一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法和应用。

背景技术

生物智能材料是一类通过温度、pH值或磁场等参数变化以达到其功能化的材料。其中，智能水凝胶与生物组织相似，具有良好的生物相容性，组织工程支架、药物缓释载体等被广泛应用于生物医学领域，近年来备受关注。

卡波姆是由聚烷基蔗糖或聚烷基季戊四醇与丙烯酸交联形成的高分子聚合物。为白色疏松的颗粒性粉末、干燥性强、吸湿能力较强、带有很强的静电，由于其内部结构中含52％-68％的羧酸基团，因此呈酸性性质，可溶于乙醇、水和甘油等多种流动性液体，具备胶体等流动性产品所有的特点。卡波姆与水接触前，聚丙烯酸卷曲，当其粉末与水融合时，卷曲的分子链缓慢松开，在pH为2.5-3.0的水分散体中可使用碱性的物质中和卡波姆，卡波姆的羧基离子化，随后形成凝胶。通过碱性溶液改变卡波姆溶胶的pH值后形成凝胶，因此可以很好地负载药物，包埋的药物可以通过自由扩散到人体组织，实现有效地可控释放，这种特性使其在药物传递、组织工程和细胞膜工程等方面都取得了新的进展。同时卡波姆具有良好的凝合性、乳化性、可溶性、增稠性、助悬性和成膜性。

带负电荷的生物蛋白是一种氨基酸序列较短的短肽，且含有三个天冬氨酸残基，不含碱性氨基酸残基，具有阴离子特性，因此本身带负电荷，可以提供一种带负电荷的生物蛋白。Na

本申请利用Na

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶，即得到带负电荷的生物蛋白凝胶敷料。

进一步的，步骤S1中所述搅拌的速率为200rpm/min，搅拌时间为30min。

进一步的，步骤S2中所述搅拌的温度为50℃，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为90-120s。

进一步的，步骤S4中所述搅拌的速率为200-400rpm/min，搅拌时间为1-2min。

进一步的，步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

进一步的，所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

进一步的，一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法和应用，带负电荷的生物蛋白具有良好的组织相容性和生物活性，Na

附图说明

图1为1％的带负电荷的生物蛋白-盐溶液和1％的卡波姆水溶胶形成的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶示意图。其中(a)为带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶，(b)为带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

图2为1％的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液和1％的卡波姆水溶胶形成的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶示意图。其中(a)为盐溶液浓度0.1mol/L的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；(b)为0.2mol/L的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；(c)为0.4mol/L的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；(d)为0.6mol/L的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；(e)为0.8mol/L的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；(f)为1mol/L的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

图3为不同配比的带负电荷的生物蛋白-盐溶液和卡波姆水溶胶形成的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶示意图。其中(a)为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶，(b)为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

图4为不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液和卡波姆水溶胶形成的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的细胞增殖情况数据图。

图5为不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液和卡波姆水溶胶形成的1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的带负电荷量统计数据图。

图6为不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液和卡波姆水溶胶形成的10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶带负电荷量的统计数据图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将7.16g的Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为1min，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

在本发明实施例中，对不同配比、不同浓度的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶进行电位测定。其中1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的盐溶液浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1mol/L，10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的盐溶液浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1mol/L。参考图1，由图1可知，带负电荷的生物蛋白-卡波姆体系本身是水溶胶，当加入0.2mlNaOH溶液改变体系pH值时，带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶会实现从“溶胶-凝胶”的转变。带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶在低于成凝胶临界pH值时，呈透明流动的溶胶状态，在高于成凝胶临界pH值时，呈现出白色透明凝胶状态，说明带负电荷的生物蛋白的加入并不影响卡波姆水凝胶的宏观形貌。

实施例2

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将7.16g的Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，搅拌速率为400rpm/min，搅拌时间为1min，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

在本发明实施例中，参考图2，由图2可知，当带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶中加入的Na

实施例3

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将7.16g的Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为1min，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

在本发明实施例中，参考图3，由图3可知，当往1％的卡波姆水凝胶中加入1％和10％的带负电荷的生物蛋白-盐溶液时，不同配比的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶在形貌上没有明显差异。

实施例4

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将7.16g的Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，搅拌速率为400rpm/min，搅拌时间为2min，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

在本发明实施例中，参考图5和图6，通过加入不同浓度的Na

实施例5

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将7.16g的Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，搅拌速率为400rpm/min，搅拌时间为2min，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

实施例6

S1：将0.05g的卡波姆粉末溶于5ml去离子水中，于室温下充分搅拌，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，得到1％的卡波姆水溶胶；

S2：将7.16g的Na

S3：将1mg/ml的带负电荷的生物蛋白加入到不同浓度的Na

S4：将S3步骤得到的不同浓度的带负电荷的生物蛋白-盐溶液以1％和10％的比例分别加入到1％的卡波姆水溶胶中，于室温下用磁力搅拌器搅拌混合，搅拌速率为300rpm/min，搅拌时间为1.5min，得到带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶；

S5：将0.2ml的NaOH溶液加入到掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶中，成胶时间为30min，得到1％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶；掺杂带负电荷的生物蛋白-盐溶液百分比为10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水溶胶自成凝胶，成胶时间为10s，得到10％的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶。

步骤S3中所述带负电荷的生物蛋白，氨基酸序列为DEDDD。

所述带负电荷的生物蛋白包括GMAP2、AP1、MaximinH5多肽。

一种带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料在治疗HPV中的应用。

实施例7

采用人包皮成纤维细胞(HFF)体外培养实验评估经上述实施例1得到的带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的细胞毒性。

利用CellCountingKit-8试剂盒检测带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的细胞毒性。具体操作方法如下：

(1)取指数生长期的HFF细胞，用胰酶消化后，调整细胞浓度以2×104cells/mL的浓度接种到96孔板中，然后将100μL混合溶液添加到96孔板中，并在37℃，5％(v/v)CO2下孵育；

(2)弃去96孔板中培养基，加入配制含有0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/mL水凝胶的DMEM培养基，每一个浓度设置3个复孔，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；

(3)弃去96孔板中培养基，培养基中添加10％的CCK-8溶液替换原培养基，并在37℃细胞培养箱中孵育45min。用酶标仪读取450nm处的吸光度，以上过程重复测试三次；

(4)统计实验数据，结果如图4所示。

在本发明实施例中，参考图4，通过将HFF细胞浸没在不同浓度带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶中共培养24h，以判断其细胞毒性。随着培养时间增加，浸没在不同浓度带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶中的细胞数量都在增长，且增长率高于110％，表明带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶的生物相容性良好。在高浓度的复合水凝胶中，细胞依然可以正常生长增殖。由此可知，带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶具有良好的生物安全性，说明带负电荷的生物蛋白-卡波姆水凝胶无细胞毒性。

本发明的工作原理是：

该带负电荷抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法和应用，带负电荷的生物蛋白具有良好的组织相容性和生物活性，Na

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。