一种产L-赖氨酸的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种产L-赖氨酸的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸是动物和人类无法自身合成的氨基酸，属于八大必需氨基酸之一。由于在谷类在加工过程中赖氨酸很容易被破坏，L-赖氨酸得率极低，故L-赖氨酸称为第一限制性氨基酸。因此，L-赖氨酸广泛应用在动物饲料中，具有平衡饲料中氨基酸组成，提高动物贵氨基酸的摄取和代谢，促进包括家畜、家禽和鱼类等在内的生长发育，进而提高饲料蛋白质的利用率，节约生产成本，减少环境污染。全球L-赖氨酸市场目前估计为每年220万吨，并以每年10％左右的速度增长，在世界范围内年产量是继L-谷氨酸后的第二位氨基酸。目前，工业上用于发酵生产L-赖氨酸的菌种主要有大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。然而，E.coli和C.glutamicum直接应用于动物饲料中存在一些缺陷，如：存在内毒素、适口性差等。自2013年，国家规定的饲料添加剂目录里已明文规定饲料级L-赖氨酸中不得含有E.coli，而作为市场上饲用级L-赖氨酸产品规格主要是纯度为65％和70％。因此，我们急需开发食品安全性的微生物底盘细胞用于发酵生产饲用L-赖氨酸。

益生菌因其绿色、无残留、无污染的特性成为替代抗生素的最佳选择之一，受到国内外学者和饲料生产企业的广泛关注。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，已被美国食品和药品管理局(FDA)、美国饲料监察协会(AAFCO)和我国农业部认定为饲料安全性菌株，广泛用于饲料中。B.subtilis产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显抑制作用。同时，B.subtilis能合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶等，可降解饲料中复杂碳水化合物，提高饲料消化率，提高动物生产性能。此外，B.subtilis能刺激动物免疫器官的生长发育，激活T和B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。有研究表明，B.subtilis可使生猪日增重提高6％～7％，饲料转化率提高3％～4％，也能提高肉鸡的抗氧化能力，从而提高肉鸡生长性能。此外，为了有效提高饲料中营养物质的利用率，通过紫外诱变或其他代谢改造B.subtilis选育高产消化性酶类的突变菌株已成为B.subtilis发酵饲料发展趋势。然而，虽然B.subtilis作为益生菌广泛用于饲料中，但是该菌株不能有效积累L-赖氨酸。因此，饲料生产工业上为了同时满足家畜或家禽对L-赖氨酸和B.subtilis的需求，需要同时添加上述两种物质，从而将饲料生产工艺复杂化。此外，L-赖氨酸和B.subtilis的添加在一定程度上增加了企业生产成本。因此，实现B.subtilis高效合成L-赖氨酸有利于简化饲料生产工艺，降低生产成本，提高企业行业竞争力。

随着B.subtilis的基因组注释已经解析，其发酵生产L-赖氨酸的生物合成途径和调节机制也已比较清晰。由图1可知，以葡萄糖为原料时，B.subtilis中有5个途径参与L-赖氨酸合成：糖酵解途径(天蓝色线条)、磷酸戊糖途径(蓝色线条)、三羧酸(TCA)循环(黑色线条)、CO

发明内容

为解决上述问题，本发明以饲料工业上常用的益生菌B.subtilis ACCC11025为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术对磷酸戊糖途径、L-赖氨酸终端合成途径和L-赖氨酸竞争支路代谢途径进行重构，获得一株具有益生功能和L-赖氨酸高效合成能力的“双功能”枯草芽孢杆菌重组菌株。本发明结果为利用B.subtilis生产L-赖氨酸等饲用氨基酸提供参考，为实现简化饲料生产工艺提供了一定的理论基础。

本发明的第一个目的是提供一种代谢工程改造促进L-赖氨酸的合成的枯草芽孢杆菌重组菌，所述的重组菌以枯草芽孢杆菌ACCC11025为宿主，将B.subtilis中thrD、zwf和gnd用来源C.glutamicum中lysC

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌包括B.subtilis XH0、B.subtilis XH1、B.subtilis XH2、B.subtilis XH3、B.subtilis XH4、B.subtilis XH5或B.subtilis XH6。

其中，B.subtilis XH0、B.subtilis XH1、B.subtilis XH2、B.subtilis XH3、B.subtilis XH4、B.subtilis XH5和B.subtilis XH6保藏于江苏星海生物科技有限公司。

进一步地，所述的编码天冬氨酸激酶的基因lysC

进一步地，所述的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf

进一步地，所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd

进一步地，所述的编码高丝氨酸脱氢酶的基因hom

进一步地，所述的编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh来源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)天冬氨酸激酶基因lysC、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd和高丝氨酸脱氢酶基因hom的替换，以及异源表达DapDH基因ddh：以枯草芽孢杆菌ACCC11025为宿主，采用CRISPR-Cas9系统将基因thrD、zwf、gnd和hom替换为来源于C.glutamicum的lysC

(2)重组质粒构建：以酿脓链球菌的基因组作为模板，将基因Spcas9进行PCR扩增，随后利用限制性内切酶对质粒pHT01和片段Spcas9进行双酶切并酶连，获得目标重组质粒pHT01-Cas9。再将B.subtilis的thrD、zwf、gnd、hom和pksD基因的sgRNA无缝连接到质粒pBE980b，获得五个带有靶向位点的质粒。再将C.glutamicum的lysC

(3)重组菌构建：将重组质粒pHT01-Cas9电转至B.subtilis ACCC11025感受态细胞中，通过氨苄抗性筛选得到带有Cas9蛋白的转化子。再将其余重组质粒电转至带有Cas9蛋白的B.subtilis ACCC11025感受态细胞中，筛选得到所述的重组菌。

本发明的第三个目的是提供所述的重组菌发酵生产L-赖氨酸的方法，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，30～38℃，50～200r·min

进一步地，所述的种子培养基为：葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，牛肉蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L。

进一步地，所述的发酵培养基为：葡萄糖80g/L、玉米浆35g/L、甜菜糖蜜12g/L、NH

本发明的第四个目的是利用B.subtilis生产L-赖氨酸等饲用氨基酸提供参考，为实现简化饲料生产工艺提供了一定的理论基础。

本发明的有益效果：

本发明首次以饲料工业上常用的益生菌B.subtilis ACCC11025为出发菌株，围绕胞内前体物和辅因子NADPH供应、副产物积累和优化终端合成途径对L-赖氨酸合成的影响，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术对磷酸戊糖途径、L-赖氨酸终端合成途径和L-赖氨酸竞争支路代谢途径进行重构，获得一株具有益生功能和L-赖氨酸高效合成能力的“双功能”枯草芽孢杆菌重组菌株。实验结果表明，将B.subtilis中内源的参与L-赖氨酸合成的关键性酶替换成来源C.glutamicum中解除反馈调节作用的关键性酶(即：AK III、G6PD和6GPD)，可有效的为L-赖氨酸合成提供前体物和辅因子NADPH，保证在B.subtilis中有效积累L-赖氨酸。此外，将B.subtilis中L-赖氨酸合成支路途径中的限速酶HSD替换成来源C.glutamicum中渗漏型HSD，可实现在不影响菌体生长的情况下降到副产物积累，从而保证在B.subtilis中高效清洁发酵生产L-赖氨酸。进一步实验结果表明，在B.subtilis中引入来自C.glutamicum中的脱氢酶途径，可以引导碳流进入脱氢酶途径，从而途径L-赖氨酸的高效合成。经上述对B.subtilis基因组进行一系列的遗传改造，最终获得的重组菌株B.subtilis XH6中L-赖氨酸产量达到25.6±2.3g/L。

附图说明

图1：以葡萄糖为碳源时B.subtilis中L-赖氨酸生物合成途径

缩写说明：椭圆圈里指示的是编码基因，其中红色圈表示替代基因；

图2：目的重组质粒和目的重组菌株的验证

图形说明：图2A中，泳道1 pBE980b-gnd

图3：基因lysC替换和基因替换后重组菌株生长情况

图形说明：(A)基因序列比对；(B)B.subtilis XH0和B.subtilis XH1在LB(B1)和LB+AEC(B2)中的生长情况。

图4：不同菌株L-赖氨酸和菌体生长发酵情况

图5：不同菌株胞内NADPH水平以及L-赖氨酸和菌体生长发酵情况

图6：菌株XL-3和XL-5菌体生长和L-赖氨酸合成情况

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

以下实施例中以枯草芽孢杆菌B.subtilis XH0为例。

底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：发酵液于4℃和12000r/min离心5min后取上清，稀释100倍后，通过生物传感分析仪SBA-40C分析发酵液中葡萄糖和L-赖氨酸含量。酶活测定：采用超声波细胞破碎法处理细胞，离心取上清液获得粗酶液，该粗酶液保存于-20℃备用或立即用于酶活性的测定。HSD的测定采用吸光光度法进行。菌液浓度测定：定时取200μL发酵液，并用0.25mol/L的稀盐酸溶液稀释到5mL后，用紫外分光光度计于562nm下测定吸光度(即：OD

表1：实施例中所用到的引物(下划线为酶切位点)

实施例1：质粒pHT01-Cas9、pBE980b-hom

以酿脓链球菌的基因组作为模板，使用引物Spcas9-F和Spcas9-R将基因Spcas9进行PCR扩增，随后利用限制性内切酶XbaI和XamI对质粒pHT01和片段Spcas9进行双酶切并酶连，获得目标重组质粒pHT01-Cas9。

pBE980b-hom

以B.subtilis ACCC11025基因组为模板，利用引物hom-L-F、hom-L-R、hom-R-F、hom-R-R、lysC-L-F、lysC-L-R、lysC-R-F、lysC-R-R、zwf-L-F、zwf-L-R、zwf-R-F、zwf-R-R、gnd-L-F、gnd-L-R、gnd-R-F、gnd-R-R、pksD-L-F、pksD-L-R、pksD-R-F和pksD-R-R分别对基因hom、lysC、zwf、gnd以及pksD的上下同源臂进行扩增，同时以C.glutamicum为基因组，利用引物Cghom-F、Cghom-R、CglysC-F、CglysC-R、Cgzwf-F、Cgzwf-R、Cggnd-F、Cggnd-R、Cgddh-F和Cgddh-R分别扩增基因hom、lysC、zwf、gnd以及ddh。将回收后的同源臂片段以及基因片段同时作为模板，通过融合PCR进行基因融合，利用限制性核酸内切酶对融合片段以及带有靶向位点的质粒pBE980b进行酶切酶连，获得重组质粒pBE980b-hom

实施例2：目的重组菌株的筛选与鉴定

将重组质粒pHT01-Cas9、pBE980b-hom

实施例3：重组菌和出发菌株中的生长情况、G6PD和6GPD酶活力、胞内NADH浓度测定

生长情况测定：定时取200μL发酵液，并用0.25mol/L的稀盐酸溶液稀释到5mL后，用紫外分光光度计于562nm下测定吸光度(即：OD

重组菌株B.subtilis XH1(即：XH0 thrD：：lysC

需要指出的是，与出发菌株B.subtilis XH0相比，重组菌株B.subtilis XH1菌体生长并未受到明显抑制，最终菌体量为出发菌株的97.6％(OD

G6PD和6GPD酶活力测定：采用超声波细胞破碎法处理细胞，离心取上清液获得粗酶液，该粗酶液保存于-20℃备用或立即用于酶活性的测定，具体方法参照Xu等人建立的方法进行(Xu JZ，et al.，Amino Acids，2014，46(9)，2165-2175)。经测定，与出发菌株相比，重组菌株XH2和XH4中G6PD以及重组菌株XH3和XH4中6GPD都提高了对葡萄糖-6-磷酸(G6P)和NADP

表2不同重组菌株中G6PD和6GPD的酶学性质

注：

NADH浓度测定：通过离心(4℃，6,000rpm和10min)收获细胞，并用冰冷的淬火溶液(60％MeOH和70mM HEPES)洗涤3次以去除残留的细胞外代谢物，具体参照Xu等人方法测定(Xu JZ，et al.，Amino Acids，2014，46(9)，2165-2175)。G6PD和6GPD是细胞胞内NADPH再生的关键性酶，而胞内NADPH水平又显著影响控制着L-赖氨酸合成(图1)。经测定，由于不同重组菌株胞内G6PD和6GPD的酶活性不同，导致菌体胞内NADPH水平也不同(图5A)。从图5A可知，胞内G6PD和6GPD酶活力越高，胞内NADPH水平越高。重组菌株B.subtilis XH4胞内NADPH水平最高，从出发菌株B.subtilis XH1的3.51×10

实施例4：重组菌株产L-赖氨酸发酵情况

①种子培养基：葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，牛肉蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，121℃20min。②发酵培养基葡萄糖80g/L、玉米浆35g/L、甜菜糖蜜12g/L、(NH4)

将上述经验证的重组菌株和出发菌株分别进行摇瓶发酵实验。从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环枯草芽孢杆菌(出发菌和重组菌)接种到50mL装液量250mL液体种子培养基，4层纱布封口，30～38℃，50～200r·min

摇瓶发酵结果表明，重组菌株B.subtilis XH5(即：XH4 hom：：hom

表3不同菌株生长情况以及L-赖氨酸和副产物含量

且本发明在菌株B.subtilis XH5中引入C.glutamicum中二氨基庚二酸脱氢酶(DapDH，编码基因ddh)，获得重组菌株B.subtilis XH6(即：XH5 pksD：：ddh)。与出发菌株B.subtilis XH5不同，重组菌B.subtilis XH6表现出延滞的菌体生长，但最终菌体量两者基本一致(图6A)。此外，重组菌B.subtilis XH6中L-赖氨酸产量达到25.6±2.3g/L(图6B)，比菌株B.subtilis XH5增加了10.3％。研究表明，来源于C.glutamicum的GapDH可以调节B.subtilis中DAP碳通量，引导部分碳流进入脱氢酶途径，从而途径L-赖氨酸的高效合成。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。