一种保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂

技术领域

本发明属于保加利亚乳杆菌保存技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂。

背景技术

保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)又称德氏乳杆菌保加利亚亚种，归属于乳杆菌属，是典型的来自乳的乳酸菌。菌体粗而长，兼性厌氧，菌体形态有长杆型和短杆型。具有调节肠道菌群平衡、抑制有害菌、增强免疫力、抗癌等作用，被广泛应用于食品领域、医药领域以及畜牧领域。保加利亚乳杆菌对环境温度较为敏感，在保藏及运输过程中，可能会造成菌体失活，最终导致终产品中保加利亚乳杆菌存活率下降的情况。然而，益生菌想要发挥其益生功效，必须保证益生菌在产品和宿主中都保持活性和代谢稳定，当液态食品中活菌数达到一定数量(食品安全国家标准GB 19302-2010对乳酸菌数进行限量，具体为10

在保存保加利亚乳杆菌过程中，为了避免菌体的衰老死亡，通常是将菌体的水分去除，以避免菌体的新陈代谢，从而保存菌体。目前，保加利亚乳杆菌菌粉主要通过真空冷冻干燥技术来实现，然而冷冻和干燥过程中会使部分细胞损伤、死亡及某些蛋白酶分子钝化。如果菌体直接进行冷冻干燥，存活率很低，但若将菌体悬浮于适宜的介质中再进行冷冻干燥，菌体的存活率可达到70％以上。因此，选择合适的冻干保护剂非常必要。保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性，还能保护乳酸菌抵抗不良环境，有效促进有益菌的生长，进一步提高冻干粉中益生菌的存活率。因此，冻干保护剂不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率，还影响保藏期间的细胞稳定性。现有的冷冻干燥保护剂对于保加利亚乳杆菌的活性有一定的保护作用，但是在冷冻干燥工艺中活细胞损失较大，并不能很好地保持原有的各种生理生化特性和生物活性。因此，开发一种合适的保加利亚乳杆菌冻干保护剂显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂，以质量百分比计，包含以下组分：1％～5％阿拉伯胶、0.5％～2％水苏糖、1％～5％半胱氨酸盐酸盐、2％～10％菊粉、0.2％～1％血清蛋白，余量为水。

优选地，以质量百分比计，包含以下组分：3％阿拉伯胶、0.75％水苏糖、2％半胱氨酸盐酸盐、8％菊粉、0.8％血清蛋白，余量为水。

优选地，所述血清蛋白为牛血清蛋白或羊血清蛋白。

更加优选地，所述水为蒸馏水。

本发明第二方面提供了一种如上述第一方面所述的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂的制备方法，包括如下步骤：按如上述第一方面所述的冻干用复合保护剂配比称取各组分，先将半胱氨酸盐酸盐、血清蛋白溶解于部分水中，用滤膜过滤除菌，得到溶液A；然后将阿拉伯胶、水苏糖和菊粉溶解于剩余的水中，110～130℃灭菌20～40min，得到溶液B；最后将溶液A和溶液B混合均匀，得到保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂。

更加优选地，在制备冻干用复合保护剂的过程中，可将蒸馏水事先灭菌，得到无菌水，再进行溶解操作。

更加优选地，所述滤膜为0.22μm的PES无菌滤膜。

本发明第三方面提供了一种如上述第一方面所述的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂或由上述第二方面制得的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂在制备保加利亚乳杆菌冻干菌粉中的应用。

本发明第四方面提供了一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉，所述保加利亚乳杆菌冻干菌粉由上述第一方面所述的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂或由上述第二方面制得的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂制备而成。

本发明第五方面提供了一种如上述第四方面所述的保加利亚乳杆菌冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：

(1)将保加利亚乳杆菌活化、培养，富集得菌泥；

(2)将菌泥与冻干用复合保护剂按质量比(2～10)∶1混合均匀，预冻处理后进行冷冻干燥。

优选地，步骤(1)中所述富集过程为：将保加利亚乳杆菌菌液温度控制在4～20℃下进行离心，离心转速为4000～10000r/min，离心时间为5～20min；离心结束后，去除上清液，收集菌体，得到保加利亚乳杆菌菌泥。

更加优选地，所述离心转速为4000～8000r/min，离心时间为5～10min。

优选地，步骤(2)中预冻处理过程的具体操作为：控制降温速率10～15℃/min降温至-60℃，保温，冷冻2～3h；所述冷冻干燥过程真空度维持在20～40kPa，具体操作为：在3h内升温至-20℃，冷冻干燥10h；再于3h内升温至30℃，冷冻干燥10h。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明制备的冻干用复合保护剂采用多种活性组分，不添加任何化学合成物质，安全性高；可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，能够减少冷冻干燥或复水过程对菌体的伤害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性，提高了保加利亚乳杆菌菌体存活率；后期稳定好，能在常温下保持较高的存活率。在其中一项实施例中，本发明制备的冻干用复合保护剂在对保加利亚乳杆菌冷冻干燥后，平均存活率能达到98.5％，比未添加任何保护剂的保加利亚乳杆菌的平均存活率高出约54.5％；常温保存8周后，添加本发明制备的冻干用复合保护剂的冻干样品存活率均在80％以上，与未添加任何保护剂的样品相比具有极显著的差异，存活率高出约46.7％，最高可达60.9％。

(2)本发明制备的冻干用复合保护剂在选择配方时考虑到保加利亚乳杆菌在冻干过程中受到的多重因素的影响，因此选择了不同机理的冻干保护剂进行加强或协同作用。其中，阿拉伯胶属于大分子糖类物质，能够与菌体一起形成料液骨架结构，在冻干过程中减少升温导致的坍塌，同时在预冻过程中可以减少冰晶的形成对菌体造成的伤害。半胱氨酸盐酸盐是优良的抗氧化剂，能够抵抗机体氧自由基的破环，增强对外界环境的耐受力，以提高菌体稳定性，使菌体存放稳定、耐加工和保存。水苏糖能在菌体冻干过程中为其在胞外提供一个较好的物理保护环境；且在进入人体后，水苏糖在胃肠道被菌体利用后分解成二糖、三糖等，可以激发体内的免疫活性因子，从而活化免疫细胞，促进机体产生可以抵抗外界疾病的抗体，使机体产生干扰素的能力增强，对增强人体免疫力有极大的促进作用；此外，水苏糖还具有功能活性，能够直接增殖肠道菌体。菊粉有益于菌体的增长和繁殖，改善肠道环境，提高抵抗力；血清蛋白具有提升菌体的自我保护能力，防止其遭到一定的破坏，从而对其活性进行保护。

(3)本发明制备的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂具有生产成本低，适用性高，绿色安全等优点，能保护保加利亚乳杆菌抵抗不良环境，可被应用于直投式酸奶发酵剂，有效促进保加利亚乳杆菌生长；同时能提高保加利亚乳杆菌的存活率和稳定性，从而延长货架期。本发明为保加利亚乳杆菌冻干的研究提供了行之有效的方法，可以解决益生菌制剂在生产、使用过程中活性、数量及效价损失严重的问题，具有较强的研究价值和商业指导意义，前景广阔，竞争力强，为现代化社会带来更好的经济效益。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。

实施例1：不同的离心转速和离心时间对保加利亚乳杆菌的影响

为了将所述冻干用复合保护剂用于保加利亚乳杆菌的冷冻干燥，需要先制备出保加利亚乳杆菌菌泥。参照如下步骤制备保加利亚乳杆菌菌泥，设置试验例，比较不同的离心转速和离心时间对保加利亚乳杆菌的离心损失率和离心存活率的影响，确定最佳离心工艺。具体离心工艺参数及结果见表1。

试验例的具体步骤为：

1)活化、培养：将保加利亚乳杆菌划线接种于MRS平板培养基中，于37℃恒温密闭培养(10～18h)。连续活化3次，镜检无杂菌且形态无异常后，按2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中,于37℃恒温厌氧培养18h，得到保加利亚乳杆菌菌液。

2)富集：无菌条件下取2mL保加利亚乳杆菌菌液，在20℃的温度条件下离心5min～10min，离心转速设为4000～8000r/min；离心结束后，去除上清液初步脱水，收集菌体，得到保加利亚乳杆菌菌泥。计算得到保加利亚乳杆菌的离心损失率、离心存活率和离心收得率，具体计算公式如下：

离心损失率(％)＝上清液活菌数(CFU/mL)/初始活菌数(CFU/mL)×100％；

离心存活率(％)＝沉降细胞活菌数(CFU/mL)/[初始活菌数(CFU/mL)－上清液活菌数(CFU/mL)]×100％；

离心收得率：沉降细胞活菌数(CFU/mL)/初始活菌数(CFU/mL)×100％。

表1离心转速和离心时间对保加利亚乳杆菌的影响

由表1离心损失率的数据可以看出，在6000r/min、5min条件下离心，损失率最高，其次是5000r/min、5min的条件下和4000r/min、10min的条件下；在8000r/min、10min条件下离心，损失率最低，其次是8000r/min、5min的条件下。离心损失率结果表明，增加离心力和延长离心时间，均可显著降低损失率。

由表1离心存活率的数据可以看出，在6000r/min、5min条件下离心，存活率最高，其次是5000r/min、5min的条件下和4000r/min、10min的条件下；在8000r/min、10min条件下离心，存活率最低，其次是7000r/min、10min的条件下。离心存活率结果表明，转速超过7000r/min，离心时间超过10min时，存活率明显降低。

由表1离心收得率的数据可以看出，离心收得率是衡量离心效果的最终体现，它与离心存活率成正比，而与离心损失率成反比。因此可在获得较高离心收得率的前提下，尽量选取较小离心力和较短离心时间进行离心。因此优选离心转速6000r/min，离心时间5min的离心工艺条件。

实施例2：制备不同配比的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂

将半胱氨酸盐酸盐、牛血清蛋白溶解于部分无菌水中，用0.22μmPES无菌滤膜过滤除菌后，得到溶液A；将阿拉伯胶、水苏糖和菊粉溶解于剩余的水中，115℃灭菌20min，得到溶液B；将溶液A和溶液B混合均匀后，得到保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂，存于4℃备用。

其中，阿拉伯胶、水苏糖、半胱氨酸盐酸盐、菊粉和牛血清蛋白的用量见表2。

表2制备保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂各组分的质量百分比

实施例3：不同配比的保加利亚乳杆菌冻干用复合保护剂的冻干效果对比

参照如下步骤制备保加利亚乳杆菌冻干菌粉，设置空白例和试验例，比较不添加冻干保护剂(空白例)、添加实施例2制备的不同的冻干保护剂(试验例)对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响。

空白例的制备步骤为：

(1)活化、培养：将保加利亚乳杆菌划线接种于MRS平板培养基中，于37℃恒温密闭培养(10～18h)。连续活化3次，镜检无杂菌且形态无异常后，按2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中,于37℃恒温厌氧培养18h，得到保加利亚乳杆菌菌液。

(2)富集：将保加利亚乳杆菌菌液温度控制在20℃下进行离心，离心转速为6000r/min，离心时间为5min；离心结束后，去除上清液，收集菌体，得到保加利亚乳杆菌菌泥。

(3)冻干：将无菌水与菌泥按质量比3∶1混合均匀，先控制降温速率10～15℃/min降温至-60℃，保温，冷冻2～3h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到保加利亚乳杆菌冻干菌粉。冷冻干燥过程在真空冷冻干燥机中进行，整个冷冻干燥过程真空度维持在20～40kPa，具体过程为：在3h内升温至-20℃，冷冻干燥10h；再于3h内升温至30℃，冷冻干燥10h。

试验例的制备步骤为：

(1)活化、培养：将保加利亚乳杆菌划线接种于MRS平板培养基中，于37℃恒温密闭培养(10～18h)。连续活化3次，镜检无杂菌且形态无异常后，按2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中,于37℃恒温厌氧培养18h，得到保加利亚乳杆菌菌液。

(2)富集：将保加利亚乳杆菌菌液温度控制在20℃下进行离心，离心转速为6000r/min，离心时间为5min；离心结束后，去除上清液，收集菌体，得到保加利亚乳杆菌菌泥。

(3)冻干：将冻干保护剂与菌泥按质量比3∶1混合均匀，先控制降温速率10～15℃/min降温至-60℃，保温，冷冻2～3h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到保加利亚乳杆菌冻干菌粉。冷冻干燥过程在真空冷冻干燥机中进行，整个冷冻干燥过程真空度维持在20～40kPa，具体过程为：在3h内升温至-20℃，冷冻干燥10h；再于3h内升温至30℃，冷冻干燥10h。

按冻干保护剂是单一组分还是复合而成将试验标号依次编为：实施例3-1至实施例3-5和对比例3-1至3-6。制备的保加利亚乳杆菌冻干菌粉在刚冻干结束后和常温保存8周后的活菌数和平均存活率如表3所示。参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》，采用平板计数法测定保加利亚乳杆菌所含活菌数。存活率计算公式为：存活率(％)＝冻干后保加利亚乳杆菌活菌数/冻干前保加利亚乳杆菌活菌数×100％。

表3冻干用复合保护剂对保加利亚乳杆菌的保护作用

由表3可知，本发明的冻干用复合保护剂对冷冻干燥工艺前后保加利亚乳杆菌具有十分显著的保护作用。如本发明制备的冻干用复合保护剂5，在对保加利亚乳杆菌冷冻干燥后，平均存活率能达到98.5％，比未添加任何保护剂的保加利亚乳杆菌的平均存活率高出约54.5％。常温保存8周后，添加本发明制备的冻干用复合保护剂的冻干样品存活率均在80％以上，与未添加任何保护剂的样品相比具有极显著性差异，存活率高出约46.7％，最高可达60.9％。而且对比不同配比的冻干保护剂(实施例3-1至3-5和对比例3-1至3-5)可以看出，制备冻干用复合保护剂的各组分的用量比会对保加利亚乳杆菌的冻干效果产生明显影响，且在相同的质量浓度下，复合冻干保护剂比单一组分的冻干保护剂的保护效果要好很多(刚冻干后平均存活率就能高出51.5％)。其中实施例3-5所述的冻干用复合保护剂的保护效果最佳，以质量百分比计，其最佳配比为：3％阿拉伯胶、0.75％水苏糖、2％半胱氨酸盐酸盐、8％菊粉、0.8％牛血清蛋白，余量为水。

实施例4

一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉的制备方法内容与实施例3-5的内容基本相同，其不同之处在于：所述步骤(3)中将冻干保护剂5与菌泥按质量比2∶1混合均匀。

实施例5

一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉的制备方法内容与实施例3-5的内容基本相同，其不同之处在于：所述步骤(3)中将冻干保护剂5与菌泥按质量比5∶1混合均匀。

实施例6

一种保加利亚乳杆菌冻干菌粉的制备方法内容与实施例3-5的内容基本相同，其不同之处在于：所述步骤(3)中将冻干保护剂5与菌泥按质量比10∶1混合均匀。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。