一种利用CO2生物合成花旗松素的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种直接利用CO

背景技术

花旗松素，也称二氢槲皮素，是一种含有五个酚羟基的黄酮类化合物，可以有效清除人体自由基，具有抗癌、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌和调节免疫力免疫调节等多种重要功效，其抗氧化能力是普通维生素的十倍。因此它在食品、药品、化妆品以及工业领域均有广泛的应用，被誉最强效的“清基之王”，市场需求量巨大。

尽管花旗松素等黄酮类物质对人类产生了巨大的作用，但这些天然产物在植物中的含量低，分离和提取较为复杂，并且许多物质在特定植物的特定部位才能产生，使得它们的产量极低，不能满足人们对于植物次生代谢产物日益增长的需求量。化学合成法虽然能合成一些结构相对简单的苯丙烷类物质，但环境问题的日益凸显和人们对于食品安全的重视，限制了这种方法的发展。因此，虽然花旗松素的需求巨大，但传统生产方式无法满足市场需求，导致花旗松素等黄酮类物质价格昂贵，限制了这类物质的大规模商业化应用。

在过去的十几年中，合成生物学和代谢工程技术呈现出巨大的潜力，成为当前生物技术科学发展的重要研究方向。改造微生物来制备花旗松素等黄酮类化合物的策略成为一种具有巨大潜力的生产方式，但一般微生物缺乏充足的能量和还原力提供给花旗松素合成途径，使得碳的转化率极低，生产过程需要添加大量的碳水化合物或者昂贵的前体物质，带来较高的生产成本；此外，花旗松素等黄酮类化合物合成途径需要一些常见工业微生物难以表达的植物酶类，限制了这种生物生产技术的应用。因此，尽管花旗松素的合成生物研究已经有了一定发展，但目前花旗松素等黄酮类物质的微生物法生产离工业化应用还有很长一段距离，寻求经济和可持续的绿色生产方法仍然是一个巨大的挑战。

光合微生物是可以进行光合作用的生物，广泛分布在淡水、海水甚至污水。其中，光合微生物蓝藻生长迅速，结构和遗传背景简单，易于基因操作，最为突出的是它能利用太阳能和温室气体生长，并将CO

因此，本领域的技术人员致力于开发一种经济、可持续的和适应工业化应用的花旗松素等黄酮类物质合成方法。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供了一种生物合成花旗松素的方法及其应用。

本发明技术原理是将植物花旗松素合成的相关途径导入光合微生物，构建出基因工程光合微生物，该基因工程光合微生物含有整合到光合微生物染色体整合位点上的花旗松素合成的相关外源基因。

本发明的第一个方面是公开了一种生物合成花旗松素的方法，具体技术方案如下：

将外源基因组合串联在质粒中导入野生型光合微生物基因组，从而获得产花旗松素的基因工程光合微生物，所述外源编码基因组合为组合1或者组合2：

组合一：将酪氨酸解氨酶(TAL)、对香豆酸:CoA连接酶(4CL)、查耳酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)以及黄酮3'羟化酶(F3'H)的编码基因导入野生型光合微生物的基因组DNA得到产花旗松素的基因工程光合微生物；

组合二：将解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(fbr-DAHP)、酪氨酸解氨酶(TAL)、对香豆酸:CoA连接酶(4CL)、查耳酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)以及黄酮3'羟化酶(F3'H)的编码基因导入野生型光合微生物的基因组DNA得到产花旗松素的基因工程光合微生物。

优选的，所述野生光合微生物属于蓝藻或绿藻，选自聚球藻属、集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属、鞭枝藻属、衣藻属、小球藻属和微拟球藻属等微藻。

进一步优选的，所述野生光合微生物为聚球藻(Synechococcus elongatus)。

优选的，所述启动子为psbA2启动子。

进一步地，所述的酪氨酸解氨酶的编码基因如SEQ ID NO:1所示或者能与SEQ IDNO:1所示的核酸序列的互补链杂交；

所述的对香豆酸:CoA连接酶的编码基因如SEQ ID NO:2所示或者能与SEQ ID NO:2所示的核酸序列的互补链杂交；

所述的查耳酮合酶的编码基因如SEQ ID NO:3所示或者能与SEQ ID NO:3所示的核酸序列的互补链杂交；

所述的查尔酮异构酶的编码基因如SEQ ID NO:4所示或者能与SEQ ID NO:4所示的核酸序列的互补链杂交；

所述的黄烷酮-3-羟化酶的编码基因如SEQ ID NO:5所示或者能与SEQ ID NO:5所示的核酸序列的互补链杂交；

所述的黄酮3'羟化酶的编码基因如SEQ ID NO:6所示或者能与SEQ ID NO:6所示的核酸序列的互补链杂交；

所述的解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的编码基因如SEQID NO:7所示或者能与SEQ ID NO:7所示的核酸序列的互补链杂交；

优选的，所述的酪氨酸解氨酶来源于糖丝菌；

所述的对香豆酸:CoA连接酶来源于拟南芥；

所述的查耳酮合酶来源于矮牵牛；

所述的查尔酮异构酶来源于拟南芥；

所述的黄烷酮-3-羟化酶来源于甜橙；

所述的黄酮3'羟化酶来源于非洲菊；

所述的解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶来源于大肠杆菌。

本发明的第二个方面是提供一种基因工程蓝藻在生产花旗松素中的应用。

本发明的有益效果为：

1、对蓝藻进行遗传改造，将植物的花旗松素合成途径在蓝藻中重构，获得的基因工程菌可以将取之不尽的太阳能和温室气体CO

2、在本发明的具体实施例中，经过培养，基因工程蓝藻可以产生43.7mg/l花旗松素。这些物质作为黄酮类化合物合成的重要节点化合物，可以合成许多其他的黄酮类化合物，这为黄酮类物质的生产开辟了新的技术，具有广泛的工业应用前景。

总之，本发明提供应用方法降低了底物成本，还可以吸收温室气体CO

附图说明

图1是本发明实施例3外源基因整合示意图；

图2是本发明实施例4生产花旗松素的浓度随时间的变化图；

图3是实施例5生产花旗松素的浓度随时间的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明，本发明实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围，实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明使用的菌株和生长条件如下：

克隆宿主DH5α购自Invitrogen公司，所有大肠杆菌在含有100mg/l壮观霉素的LB培养基中，37℃培养。

聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC7942购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)。聚球藻PCC7942在BG11液体培养基中生长，固体培养基在BG11液体培养基中添加1.5％的琼脂粉，培养条件：32℃，光强100μE·s

其中，所述LB培养基配方是：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,pH 7.0；

所述BG11液体培养基配方是：10ml BG11母液，1ml柠檬酸铁铵溶液(6g/L)，1mlNa

上述BG11母液的配方是：149.6g NaNO

上述BG11微量元素溶液的配方是：2.86g H

所述5xBG液体培养基配方是：50ml BG11母液，1ml柠檬酸铁铵溶液(60g/L)，1mlNa

所有质粒均为pSyn_6(购自Invitrogen公司)衍生质粒，用于通过同源重组整合到集胞藻PCC7942基因组中表达目的基因。

实施例1构建表达质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h：

(1)提取pSyn_6质粒：

将含有pSyn_6质粒的大肠杆菌DH5α按照1％接种量，接种至5mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中培养10h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)，参照说明书中描述的方法提取质粒。

(2)扩增酪氨酸解氨酶基因(sam8)：

采用常规的方法制备西班牙糖丝菌的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；

利用西班牙糖丝菌基因组为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行PCR扩增。

PCR引物：

sam8基因上游引物sam8-F：5′-gaaggagcgtcagatctcatatgacgcaggtcgtggaacg-3′；

下游引物sam8-R：5′-catg

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(2)扩增psbA2启动子：

利用pSyn_6质粒为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行PCR扩增。

PCR引物：

psbA2启动子上游引物psbA2-F：5′-cgacgaggcagacgggaaggatttcggatgaggctggctatttagcgtcttcta-3′；

下游引物psbA2-R：5′-ctgagaaactgcttgttcttgcggcgccatatgagatctgacgctccttcgag-3′。

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(3)合成对香豆酸:CoA连接酶基因(4cl)片段、查耳酮合酶基因(chs)片段、查尔酮异构酶基因(chi)片段、黄烷酮-3-羟化酶基因(f3h)片段和黄酮3'羟化酶基因(f3'h)片段片段：

利用在线软件JCat，根据聚球藻PCC7942的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的4cl基因、矮牵牛(Petunia hybrida)中的chs基因、拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的chi基因、甜橙(Citrus sinensis)中的f3h基因和非洲菊(Gerbera hybrid)中的f3'h基因进行密码子优化，并在chs前端加上sd序列(sd-chs)ctgcgcgcaaaactggcaaacggcctgtaaaaagaggagaaatactag，在chi前端加上sd序列(sd-chi)ctgttgttctgcactctgttgctacttaaattaaagaggagaatctaga，在f3h前端加上psbA2序列(psbA2-f3h)ggctggctatttagcgtcttctaatccagtgtagacagtagttttggctccgttgagcactgtagccttgggcgatcgctctaaacattacataaattcacaaaagttttcgttacataaaaatagtgtctacttagctaaaaattaagggttttttacacctttttgacagttaatctcctagcctaaaaagcaagagtttttaactaagactcttgccctttacaacctcgaaggagcgtcagatctcat，在f3'h前端加上sd序列(sd-f3'h)ctgttgttctgcactctgttgctacttaaaaagaggagaaatactag，将这些序列送金唯智公司(GENEWIZ)进行基因合成。

(4)扩增sam8-4cl-chs-chi片段：

利用步骤(1)中得到的sam8基因片段、步骤(2)中得到的psbA2启动子片段和步骤(3)中得到的4cl基因片段、chs基因片段以及chi基因片段作为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行重组PCR扩增。

PCR引物：

上游引物sam8-F：5′-gaaggagcgtcagatctcatatgacgcaggtcgtggaacg-3′；

下游引物chi-R：5′-accgcggatccgggaattcgttagttctctttggccagtttttc-3′。

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(5)将pSyn_6质粒用NEB的限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切，将酶切后的质粒用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit参照说明书中描述的方法进行回收。将步骤(4)中得到的sam8-4cl-chs-chi基因片段和回收的pSyn_6质粒用诺唯赞公司(Vazyme)的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit参照说明书中描述的方法进行无缝克隆，获得重组质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi。

(6)扩增f3h-f3'h片段：

利用步骤(3)中得到的f3h基因片段和f3'h基因片段作为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行重组PCR扩增。

PCR引物：

上游引物f3h-F：5′-catg

下游引物f3'h-R：5′-catg

其中下划线所标示的碱基序列分别是HindIII和EcoRI的酶切位点。

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(7)将步骤(5)中得到的质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi和步骤(6)中得到的f3h-f3'h片段分别利用NEB的限制性内切酶HindIII和EcoRI进行双酶切。将酶切后的f3h-f3'h基因片段和pSyn-sam8-4cl-chs-chi质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel ExtractionKit参照说明书中描述的方法进行回收，用T4 DNA连接酶(购买自New England Biolabs公司)进行连接，连接过程参照说明书中的方法，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h。

实施例2

构建表达质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h-aroG

(1)扩增解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroG

采用常规的方法制备大肠杆菌K12的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备方法；

利用大肠杆菌K12基因组为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行PCR扩增。

PCR引物：

aroG基因上游引物aroG-F：5′-atgaattatcagaacgacgatttacg-3′，

下游引物aroG-R：5′-catg

其中下划线所标示的碱基序列是KpnI的酶切位点。

得到上述产物，经过重组PCR的方法，将539位的G碱基替换为T，从而将第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，得到可以编码解反馈抑制的3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的序列。将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(2)扩增psbA2-2启动子：

利用pSyn_6质粒为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行PCR扩增。

PCR引物：

上游引物psbA2-F-2：5′-catg

下游引物psbA2-R-2：5′-cgtaaatcgtcgttctgataattatgagatctgacgctccttcgag-3′。

其中下划线所标示的碱基序列是EcoRI的酶切位点。

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(2)将步骤(1)中得到的aroG

PCR引物：

上游引物psbA2-F-2：5′-catg

下游引物aroG-R：5′-catg

其中下划线所标示的碱基序列分别是EcoRI和KpnI的酶切位点。

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。

(3)将实施例1步骤(7)中得到的质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h和步骤(2)中得到的psbA2-2-aroG

实施例3

蓝藻的转化及基因工程蓝藻的获得：

(1)蓝藻菌株转化：

取处于对数生长期(OD

(2)基因工程蓝藻的获得：

从步骤(1)所述转化后的固体培养基上挑取转化子，接入5ml新鲜的BG11液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)，置于32℃、100μE·s

质粒pSyn-sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h和pSyn-sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h-aroG

(3)基因工程蓝藻的保存：

将步骤(2)获得的基因工程蓝藻接种于含有20μg/mL壮观霉素的BG11液体培养基中，置于32℃、100μE·s

实施例4

利用基因工程蓝藻S-TY1生产花旗松素：

(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-TY1(整合有sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h)接种到含有20μg/mL壮观霉素的BG11固体培养基上，30℃、100μE·s

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-TY1，用接种环接种到5mL 5xBG液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s

(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mL5xBG液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，培养10-15天，得到含花旗松素的转化液；

(4)花旗松素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为花旗松素；

(5)样品检测：将步骤(4)制得的花旗松素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，确定所得样品为花旗松素。用HPLC检测，图2为转化培养中花旗松素浓度随时间的变化图，花旗松素的最高产量为8.31mg/l；

HPLC方法使用Agilent1260液相色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为0.6mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为220nm，柱温为30℃，花旗松素出峰时间为5.20分钟。

实施例5

利用基因工程蓝藻S-TY2生产花旗松素：

(1)固体培养：将基因工程蓝藻S-TY2(整合有sam8-4cl-chs-chi-f3h-f3'h-aroG

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株S-TY1，用接种环接种到5mL 5xBG液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中进行菌株活化，30℃、100μE·s

(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mL5xBG液体培养基(含有20μg/mL壮观霉素)中扩大培养，培养10-15天，得到含花旗松素的转化液；

(4)花旗松素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为花旗松素；

(5)样品检测：将步骤(4)制得的花旗松素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，确定所得样品为花旗松素。用HPLC检测，图3为转化培养中花旗松素浓度随时间的变化图，花旗松素的最高产量为43.7mg/l；

HPLC方法使用Agilent1260液相色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为0.6mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为220nm，柱温为30℃，花旗松素出峰时间为5.20分钟。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种利用CO2生物合成花旗松素的方法及其应用

<130> 01335-22034

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> Saccharothrix espanaensis DSM 44229

<400> 1

atgacgcagg tcgtggaacg tcaggctgat cggctcagca gcagggagta cctggcccgg 60

gtcgtgcgca gcgccgggtg ggacgccggt ctcacctcgt gcaccgacga ggagatcgtc 120

cggatgggcg cgagcgcgcg caccatcgag gagtacctga agtccgacaa gcccatctac 180

ggcctgacgc agggcttcgg tccgctggtg ctgttcgacg ccgactcgga gctggagcag 240

ggcggctcgc tgatctcgca cctgggcacc ggccagggcg cgccactggc cccggaggtg 300

tcgcggctga tcctctggct gcgcatccag aacatgcgca aggggtactc ggcggtctcg 360

ccggtgttct ggcagaagct cgccgacctg tggaacaagg ggttcacccc ggcgatcccc 420

cggcacggca cggtcagcgc gagcggcgac ctgcaaccgc tggcgcacgc cgcgctcgcc 480

ttcaccggtg tcggcgaggc gtggacccgg gacgccgacg gccggtggtc caccgtgccg 540

gccgtggacg cgctcgccgc gctgggggcg gagccgttcg actggccggt gcgcgaggcg 600

ctggcgttcg tcaacgggac cggcgcgagc ctcgcggtgg ctgtgctcaa ccaccggtcc 660

gccctgcggc tggtccgcgc ctgcgccgtg ctctccgcgc ggctggcgac cctgctgggg 720

gccaatcccg agcactacga cgtggggcac ggtgtcgcgc gcggccaggt cggtcagctg 780

accgcggcgg agtggatccg gcaggggctg ccccggggca tggtgcgcga cggcagccgc 840

ccgctccagg agccgtacag cctgcggtgc gcgccgcagg tgctcggcgc ggtgctcgac 900

cagctcgacg gcgcgggcga cgtgctggcg cgggaggtcg acggctgcca ggacaacccg 960

atcacctacg agggcgagct gctgcacggc ggcaacttcc acgccatgcc ggtgggtttc 1020

gcctccgacc agatcgggtt ggccatgcac atggccgcct acctggccga gcgccagctg 1080

ggtctgctgg tcagcccggt gaccaacggc gacctgccgc ccatgctcac cccgcgcgcc 1140

gggcgcggtg ccgggctggc cggggtgcag atcagcgcga cctcgttcgt ctcgcggatc 1200

cggcagctgg tgttccccgc ctcgctgacc accctgccga ccaacggctg gaaccaggac 1260

cacgtgccga tggcgctcaa cggggcgaac tcggtgttcg aggcgttgga gctcggctgg 1320

ctgacggtcg ggtcgctggc ggtgggcgtc gcgcagctcg cggccatgac cggccacgcc 1380

gcggagggcg tctgggcgga gctggccggg atctgcccgc cgctggacgc cgaccgcccg 1440

ctgggcgccg aggtgcgcgc cgcgcgcgac ctgctgtccg cgcacgcgga ccaactgctc 1500

gtcgacgagg cagacgggaa ggatttcgga tga 1533

<210> 2

<211> 1686

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

atggcgccgc aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60

tctgacgtta ttttccgcag caagctgccg gatatctaca tcccgaacca cctgtctctg 120

cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa tttgccacta agccgtgcct gatcaacggc 180

ccgaccggcc acgtgtacac ttactccgac gttcacgtta tctcccgcca aatcgccgcc 240

aactttcaca aactgggcgt taaccaaaac gacgttgtta tgctgctgct gccgaactgc 300

ccggaatttg ttctgagctt cctggccgcc tctttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360

aacccgttct tcactccggc ggagatcgct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactg 420

atcatcaccg aagctcgtta cgttgacaaa atcaaaccgc tgcaaaacga cgacggcgtg 480

gttatcgttt gcatcgacga caacgaatcc gtgccgatcc cggaaggctg cctgcgcttc 540

accgagctga ctcagtctac caccgaggca agcgaagtta tcgactctgt ggagattagc 600

ccggacgacg tggtggcact gccgtactcc tctggcacca ccggcctgcc gaaaggcgtg 660

atgctgactc acaagggcct ggttaccagc gttgctcagc aagttgacgg cgagaacccg 720

aacctgtatt tccacagcga tgacgttctg ctgtgtgttc tgccgatgtt tcatatctac 780

gctctgaact ctatcatgct gtgtggtctg cgcgttggtg cggcgattct gatcatgccg 840

aagtttgaga tcaacctgct gctggagctg atccagcgct gtaaagtgac cgtggctccg 900

atggttccgc cgattgtgct ggccattgcg aagtcttctg agaccgagaa gtatgatctg 960

agctctatcc gcgtggtgaa atctggtgct gctccgctgg gtaaagaact ggaagatgcc 1020

gttaacgcca agtttccgaa cgccaaactg ggtcagggct acggcatgac cgaagcaggt 1080

ccggtgctgg caatgtctct gggttttgca aaggaaccgt ttccggttaa gagcggcgct 1140

tgtggtactg ttgtgcgcaa cgctgagatg aaaatcgttg atccggacac cggcgattct 1200

ctgtctcgca aacaaccggg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260

ctgaacaacc cggcagctac cgcagagacc attgataaag acggttggct gcatactggc 1320

gatattggcc tgatcgatga cgatgacgag ctgttcatcg ttgatcgcct gaaagaactg 1380

gttaagtata aaggttttca ggtggctccg gctgaactgg aggctctgct gatcggtcat 1440

ccggacatta ctgatgttgc tgttgttgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttccg 1500

gtggcattcg tggtgaaaag caaggattct gagctgagcg aagatgatgt gaagcaattc 1560

gtgtctaaac aggttgtgtt ttacaagcgc atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt 1620

ccgaaagctc cgagcggcaa gatcctgcgc aaagatctgc gcgcaaaact ggcaaacggc 1680

ctgtaa 1686

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> Petunia hybrida

<400> 3

atggtgaccg ttgaggagta tcgtaaggca caacgctgtg agggtccggc cactgttatg 60

gccattggca ccgccacccc gaccaactgt gttgatcaaa gcacttaccc ggattattat 120

tttcgtatca ctaactctga gcacaagact gatctgaagg agaaatttaa gcgcatgtgt 180

gaaaaaagca tgattaagaa acgctacatg cacctgaccg aggaaatcct gaaagagaac 240

ccgtctatgt gtgaatacat ggcaccgtct ctggatgctc gccaagacat cgtggtggtt 300

gaagtgccga aactgggcaa agaggcagcc caaaaagcta tcaaggaatg gggccagccg 360

aagtccaaaa ttacccatct ggttttttgc accacttctg gtgtggacat gccgggctgt 420

gactatcaac tgactaagct gctgggcctg cgtccgtctg ttaagcgcct gatgatgtac 480

caacagggct gcttcgcggg tggcaccgtt ctgcgtctgc gcaaggacct ggctgaaaac 540

aacaagggcg ctcgtgtgct ggttgtttgc agcgagatca ccgcggttac cttccgtggc 600

ccgaacgata ctcatctgga ttctctggtt ggccaagcac tgtttggtga tggcgcaggc 660

gcgatcatta tcggttctga tccgattccg ggtgttgagc gcccgctgtt cgagctggtt 720

agcgcagccc aaactctgct gccggatagc catggtgcta ttgatggcca tctgcgtgaa 780

gttggcctga ccttccacct gctgaaagat gttccgggcc tgatcagcaa aaacattgag 840

aagagcctgg aggaagcatt taaaccgctg ggcatttctg attggaactc tctgttctgg 900

attgctcatc cgggtggccc ggcaattctg gaccaagttg aaatcaagct gggcctgaag 960

ccggagaaac tgaaggctac ccgcaacgtg ctgtctgact atggtaacat gagctctgct 1020

tgcgttctgt ttatcctgga tgaaatgcgc aaggccagcg ccaaagaagg tctgggcact 1080

actggtgaag gcctggagtg gggtgttctg tttggctttg gcccgggcct gaccgttgag 1140

actgttgttc tgcactctgt tgctacttaa 1170

<210> 4

<211> 740

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

atgtctagct ccaacgcctg cgcctctccg agcccgttcc cggccgttac caagctgcat 60

gtggactccg ttacctttgt gccgtccgtt aagagcccgg cctcctccaa cccgctgttc 120

ctgggcggcg ccggtgttcg cggcctggat atccaaggta aattcgtgat cttcaccgtt 180

attggcgtgt acctggaggg taacgccgtt ccgtctctgt ctgttaagtg gaagggcaaa 240

actaccgagg agctgaccga atctatcccg ttcttccgtg aaatcgttac cggtgcgttt 300

gagaagttta tcaaggtgac catgaaactg ccgctgaccg gccaacaata ttctgagaaa 360

gtgaccgaga actgtgtggc tatctggaaa caactgggcc tgtataccga ctgtgaagct 420

aaagctgtgg agaagttcct ggagatcttc aaggaagaaa ccttcccgcc gggtagctct 480

atcctgttcg ctctgtcccc gaccggctct ctgactgttg cgttcagcaa agatgattct 540

atcccggaaa ccggcatcgc tgtgatcgag aacaaactgc tggcggaggc ggttctggaa 600

tctatcatcg gcaagaacgg tgtgagcccg ggcactcgcc tgtctgttgc agaacgcctg 660

tctcagctga tgatgaagaa caaggacgaa aaggaagttt ctgatcactc tgttgaggaa 720

aaactggcca aagagaacta 740

<210> 5

<211> 1089

<212> DNA

<213> Citrus sinensis

<400> 5

atggctccga gcaccctgac cgctctggct ggcgaaaaaa ccctgaaccc gagcttcgtg 60

cgcttccaag acgaacgccc gaaagtggct tacaacgaat ttagcaacga aatcccggtg 120

atcagcctgg ctggcatcga cgacgtgggc ggcaaacgcg ctgaaatctg caaaaaaatc 180

gtggaagcgt gcgaagactg gggcatcttc caagtggtgg accacggcgt ggacgctaaa 240

ctgatcagcg acatgacccg cctggctacc gaatttttcg ctctgccgcc ggaagaaaaa 300

ctgaaattcg acatgagcgg cggcaaaaaa ggcggcttca tcgtgagcag ccacctgcaa 360

ggcgaagtgg tgaaagactg gcgcgaaatc gtgacctact tcagcttccc gaaacaaagc 420

cgcgactaca gccgctggcc ggacaaaccg gaaggctgga tggaagtgac caaagaatac 480

agcgacaaac tgatgggcgt ggcttgcaaa ctgctggaag tgctgagcga agctatgggc 540

ctggaaaaag aagctctgac caaagcgtgc gtggacatgg accaaaaaat cgtggtgaac 600

tactacccga aatgcccgca accggacctg accctgggcc tgaaacgcca caccgacccg 660

ggcaccatca ccctgctgct gcaagaccaa gtgggcggcc tgcaagctac caaagacaac 720

ggcaaaacct ggatcaccgt gcaaccgatc gaaggcgctt tcgtggtgaa cctgggcgac 780

cacggccact acctgagcaa cggccgcttc aaaaacgctg accaccaagc tgtggtgaac 840

agcaacagca gccgcctgag catcgctacc ttccaaaacc cggctccgga agctaccgtg 900

tacccgctga aaatccgcga aggcgaaaaa ccggtgctgg aagaaccgat cccgttcagc 960

gaaatgtacc gccgcaaaat gagcaaagac ctggaactgg ctcgcctgaa aaaactggct 1020

aacgaaaaaa aacaatacag cgaaaaagct aaactggacg ctaaaccgat cgaagaaatc 1080

ctggcttaa 1089

<210> 6

<211> 1539

<212> DNA

<213> Gerbera hybrid

<400> 6

atgaccccgc tgaccctgct gatcggcacc tgtgttactg gcctgttcct gtacgtgctg 60

ctgaaccgtt gcacccgtaa cccgaaccgc ctgccgccgg gcccgacccc gtggccggtt 120

gttggcaacc tgccgcatct gggcactatc ccgcaccact ctctggcggc gatggcgaag 180

aagtatggcc cgctgatgca cctgcgtctg ggcttcgttg acgttgtggt ggccgcctcc 240

gcctccgttg ccgcgcagtt tctgaagact cacgacgcga acttcgccga tcgtccgccg 300

aactccggcg ccaagcatat cgcgtataac tatcaggatc tggtgtttgc tccgtacggt 360

ccgcgttggc gtatgctgcg taagatctgc agcgtgcatc tgttcagcac caaagcgctg 420

gatgatttcc gtcacgttcg tcaggaggag gtggcgatcc tggcgcgcgc tctggttggc 480

gccggcaaaa gcccggtgaa actgggtcag ctgctgaacg tgtgcaccac caacgcactg 540

gcgcgcgtga tgctgggccg ccgcgtgttt gactccggcg atgctcaggc ggatgagttc 600

aaggacatgg tggttgagct gatggtgctg gccggcgaat ttaacatcgg cgacttcatc 660

ccggtgctgg actggctgga cctgcaaggc gtgaccaaga agatgaagaa actgcacgcg 720

aaattcgact ctttcctgaa caccatcctg gaagaacata aaaccggcgc cggtgacggt 780

gttgcgtctg gtaaagttga cctgctgagc accctgattt ctctgaagga tgacgcagat 840

ggcgagggcg gcaagctgtc tgacattgaa atcaaagctc tgctgctgaa cctgttcacc 900

gcgggcactg acaccagctc ttctactatt gaatgggcta tcgctgaact gattcgcaac 960

ccgcaactgc tgaaccaagc ccgcaaagaa atggacacca tcgttggtca agaccgcctg 1020

gtgaccgaga gcgacctggg tcaactgacc ttcctgcaag ccattatcaa ggaaactttt 1080

cgcctgcacc cgtctacccc gctgagcctg ccgcgcatgg cactggaatc ttgtgaggtt 1140

ggcggttatt acatcccgaa aggctccact ctgctggtta acgtgtgggc catttctcgc 1200

gacccgaaaa tttgggccga tccgctggaa tttcagccga ctcgcttcct gccgggcggt 1260

gaaaagccga acactgatat caaaggcaac gattttgaag ttatcccgtt tggtgccggc 1320

cgtcgcatct gcgttggcat gagcctgggc ctgcgcatgg ttcagctgct gactgcaacc 1380

ctgatccatg cctttgattg ggaactggct gatggcctga acccgaagaa gctgaacatg 1440

gaagaggctt acggcctgac cctgcaacgc gccgcaccgc tggtggttca cccgcgcccg 1500

cgcctggccc cgcatgtgta tgagaccact aaggtttaa 1539

<210> 7

<211> 1053

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 7

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggcttttt 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 8

gaaggagcgt cagatctcat atgacgcagg tcgtggaacg 40

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 9

catgggatcc ttatccgaaa tccttcccgt 30

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 10

cgacgaggca gacgggaagg atttcggatg aggctggcta tttagcgtct tcta 54

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 11

ctgagaaact gcttgttctt gcggcgccat atgagatctg acgctccttc gag 53

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 12

ctgcgcgcaa aactggcaaa cggcctgtaa aaagaggaga aatactag 48

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 13

ctgttgttct gcactctgtt gctacttaaa ttaaagagga gaatctaga 49

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 14

ctgttgttct gcactctgtt gctacttaaa aagaggagaa atactag 47

<210> 15

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 15

ggctggctat ttagcgtctt ctaatccagt gtagacagta gttttggctc cgttgagcac 60

tgtagccttg ggcgatcgct ctaaacatta cataaattca caaaagtttt cgttacataa 120

aaatagtgtc tacttagcta aaaattaagg gttttttaca cctttttgac agttaatctc 180

ctagcctaaa aagcaagagt ttttaactaa gactcttgcc ctttacaacc tcgaaggagc 240

gtcagatctc a 251

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 16

accgcggatc cgggaattcg ttagttctct ttggccagtt tttc 44

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 17

catgaagctt ggctggctat ttagcgtctt cta 33

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 18

catggaattc ttaaacctta gtggtctcat acacatg 37

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 19

catggaattc ggctggctat ttagcgtctt cta 33

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 20

cgtaaatcgt cgttctgata attatgagat ctgacgctcc ttcgag 46

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 21

atgaattatc agaacgacga tttacg 26

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequences)

<400> 22

catgggtacc tttacccgcg acgcgct 27