制器快速选通截止光路可以起到切换干涉条纹方向的作用，两个扫描振镜的出射光通过第一分束器14合束继续传播至第三分束器25。

第一偏振分束器4的透射光进入第三电光调制器15和第三偏振分束器16后也被分为两路。第一偏振分束器4的透射光路与反射光路完全对称分布，第三扫描振镜20和第四扫描振镜23的出射光经第二分束器24合束后继续传播至第三分束器25与第一扫描振镜和第二扫描振镜的光合为一束并被第三分束器25分为两束。

第三分束器25的反射光和透射光中包含了四个扫描振镜的出射光，分别经过第一二向色镜26、第一筒镜27和第二二相色镜29、第二筒镜30汇聚在下物镜28和上物镜31的后焦面上。二相色镜的作用是将照明模块中照明波长的光反射进入物镜，将物镜收集的荧光波长的光透射进入探测模块。二向色镜透过的光分别经过第七反射镜33和第八反射镜34进入探测模块。

下物镜荧光和上物镜荧光分别经过第一索雷巴比涅补偿器35和第二索雷巴比涅补偿器36引入可控的相位差

系统工作之前，需要提前标定扫描振镜出射角度对应的物镜后焦面成像位置，物镜后焦面成像位置对应的干涉条纹示意图如图2所示，当物镜成像光斑沿纵向排布时产生横向干涉条纹，当物镜成像光斑沿横向排布时产生纵向干涉条纹，当双物镜成像光斑位于后焦面中心时产生轴向干涉条纹。改变成像光斑间距可以调整干涉条纹周期，作为优选的，成像光斑距离物镜后焦面边缘越近干涉条纹间隔越小，对成像分辨率提升越大。完成扫描振镜标定后，可以通过扫描振镜与电光调制配合实现不同方向干涉条纹的快速切换。

系统工作时，扫描振镜与电光调制器控制产生某方向的干涉条纹，压电陶瓷驱动反射镜移动进行三步移相，期间拍摄三幅图像(每幅图像包含四幅子图像)；扫描振镜与电光调制器控制切换干涉条纹方向，压电陶瓷驱动反射镜移动进行三步移相，期间拍摄三幅图像；如此反复操作，采集大量照明调制下的图像。可选的，由于本系统分辨率高，对物镜对准精度要求高，长时间拍摄时物镜姿态漂移对图像恢复精度影响较大，引入如图3所示漂移校正系统。将原系统中的第七反射镜33和第八反射镜34换成第三二向色镜47和第四二向色镜46，它们对荧光仍然起到反射镜的作用，可以透过940nm的监测激光。激光器45发出940nm激光，穿过四个二向色镜、双物镜和两个筒镜后经过成像镜48与柱面镜49汇聚在探测器50上。当双物镜姿态改变时，探测器50上所拍摄到的光斑会产生变化，通过相关算法可以解算出不同类型姿态漂移对应的光斑改变情形从而指导物镜姿态校正。系统工作过程中，实时监控探测器50上的光斑形状，将计算的物镜偏移量输入给压电调整台组32对物镜姿态进行实时校正。

系统工作后，以三个方向共九帧数据(36幅子图像)为一组，计算出一组分辨率提升的单分子数据，通过大量的数据叠加可以恢复出一张分辨率提升3倍以上的超分辨图像。

在另一个实施例中，提供一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法，包括步骤：

1)激光光束分为可独立快速选通或截止的四束线偏振光；

2)四束线偏振光经过分束器后分为等光强的两部分，经过两个上下对称装配的物镜后在样品平面发生干涉，形成调制照明的条纹图样；

3)样品在照明调制情况下产生的荧光被双物镜接收经过分束和相位延迟系统后在探测器平面形成四幅相位差依次为Π/2的图像，同时被相机接收；

4)依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；

5)在一个单分子发光期间采集不同照明调制下的多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

本实施例中的方法可以依据上述的装置实施例，也可以基于上述装置实施例的变动或修改的其他系统实施。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。