一种大斯托克斯位移近红外发射染料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光染料技术领域，具体涉及一种大斯托克斯位移近红外发射染料及其制备方法和应用。

背景技术

罗丹明染料是一类量子产率高、摩尔消光系数大、易于修饰的荧光染料。常用于亚细胞器成像，蛋白及抗体标记以及生物传感领域。然而，现有的罗丹明染料具有非常小的斯托克斯位移(<20nm)，在进行生物成像时，非常容易受到激发光散射的干扰，导致成像信噪比较低，极大程度上的限制了其进一步发展。

与此同时，传统罗丹明染料的发射波长位移黄绿光区(500nm–570nm)范围内，非常容易受到生物体内的背景信号的干扰，同样造成成像信噪比降低。较短的发射波长，也体现出较差的深层组织穿透能力，因此不利于进行活体成像。

更为重要的是，传统罗丹明染料极易受到亲核试剂(例如谷胱甘肽)的进攻导致荧光淬灭，表现出较差的稳定性，因此不能够完美的在复杂体系中实现目标应用。

因此，开发能够解决传统罗丹明染料斯托克斯位移小，发射波长短、稳定性差等缺点的新型罗丹明衍生物，对于生物化学领域的染料分子库的扩充以及探索与解决相关生物医学基本问题具有非常深远的意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种大斯托克斯位移近红外发射染料及其制备方法和应用，以解决传统罗丹明染料斯托克斯位移小，发射波长短、稳定性差的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种大斯托克斯位移近红外发射染料，结构通式如下所示：

其中，R为C1-C10烷基链或芳香基团。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，大斯托克斯位移近红外发射染料的结构式如下所示：

其中，R为C1-C10烷基链或芳香基团。

进一步，R为丙基。

上述大斯托克斯位移近红外发射染料的制备方法包括以下步骤：

(1)将不同取代基的苯胺和甲醛水溶液溶于第一有机溶剂中搅拌反应，得到第一中间体；

(2)将第一中间体加入发烟硫酸搅拌反应，得到第二中间体；

(3)将第二中间体和三氯化铁溶于稀盐酸中搅拌反应，得到第三中间体；

(4)将第三中间体溶于第二有机溶剂，搅拌下，加入弱碱，而后加入三氟甲磺酸酐，搅拌下加入RNH

进一步，步骤(1)中不同取代基的苯胺和甲醛水溶液的摩尔比为1:0.5-0.8。

进一步，步骤(1)中反应温度为室温，反应时间为10-16小时。

进一步，步骤(1)中第一有机溶剂为乙酸和/或丙酸。

进一步地，步骤(2)中第一中间体与发烟硫酸的摩尔体积为1mmol：15-30ml。

进一步地，步骤(2)中反应温度为80-95℃，反应时间为4-8小时，反应结束后冷却，并调节pH值至中性，制得第二中间体。

进一步，步骤(3)中第二中间体和三氯化铁的摩尔比为1:2-4。

进一步，步骤(3)中反应温度为80-95℃，反应时间为10-16小时，反应结束后，调节反应物pH值至中性，得到第三中间体。

进一步，步骤(3)中稀盐酸的浓度为0.5-2M，优选浓度为1M。

进一步，步骤(4)中具体过程为：将第三中间体溶于第二有机溶剂，搅拌下，加入弱碱，然后将体系冷却至零度，加入三氟甲磺酸酐，继续搅拌0.5-1.5小时后将RNH

进一步，步骤(4)中第三中间体、弱碱、三氟甲磺酸酐和RNH

进一步，步骤(4)中第二有机溶剂包括二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃和DMF中的至少一种。

进一步，步骤(4)中弱碱为吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、碳酸钾和碳酸铯中的至少一种。

上述大斯托克斯位移近红外发射染料在作为发光材料或生物荧光探针或在生物荧光成像方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明以砜基取代的氨基罗丹明作为基础染料骨架，通过进行不同形式的芳香胺或烷基胺的修饰，设计并合成了大斯托克斯位移近红外发射的高稳定性的新型荧光染料。该类染料较传统罗丹明染料有显著提升的斯托克斯位移，显著红移的发射波长，较好的稳定性，较高的量子产率，具有非常高的生物应用前景，可用于体外培养细胞、组织细胞的荧光染色成像。具体为：本发明制得的染色试剂具有较大的斯托克斯位移(＞120nm)可以有效避免背景光的干扰。本发明的染色试剂具有近红外发射波长(＞650nm)，能够有效降低背景荧光的干扰，提升了细胞成像结果的准确性，并且使深层组织成像或活体成像成为可能。

附图说明

图1为实施例1制得的染色试剂的氢谱。

图2为实施例1制得的染色试剂的碳谱。

图3为实施例2制得的染色试剂的氢谱。

图4为实施例2制得的染色试剂的碳谱。

图5为实施例3制得的染色试剂的氢谱。

图6为实施例3制得的染色试剂的碳谱。

图7为实施例4制得的染色试剂的氢谱。

图8为实施例4制得的染色试剂的碳谱。

图9为实施例5制得的染色试剂的氢谱。

图10为实施例5制得的染色试剂的碳谱。

图11为实施例1制得的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

图12为实施例2制得的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

图13为实施例3制得的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

图14为实施例4制得的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

图15为实施例5制得的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

图16为实施例1、2、3制得的染色试剂MTS细胞毒性实验结果。

图17为实施例1-4制得的染色试剂在HepG2细胞中的溶酶体染色激光共聚焦实验结果。

图18为实施例1-5制得的染色试剂在HepG2细胞中的光稳定性实验结果。

具体实施方式

本发明实施例中，N,N-二甲基苯胺、甲醛水溶液、发烟硫酸、各类溶剂、催化剂、碱购于阿拉丁科技有限公司，细胞株购于ATCC(American Type Culture Collection)，10％胎牛血清(FBS)购于Hyclone，1640培养基购于美国Gibco。

现以R为丙基为例给出本发明大斯托克斯位移近红外发射染料的合成路线，具体反应原理如下：

(1)将N,N-二甲基苯胺和甲醛水溶液溶于第一有机溶剂中搅拌，得到第一中间体；

(2)将第一中间体加入发烟硫酸搅拌，得到第二中间体；

(3)将第二中间体和三氯化铁溶于1M的稀盐酸中，搅拌，得到第三中间体；

(4)将第三中间体溶于第二有机溶剂，搅拌下，加入第一弱碱，而后加入三氟甲磺酸酐，搅拌下加入RNH

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种大斯托克斯位移近红外发射染料，结构式如下：

上述大斯托克斯位移近红外发射染料的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成第一中间体A1

将N,N-二甲基苯胺(1.0mmol)、甲醛水溶液(0.6mmol)在乙酸(25mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。用二氯甲烷(30mL×3)萃取水溶液。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na

(2)合成第二中间体A2

将A1(1mmol)加入到发烟硫酸(20ml)中，将溶液在90℃搅拌6小时，然后缓慢将混合物倒入冰块中。随后调pH值至中性，抽滤，滤饼真空干燥，得到第二中间体A2为灰白色固体，产率为82％。

(3)合成第三中间体A3

将化合物A2(1mmol),三氯化铁(3mmol)加入50mL 1M的稀盐酸中，90℃反应12小时，薄层色谱监测反应完全后，调整反应混合物pH值至中性，抽滤，水洗涤，并使用真空干燥箱干燥。用200-300目硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷/甲醇(200：1)洗脱，得到第三中间体为淡黄色固体，产率为48％。

(4)合成大斯托克斯位移近红外发射染料

在二氯甲烷(50mL)中加入化合物A3(1mmol)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(5mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体A4，产率为57％。

本实施例制得的大斯托克斯位移近红外发射染料的氢谱和碳谱分别如图1和图2所示。

实施例2：

一种大斯托克斯位移近红外发射染料，结构式如下：

上述大斯托克斯位移近红外发射染料的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成第一中间体B1

将N-苯基吡咯烷(1.0mmol)、甲醛水溶液(0.6mmol)在乙酸(25mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。用二氯甲烷(30mL×3)萃取水溶液。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na

(2)合成第二中间体B2

将B1(1mmol)加入到发烟硫酸(20ml)中，将溶液在90℃搅拌6小时，然后缓慢将混合物倒入冰块中。随后调pH值至中性，抽滤，滤饼真空干燥，得到第二中间体B2为灰白色固体，产率为82％。

(3)合成第三中间体B3

将化合物B2(1mmol),三氯化铁(3mmol)加入50mL 1M的稀盐酸中，90℃反应12小时，薄层色谱监测反应完全后，调整反应混合物pH值至中性，抽滤，水洗涤，并使用真空干燥箱干燥。用200-300目硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷/甲醇(200：1)洗脱，得到第三中间体为淡黄色固体，产率为48％。

(4)合成大斯托克斯位移近红外发射染料

在二氯甲烷(50mL)中加入化合物B3(1mmol)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(5mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体B4，产率为52％。

本实施例制得的大斯托克斯位移近红外发射染料的氢谱和碳谱分别如图3和图4所示。

实施例3：

一种大斯托克斯位移近红外发射染料，结构式如下：

上述大斯托克斯位移近红外发射染料的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成第一中间体C1

将四氢喹啉(1.0mmol)、碘甲烷(1.5mmol)、碳酸钾(1.5mmol)在乙腈(25mL)中混合搅拌12小时，随后抽滤除去碳酸钾，减压蒸馏除溶剂后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(20：1)洗脱，得到第一中间体为淡黄色液体，产率为88％。

(2)合成第二中间体C2

将C1(1.0mmol)、甲醛水溶液(0.6mmol)在乙酸(25mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。用二氯甲烷(30mL×3)萃取水溶液。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na

(3)合成第三中间体C3

将C2(1mmol)加入到发烟硫酸(20ml)中，将溶液在90℃搅拌6小时，然后缓慢将混合物倒入冰块中。随后调pH值至中性，抽滤，滤饼真空干燥，得到第二中间体C3为灰白色固体，产率为82％。

(4)合成第四中间体C4

将化合物C3(1mmol),三氯化铁(3mmol)加入50mL 1M的稀盐酸中，90℃反应12小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物pH值调至中性，抽滤，水洗涤，并使用真空干燥箱干燥。用200-300目硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷/甲醇(200：1)洗脱，得到第四中间体为淡黄色固体，产率为32％。

(5)合成大斯托克斯位移近红外发射染料

在二氯甲烷(50mL)中加入化合物C4(1mmol)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(5mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体C5，产率为40％。

本实施例制得的大斯托克斯位移近红外发射染料的氢谱和碳谱分别如图5和图6所示。

实施例4：

一种大斯托克斯位移近红外发射染料，结构式如下：

上述大斯托克斯位移近红外发射染料的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成第一中间体D1

将久洛尼定(1.0mmol)、甲醛水溶液(0.6mmol)在乙酸(25mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。用二氯甲烷(30mL×3)萃取水溶液。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na

(2)合成第二中间体D2

将D1(1mmol)加入到发烟硫酸(20ml)中，将溶液在90℃搅拌6小时，然后缓慢将混合物倒入冰块中。随后调pH值至中性，抽滤，滤饼真空干燥，得到第二中间体D2为灰白色固体，产率为77％。

(3)合成第三中间体D3

将化合物D2(1mmol),三氯化铁(3mmol)加入50mL 1M的稀盐酸中，90℃反应12小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物pH值调至中性，抽滤，水洗涤，并使用真空干燥箱干燥。用200-300目硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷/甲醇(200：1)洗脱，得到第三中间体为淡黄色固体，产率为33％。

(4)合成大斯托克斯位移近红外发射染料

在二氯甲烷(50mL)中加入化合物D3(1mmol)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(5mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体D4，产率为38％。

本实施例制得的大斯托克斯位移近红外发射染料的氢谱和碳谱分别如图7和图8所示。

实施例5：

一种大斯托克斯位移近红外发射染料，结构式如下：

上述大斯托克斯位移近红外发射染料的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成第一中间体E1

将吲哚啉(1.0mmol)、碘甲烷(1.5mmol)、碳酸钾(1.5mmol)在乙腈(25mL)中混合搅拌12小时，随后抽滤除去碳酸钾，减压蒸馏除溶剂后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(20：1)洗脱，得到第一中间体为淡黄色液体，产率为99％。

(2)合成第二中间体E2

将E1(1.0mmol)、甲醛水溶液(0.6mmol)在乙酸(25mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。用二氯甲烷(30mL×3)萃取水溶液。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na

(3)合成第三中间体E3

将E2(1mmol)加入到发烟硫酸(20ml)中，将溶液在90℃搅拌6小时，然后缓慢将混合物倒入冰块中。随后调pH值至中性，抽滤，滤饼真空干燥，得到第二中间体E3为灰白色固体，产率为82％。

(4)合成第四中间体E4

将化合物E3(1mmol),三氯化铁(3mmol)加入50mL 1M的稀盐酸中，90℃反应12小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物pH值调至中性，抽滤，水洗涤，并使用真空干燥箱干燥。用200-300目硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷/甲醇(200：1)洗脱，得到第四中间体为淡黄色固体，产率为18％。

(5)合成大斯托克斯位移近红外发射染料

在二氯甲烷(50mL)中加入化合物E4(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(5mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体E5，产率为26％。

本实施例制得的大斯托克斯位移近红外发射染料的氢谱和碳谱分别如图9和图10所示。

试验例1荧光光谱和紫外吸收光谱

将上述实施例1-5制得的砜基取代的罗丹明衍生物骨架的大斯托克斯位移近红外发射染料试剂分别配制成10mM的DMSO母液，然后分别配为10μM的PBS溶液，扫描紫外吸收值和荧光强度，绘图。

实施例1的染色试剂的紫外吸收光谱和荧光光谱如图11所示，实施例2的染色试剂的紫外吸收光谱和荧光光谱如图12所示，实施例3的染色试剂的紫外吸收光谱和荧光光谱如图13所示，实施例4的染色试剂的紫外吸收光谱和荧光光谱如图14所示，实施例5的染色试剂的紫外吸收光谱和荧光光谱如图15所示。

如图11-15所示，实施例1和2有两个吸收峰。其中一个在λ＝410nm附近，另一个在λ＝510nm附近出现，实施例3和4有两个吸收峰，分别在λ＝425nm，λ＝550nm出现；实施例5也有两个吸收峰，分别在λ＝450nm，λ＝575nm出现。实施例1-5的荧光发射峰分别在λ＝647nm，λ＝653nm，λ＝667nm，λ＝680nm，λ＝698nm处出现。

试验例2荧光量子产率的测定

将实施例1、2、3、4、5制得的染色试剂配为10mM的DMSO母液，然后分别配为10μM的PBS溶液，测定其绝对量子产率，所得数据如下表所示，实施例1-5均具有较为良好的绝对量子产率，体现了较高的应用价值。

上述表格中，Фfl(％)DCM为将PBS替换为DCM后得到的绝对量子产率，Фfl(％)MeOH为将PBS替换为MeOH后得到的绝对量子产率。

试验例3MTS细胞毒性实验

处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔培养板中，每孔接种10000个细胞，用含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的(青霉素-链霉素，1000KU/L)的DMEM(H)培养基在37℃，5％CO

试验例4溶酶体共定位实验

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于玻底共聚焦培养皿中，每皿接种1000个细胞，用含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的(青霉素-链霉素，1000KU/L)的DMEM(H)培养基在37℃，5％CO

试验例5光稳定性实验

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于玻底共聚焦培养皿中，每皿接种1000个细胞，用含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的(青霉素-链霉素，1000KU/L)的DMEM(H)培养基在37℃，5％CO

由图18可知，在循环扫描90次之后，实施例3、5表现出较好的抗光漂白特性，荧光信号基本没有丢失。

综上所述，本发明以砜基取代的罗丹明骨架作为染料基础，通过合理的芳香胺或烷基胺的调控设计，得到了基于不同发射波长的砜基取代的罗丹明骨架的大斯托克斯位移近红外发射染料，该类试剂具有近红外发射的特性，具有背景荧光低，成像信噪比高的表现。本发明的制备方法收率高、反应条件温和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、化合物稳定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。