抗体定向标记胶体金免疫探针及其制备方法以及基于抗体定向标记的铅离子试纸

技术领域

本发明涉及铅离子测试技术领域，具体涉及一种抗体定向标记胶体金免疫探针及其制备方法以及基于抗体定向标记的铅离子试纸。

背景技术

铅是对人类健康有巨大毒害作用的重金属元素之一，被广泛应用于油漆颜料、蓄电池和建筑材料等行业。它可以在环境中进行累积并通过食物链进入人体，严重危害人民身体健康。因此，重金属铅的检测技术研究对保障人民身体健康具有重要意义。

目前重金属铅的主要检测技术有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法、溶出伏安法和双硫腙比色法等检测方法。上述检测方法具有灵敏、准确等特点，但需要复杂的仪器设备或专门的仪器操作人员，不适用于铅离子现场快速检测。因此发展更为简便、高效、灵敏的铅离子检测技术迫在眉睫。胶体金免疫层析试纸条技术具有方便、快捷、直观等特点，被广泛应用于重金属等有毒有害物质快速检测。

但是，胶体金免疫探针制备主要采用物理吸附和化学结合的方法来实现抗体在胶体金表面的标记，上述标记方法操作简单、耗时短，但无法控制抗体在胶体金表面的空间取向，影响了抗体抗原结合位点(Fab)的暴露，降低了抗体在胶体金表面的有效标记。因此提供一种能够控制抗体空间取向且快速高效的检测铅离子的方式是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种抗体定向标记胶体金免疫探针及其制备方法以及基于抗体定向标记的铅离子试纸，旨在解决现有铅离子试纸无法控制抗体空间取向，抗体有效标记低的问题。

为实现上述目的，本发明提出的一种抗体定向标记胶体金免疫探针，其特征在于，包括以下组分：胶体金粒子、连接蛋白和抗铅离子单克隆抗体；

其中，所述连接蛋白用于连接所述胶体金粒子和所述抗铅离子单克隆抗体，所述连接蛋白包括特异性识别单克隆抗体Fc片段的蛋白。

可选地，所述特异性识别单克隆抗体Fc片段的蛋白包括重组蛋白A或重组蛋白G。

本发明还提出了一种抗体定向标记胶体金免疫探针的制备方法，包括以下步骤：

调节胶体金粒子的pH值至7～10，加入连接蛋白搅拌均匀后，再加入牛血清蛋白溶液，离心处理后获得第一沉淀；

将所述第一沉淀溶解在磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物；

向所述胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，离心处理后获得第二沉淀；

将所述第二沉淀溶解在磷酸缓冲液中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。

可选地，调节胶体金粒子的pH值至7～10，再加入连接蛋白，离心处理后获得第一沉淀的步骤中，

所述胶体金粒子和所述连接蛋白的质量比为100：(2～20)。

可选地，调节胶体金粒子的pH值至7～10，再加入连接蛋白，离心处理后获得第一沉淀的步骤包括：向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，调节pH值至7～10，加入连接蛋白，在25～37℃的条件下反应20～60min，再加入浓度为0.45～0.55％的牛血清蛋白溶液，在25～37℃的条件下反应20～60min，再在8000～12000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理3～8次后获得第一沉淀。

可选地，向所述胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，离心处理后获得第二沉淀的步骤中，

所述胶体金粒子和所述抗铅离子单克隆抗体的质量比为100：(10～20)。

可选地，向所述胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，离心处理后获得第二沉淀的步骤包括：向所述胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，在25～37℃的条件下反应60～150min，再在6000～12000r/min的转速下离心处理6～12min，离心处理2～4次，获得第二沉淀。

此外，本发明还提出了一种基于抗体定向标记的铅离子试纸，包括：

抗体定向标记胶体金免疫探针，所述抗体定向标记胶体金免疫探针包括以下组分：胶体金粒子、连接蛋白和抗铅离子单克隆抗体；其中，所述连接蛋白用于连接所述胶体金粒子和所述抗铅离子单克隆抗体，所述连接蛋白包括特异性识别单克隆抗体Fc片段的蛋白；以及，

试纸条，所述试纸条包括吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫和衬板，所述吸水垫、所述硝酸纤维素膜和所述样品垫沿第一方向依次设于所述衬板上，所述吸水垫和所述样品垫各自与所述硝酸纤维素膜连接的一端设于所述硝酸纤维素膜的上端，且至少包裹部分所述硝酸纤维素膜。

可选地，所述硝酸纤维素膜的上侧面上沿第一方向依次设有质控线和检测线，所述质控线和所述检测线沿第二方向延伸设置，所述质控线的材质包括抗鼠源性单克隆抗体的兔抗或抗鼠源性单克隆抗体的羊抗，所述检测线的材质包括铅离子抗原。

可选地，所述抗鼠源性单克隆抗体的兔抗的浓度为0.45～0.55mg/mL；和/或，

所述抗鼠源性单克隆抗体的羊抗的浓度为0.45～0.55mg/mL；和/或，

所述铅离子抗原的浓度为0.2～0.5mg/mL。

在本发明技术方案中，采用所述抗体定向标记胶体金免疫探针，能够实现铅离子快速、有效、灵敏且高效的检测，检测成本低，可有效的控制所述抗铅离子单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的空间取向，提高有效标记；其中，所述连接蛋白作为所述胶体金粒子和所述抗铅离子单克隆抗体的连接中介，该所述连接蛋白可特异性识别抗铅离子单克隆抗体上的可结晶片段(即Fc片段)，从而保证所述抗铅离子单克隆抗体的抗原结合位点能够充分的暴露出来，提高所述抗铅离子单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的有效标记，在一定程度上减少所述抗铅离子单克隆抗体的使用量，降低检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明提供的抗体定向标记胶体金免疫探针的抗体定向标记的原理示意图；

图2为本发明提供的抗体定向标记胶体金免疫探针的制备方法的流程示意图；

图3为本发明提供的试纸条的一实施例的结构示意图；

图4为图3中试纸条的另外一视角的结构示意图；

图5为本发明提供的实施例1中胶体金-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图；

图6为本发明提供的实施例2中胶体金-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图；

图7本发明提供的实施例3中胶体金-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图；

图8本发明提供的实施例4中胶体金-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图；

图9本发明提供的实施例5中胶体金-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图；

图10为本发明提供的实施例1的铅离子浓度检测图；

图11为本发明提供的实施例2的铅离子浓度检测图；

图12为本发明提供的实施例3的铅离子浓度检测图；

图13为本发明提供的实施例4的铅离子浓度检测图；

图14为本发明提供的实施例5的铅离子浓度检测图。

附图标号说明：

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

胶体金免疫探针制备主要采用物理吸附和化学结合的方法来实现抗体在胶体金表面的标记，上述标记方法操作简单、耗时短，但无法控制抗体在胶体金表面的空间取向，影响了抗体的抗原结合位点的暴露，降低了抗体在胶体金表面的有效标记。

鉴于此，本发明提供一种抗体定向标记胶体金免疫探针，采用本发明提供的抗体定向标记胶体金免疫探针进行铅离子浓度检测，可以保证抗体抗原结合位点(Fab)的充分暴露，提高了抗体在胶体金表面的有效标记，减少了抗体用量；图1为本发明提供的抗体定向标记胶体金免疫探针的一实施例的示意图，图2为本发明提供的抗体定向标记胶体金免疫探针的一实施例的流程示意图，图3为本发明提供的基于抗体定向标记的铅离子试纸的一实施例的示意图；图4至图5为本发明提供的胶体金-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图。

请参阅图1，所述抗体定向标记胶体金免疫探针100包括以下组分：胶体金粒子1、连接蛋白2和抗铅离子单克隆抗体3；其中，所述连接蛋白2用于连接所述胶体金粒子1和所述所述抗铅离子单克隆抗体3，所述连接蛋白2包括特异性识别单克隆抗体Fab片段的蛋白。

在本发明技术方案中，采用所述抗体定向标记胶体金免疫探针100，能够实现铅离子快速、有效、灵敏且高效的检测，检测成本低，可有效的控制所述抗铅离子单克隆抗体3在所述胶体金粒子1表面的空间取向，提高有效标记；其中，所述连接蛋白2作为所述胶体金粒子1和所述抗铅离子单克隆抗体3的连接中介，该所述连接蛋白2可特异性识别抗铅离子单克隆抗体3上的可结晶片段(即Fc片段)，从而保证所述抗铅离子单克隆抗体3的抗原结合位点能够充分的暴露出来，提高所述抗铅离子单克隆抗体3在所述胶体金粒子1表面的有效标记，在一定程度上减少所述抗铅离子单克隆抗体3的使用量，降低检测成本。

进一步地，在本实施例中，在选取所述特异性识别单克隆抗体Fc片段的蛋白时，需要注意的是要保证所述抗铅离子单克隆抗体3的抗原结合位点(Fab)充分暴露，因此，在一实施例中，所述特异性识别单克隆抗体Fc片段的蛋白选择为重组蛋白A，在另外一实施例中，所述特异性识别单克隆抗体Fc片段的蛋白选择为重组蛋白G；所述重组蛋白A和所述重组蛋白G均能够保证所述抗铅离子单克隆抗体3的抗原结合位点(Fab)充分暴露，从而提高所述抗铅离子单克隆抗体3在所述胶体金粒子1表面的有效标记。

此外，请参阅图2，本发明提供了一种抗体定向标记胶体金免疫探针的制备方法，采用本发明提供的抗体定向标记胶体金免疫探针的制备方法制备的抗体定向标记胶体金免疫探针100进行铅离子浓度检测，可以保证抗体抗原结合位点(Fab)的充分暴露，提高了抗体在胶体金表面的有效标记，减少了抗体用量，降低了检测成本，所述抗体定向标记胶体金免疫探针的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、调节胶体金粒子1的pH值至7～10，加入连接蛋白2搅拌均匀后，再加入牛血清蛋白4溶液，离心处理后获得第一沉淀。

在本实施例中，在制备所述第一沉淀之前，需要先将所述胶体金粒子1的pH值调节至7～10之间，具体操作是在调节所述胶体金粒子1时，向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，然后搅拌均匀，将pH值调节至7～10之间的目的是为了给所述连接蛋白2提供友好的环境，使得所述连接蛋白2能够稳定的吸附在所述胶体金粒子1的表面。

在本实施例中，加入所述连接蛋白2的目的是作为所述胶体金粒子1和所述抗铅离子单克隆抗体3的连接中介，该所述连接蛋白2可特异性识别抗铅离子单克隆抗体上的可结晶片段(即Fc片段)，从而保证所述抗铅离子单克隆抗体3的抗原结合位点(Fab)能够充分的暴露出来，提高所述抗铅离子单克隆抗体3在所述胶体金粒子1表面的有效标记。

此外，在反应的过程中，反应温度和反应时间都对最终制备出来的抗体定向标记胶体金免疫探针100的质量有影响，具体地，在进行步骤S10时，可以通过以下步骤进行操作：在胶体金粒子1中加入碳酸钾溶液，调节pH值至7～10，加入连接蛋白2，在25～37℃的条件下反应20～60min，再加入浓度为0.45～0.55％的牛血清蛋白4溶液，在25～37℃的条件下反应20～60min，再在8000～12000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理3～8次后获得第一沉淀。其中，多次离心处理的目的是能够保证游离的所述连接蛋白2和所述牛血清蛋白4与所述第一沉淀能够充分的分离，节省后续步骤中所述抗铅离子单克隆抗体3的浪费，节约制造成本。

在本实施例中，所述胶体金粒子1和所述连接蛋白2的质量比为100：(2～20)。

步骤S20、将所述第一沉淀溶解在磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物。

在本实施例中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L。

步骤S30、向所述胶体金-连接蛋白复合物中加入所述抗铅离子单克隆抗体3，离心处理后获得第二沉淀。

具体地，在进行步骤S30时，可以通过以下步骤进行操作：向所述胶体金-连接蛋白复合物中加入所述抗铅离子单克隆抗体3，在25～37℃的条件下反应60～150min，再在6000～12000r/min的转速下离心处理6～12min，离心处理2～4次，获得第二沉淀。

其中，所述胶体金粒子1和所述抗铅离子单克隆抗体3的质量比为100：(10-20)。

步骤S40、将所述第二沉淀溶解在磷酸缓冲液中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针100。

在本实施例中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.01mol/L。

此外，本发明还提供了一种基于抗体定向标记的铅离子试纸，采用本发明提供的抗体定向标记的铅离子试纸测试铅离子浓度，能够实现铅离子快速、灵敏且高效检测，所述基于抗体定向标记的铅离子试纸包括抗体定向标记胶体金免疫探针100和试纸条200；所述抗体定向标记胶体金免疫探针100的具体结构和制备方法参考上述实施例，由于本所述抗体定向标记胶体金免疫探针100采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有的有益效果，在此不再一一赘述。所述试纸条200包括吸水垫10、硝酸纤维素膜20、样品垫30和衬板40，所述吸水垫10、所述硝酸纤维素膜20和所述样品垫30沿第一方向依次设于所述衬板40上，所述吸水垫10和所述样品垫30各自与所述硝酸纤维素膜20连接的一端设于所述硝酸纤维素膜20的上端，且至少包裹部分所述硝酸纤维素膜20。

在本实施例中，所述吸水垫10和所述样品垫30各自与所述硝酸纤维素膜20连接的一端设于所述硝酸纤维素膜20的上端，且至少包裹部分所述硝酸纤维素膜20。如此设置的目的是为了在检测时便于检测试剂的扩散，使得检测液能够快速的扩散到所述硝酸纤维素膜20上，提高检测效率，此外，为了确保检测结果的可靠性，所述吸水垫10至少包裹所述硝酸纤维素膜20的长度为1～3mm，所述样品垫30至少包裹所述硝酸纤维素膜20的长度为1～3mm，需要说明的是，在此范围内，检测液能够快速的在所述硝酸纤维素膜20上扩散，且不会对所述硝酸纤维素膜20的检测造成影响。如果所述样品垫30或者所述吸水垫10包裹所述硝酸纤维素膜20的长度低于1mm，则会导致检测液扩散的时间延长，检测效率降低；如果所述吸水垫10或者所述样品垫30包裹所述硝酸纤维素膜20的长度大于3mm，则会影响所述硝酸纤维素膜20反馈测试结果，导致测试数据不可靠。

请参阅图3，所述硝酸纤维素膜20的上侧面上沿第一方向依次设有质控线201和检测线202，所述质控线201和所述检测线202沿第二方向延伸设置，所述质控线201的材质包括抗鼠源性单克隆抗体的兔抗或抗鼠源性单克隆抗体的羊抗，所述检测线202的材质包括铅离子抗原。具体地，在实际应用中，所述质控线201设于所述硝酸纤维素膜20靠近所述吸水垫10的一侧，所述检测线202设于所述硝酸纤维素膜20靠近所述样品垫30的一侧，如此设置更加符合检测人员的使用习惯，便于检测，提高检测效率。

进一步地，所述抗鼠源性单克隆抗体的兔抗的浓度为0.45～0.55mg/mL；所述抗鼠源性单克隆抗体的羊抗的浓度为0.45～0.55mg/mL；所述铅离子抗原的浓度为0.2～0.5mg/mL。

更进一步地，所述质控线201的划膜量为0.5～0.6μL/cm，所述检测线202的划膜量为0.5～0.6μL/cm。

具体地，在本实施例中，所述试纸条200可以通过以下方法进行制备：在所述衬板40具有粘性的一侧面上沿着第一方向分别黏贴所述吸水垫10、所述硝酸纤维膜20和所述样品垫30，其中，在黏贴的过程中需要注意的是，所述吸水垫10与所述硝酸纤维膜20之间重叠1～3mm，所述样品垫30与所述硝酸纤维膜20之间重叠1～3mm。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)制备抗体定向标记胶体金免疫探针

向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，调节pH值至7.3，按照胶体金粒子和重组蛋白G的质量比为100：18的比例加入重组蛋白G，在37℃的条件下反应30min，再加入浓度为0.5％的牛血清蛋白溶液，在37℃的条件下反应30min，再在9500r/min的转速下离心处理13min，离心处理7次后获得第一沉淀。

将第一沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物。

按照胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体的质量比为100:17.5的比例向胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，在37℃的条件下反应120min，再在8000r/min的转速下离心处理10min，离心处理3次，获得第二沉淀和上清液。

将第二沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的用量为沉淀第二沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。

(2)制备试纸条

在衬板具有粘性的一侧面上沿着第一方向分别黏贴吸水垫、硝酸纤维膜和样品垫，其中吸水垫和样品垫与硝酸纤维膜之间重叠的距离均为2mm，质控线上包被有0.5mg/mL的抗鼠源性单克隆抗体的羊抗，检测线上包被有0.3mg/mL的铅离子抗原，质控线和检测线的划膜量均为0.6μL/cm。

(3)检测铅离子浓度

获得铅离子标准溶液，向铅离子标准溶液加入乙二胺四乙酸二钠螯合剂，37℃的温度下反应10min，然后加入浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液，调节pH至7.4，并稀释成一定浓度梯度的铅离子标准溶液(其中浓度梯度的铅离子标准溶液为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。将上述浓度梯度的铅离子标准溶液和抗体定向标记胶体金免疫探针溶液加入至微孔中混合均匀，再将铅离子试纸条样品垫端插入至微孔中，室温反应15min后肉眼观察质控线是否显色，同时，将试纸条上的检测线的颜色与标准色卡对比，观察检测线的颜色深浅程度，即可获得铅离子浓度。

需要说明的是，在本发明中，标准色卡为铅离子标准溶液为0ng/mL时，试纸条上的检测线的所呈现的颜色。

检测结果请参阅图5和图10，由图5中的表征图可以看出重组蛋白G成功连接胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体，由图10可以看出试纸条能够清晰的检测出不同浓度的铅离子(需要说明的是图10中的0、2、4、6、8、10表示的铅离子标准溶液分别为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。

实施例2

(1)制备抗体定向标记胶体金免疫探针

向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，调节pH值至9.8，按照胶体金粒子和重组蛋白A的质量比为100：3的比例加入重组蛋白A，在28℃的条件下反应50min，再加入浓度为0.55％的牛血清蛋白溶液，在28℃的条件下反应50min，再在11000r/min的转速下离心处理12min，离心处理6次后获得第一沉淀。

将第一沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物。

按照胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体的质量比为100：12.3比例向胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，在28℃的条件下反应150min，再在10000r/min的转速下离心处理8min，离心处理3次，获得第二沉淀和上清液。

将第二沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的用量为沉淀第二沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。

(2)制备试纸条

在衬板具有粘性的一侧面上沿着第一方向分别黏贴吸水垫、硝酸纤维膜和样品垫，其中吸水垫和样品垫与硝酸纤维膜之间重叠的距离均为2mm，质控线上包被有0.5mg/mL的抗鼠源性单克隆抗体的羊抗，检测线上包被有0.3mg/mL的铅离子抗原，质控线和检测线的滑膜量均为0.6μL/cm。

(3)检测铅离子浓度

获得铅离子标准溶液，向铅离子标准溶液加入乙二胺四乙酸二钠螯合剂，28℃的温度下反应10min，然后加入浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液，调节pH至7.4，并稀释成一定浓度梯度的铅离子标准溶液(其中浓度梯度的铅离子标准溶液为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。将上述浓度梯度的铅离子标准溶液和抗体定向标记胶体金免疫探针溶液加入至微孔中混合均匀，再将铅离子试纸条样品垫端插入至微孔中，室温反应15min后肉眼观察质控线是否显色，同时，将试纸条上的检测线的颜色与标准色卡对比，观察检测线的颜色深浅程度，即可获得铅离子浓度。

检测结果请参阅图6和图11，由图6中的表征图可以看出重组蛋白A成功连接胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体，由图11可以看出试纸条能够清晰的检测出不同浓度的铅离子(需要说明的是图11中的0、2、4、6、8、10表示的铅离子标准溶液分别为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。

实施例3

(1)制备抗体定向标记胶体金免疫探针

向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，调节pH值至7.5，按照胶体金粒子和重组蛋白G的质量比为100：20的比例加入重组蛋白G，在25℃的条件下反应20min，再加入浓度为0.45％的牛血清蛋白溶液，在25℃的条件下反应20min，再在8000r/min的转速下离心处理5min，离心处理3次后获得第一沉淀。

将第一沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物。

按照胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体的质量比为100：20的比例向胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，在25℃的条件下反应60min，再在6000r/min的转速下离心处理6min，离心处理2次，获得第二沉淀和上清液。

将第二沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的用量为沉淀第二沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。

(2)制备试纸条

在衬板具有粘性的一侧面上沿着第一方向分别黏贴吸水垫、硝酸纤维膜和样品垫，其中吸水垫和样品垫与硝酸纤维膜之间重叠的距离均为1mm，质控线上包被有0.45mg/mL的抗鼠源性单克隆抗体的兔抗，检测线上包被有0.3mg/mL的铅离子抗原，质控线和检测线的滑膜量均为0.6μL/cm。

(3)检测铅离子浓度

获得铅离子标准溶液，向铅离子标准溶液加入乙二胺四乙酸二钠螯合剂，25℃的温度下反应10min，然后加入浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液，调节pH至7.4，并稀释成一定浓度梯度的铅离子标准溶液(其中浓度梯度的铅离子标准溶液为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。将上述浓度梯度的铅离子标准溶液和抗体定向标记胶体金免疫探针溶液加入至微孔中混合均匀，再将将铅离子试纸条样品垫端插入至微孔中，室温反应15min后肉眼观察质控线是否显色，同时，将试纸条上的检测线的颜色与标准色卡对比，观察检测线的颜色深浅程度，即可获得铅离子浓度。

检测结果请参阅图7和图12，由图7中的表征图可以看出重组蛋白G成功连接胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体，由图12可以看出试纸条能够清晰的检测出不同浓度的铅离子(需要说明的是图12中的0、2、4、6、8、10表示的分别是铅离子标准溶液分为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。

实施例4

(1)制备抗体定向标记胶体金免疫探针

向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，调节pH值至10，按照胶体金粒子和重组蛋白A的质量比为100：2的比例加入重组蛋白A，在30℃的条件下反应60min，再加入浓度为0.55％的牛血清蛋白溶液，在30℃的条件下反应60min，再在12000r/min的转速下离心处理15min，离心处理3次后获得第一沉淀。

将第一沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物

按照胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体的质量比为100：10的比例向胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，在30℃的条件下反应150min，再在12000r/min的转速下离心处理12min，离心处理4次，获得第二沉淀和上清液。

将第二沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的用量为沉淀第二沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。

(2)制备试纸条

在衬板具有粘性的一侧面上沿着第一方向分别黏贴吸水垫、硝酸纤维膜和样品垫，其中吸水垫和样品垫与硝酸纤维膜之间重叠的距离均为2mm，质控线上包被有0.55mg/mL的抗鼠源性单克隆抗体的羊抗，检测线上包被有0.3mg/mL的铅离子抗原，质控线和检测线的滑膜量均为0.6μL/cm。

(3)检测铅离子浓度

获得铅离子标准溶液，向铅离子标准溶液加入乙二胺四乙酸二钠螯合剂，30℃的温度下反应10min，然后加入浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液，调节pH至7.4，并稀释成一定浓度梯度的铅离子标准溶液(其中浓度梯度的铅离子标准溶液为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。将上述浓度梯度的铅离子标准溶液和抗体定向标记胶体金免疫探针溶液加入至微孔中混合均匀，再将将铅离子试纸条样品垫端插入至微孔中，室温反应15min后肉眼观察质控线是否显色，同时，将试纸条上的检测线的颜色与标准色卡对比，观察检测线的颜色深浅程度，即可获得铅离子浓度。

检测结果请参阅图8和图13，由图8中的表征图可以看出重组蛋白A成功连接胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体，由图13可以看出试纸条能够清晰的检测出不同浓度的铅离子(需要说明的是图13中的0、2、4、6、8、10表示的分别是铅离子标准溶液分为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。

实施例5

(1)制备抗体定向标记胶体金免疫探针

向胶体金粒子中滴加碳酸钾溶液，调节pH值至9，按照胶体金粒子和重组蛋白A的质量比为100：9的比例加入重组蛋白A，在35℃的条件下反应40min，再加入浓度为0.5％的牛血清蛋白溶液，在35℃的条件下反应40min，再在10000r/min的转速下离心处理10min，离心处理5次后获得第一沉淀。

将第一沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液中，获得胶体金-连接蛋白复合物。

按照胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体的质量比为100：20的比例向胶体金-连接蛋白复合物中加入抗铅离子单克隆抗体，在35℃的条件下反应10min，再在10000r/min的转速下离心处理10min，离心处理3次，获得第二沉淀和上清液。

将第二沉淀溶解在浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的用量为沉淀第二沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。

(2)制备试纸条

在衬板具有粘性的一侧面上沿着第一方向分别黏贴吸水垫、硝酸纤维膜和样品垫，其中吸水垫和样品垫与硝酸纤维膜之间重叠的距离均为2mm，质控线上包被有0.52mg/mL的抗鼠源性单克隆抗体的兔抗，检测线上包被有0.4mg/mL的铅离子抗原，质控线和检测线的滑膜量均为0.6μL/cm。

(3)检测铅离子浓度

获得铅离子标准溶液，向铅离子标准溶液加入乙二胺四乙酸二钠螯合剂，35℃的温度下反应10min，然后加入浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液，调节pH至8，并稀释成一定浓度梯度的铅离子标准溶液(其中浓度梯度的铅离子标准溶液为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。将上述浓度梯度的铅离子标准溶液和抗体定向标记胶体金免疫探针溶液加入至微孔中混合均匀，再将将铅离子试纸条样品垫端插入至微孔中，室温反应15min后肉眼观察质控线是否显色，同时，将试纸条上的检测线的颜色与标准色卡对比，观察检测线的颜色深浅程度，即可获得铅离子浓度。

检测结果请参阅图9和图14，由图9中的表征图可以看出重组蛋白A成功连接胶体金粒子和抗铅离子单克隆抗体，由图14可以看出试纸条能够清晰的检测出不同浓度的铅离子(需要说明的是图14中的0、2、4、6、8、10表示的铅离子标准溶液分别为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL和10ng/mL)。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。