一种靶向SETDB1-TTD的小分子抑制剂及其制药用途

技术领域

本发明属于化学制药领域，具体涉及一种靶向SETDB1-TTD的小分子抑制剂及其制药用途。

背景技术

SETDB1是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，基因长度为50kbp，定位于人1q21染色体上，其主要功能是调节细胞相关增殖基因的活性。SETDB1的碳端由SET,pre-SET和post-SET区域组成，参与组蛋白甲基化；其中，SET区域具有催化活性。SETDB1的SET结构域分裂是插入了340多个氨基酸造成的。像这种SET结构域被分裂的情况只存在于SETDB1中。SETDB1的氮端包括MBD和Tudor结构域，这是SETDB1与其他的组蛋白甲基转移酶不同之处。有研究表明MBD结构域参与DNA的沉默，Tudor结构域与染色体修饰酶相关，同时也负责识别组蛋白甲基化的赖氨酸或精氨酸，并且参与RNA转录。SETDB1的Tudor结构域是由串联的三个Tudor组成，故又称SETDB1-TTD。

国内外大量研究已证实SETDB1在肝细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞中高表达，因此，SETDB1作为抗肿瘤药物靶点具有广阔的研究价值。

研究发现，SETDB1和组蛋白甲基化、抑制转录以及基因沉默相关。SETDB1主要参与组蛋白H3K9的甲基化，过量的H3K9三甲基化产物促进肿瘤抑制因子沉默，从而导致癌症的发生。SETDB1介导的组蛋白甲基化在维持DNA结构、控制基因表达中发挥重要作用。组蛋白N端的修饰影响染色体折叠，从而控制基因表达。SETDB1特异识别组蛋白H3K9，在PKMT中，能特异识别H3K9的分别为SUV39H1、SUV39H2、G9a、GLP、以及SETDB1。其中，SUV39H1、SUV39H2在异染色体区域发挥功能。而SETDB1等在常染色体区与H3K9作用。H3K9三甲基化与基因表达相关，单甲基化和双甲基化和基因激活有关。SETDB1是唯一一个可以催化常染色体H3K9三甲基化的组蛋白赖氨酸甲基转移酶。此外，SETDB1可识别H3K9和H3K14双修饰的组蛋白。Renata Z.Jurkowska通过结构生物学的手段，研究了SETDB1发挥这种功能的机制，发现Tudor结构域和K9、K14修饰的组蛋白结合。

目前，特异性的SETDB1小分子抑制剂目前还未报道。这是因为SETDB1的SET结构域是分裂的，且目前尚无晶体结构报道，所以开发特异性的SETDB1小分子抑制剂困难较大。因此开发靶向SETDB1其他结构域的抑制剂，比如SETDB1-TTD结构域的抑制剂，对开发治疗与SETDB1表达异常相关疾病的药物具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向SETDB1-TTD的小分子抑制剂及其制药用途。

本发明提供了一种式I所示化合物、或其药学上可接受的盐：

R

进一步地，所述R

进一步地，所述化合物为以下化合物之一：

本发明还提供了式II所示化合物、或其药学上可接受的盐在制备SETDB1抑制剂中的用途：

n为0～5的整数；

R

R

进一步地，所述SETDB1抑制剂为SETDB1-TTD抑制剂。

本发明还提供了式II所示化合物、或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗与SETDB1表达异常相关疾病的药物中的用途。

进一步地，所述与SETDB1表达异常相关疾病为肝细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、恶性间皮瘤、亨廷顿病、自闭症或艾滋病。

进一步地，所述化合物的结构如式III所示：

R

R

进一步地，所述化合物的结构如式IV所示：

R

或，所述化合物的结构如式I所示：

R

进一步地，所述化合物为以下化合物之一：

上述化合物中的“R”表示化合物中手性碳原子的构型。

SETDB的Tudor结构域是由串联的三个Tudor组成，故又称SETDB1-TTD。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀C

“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于其它环状基团(包括饱和和不饱和环)，但不能含有杂原子如氮，氧，或硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。芳基可以是取代的或未取代的。

“杂芳基”指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂原子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。

“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

“盐”是将化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和/或碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

本发明中所述药学上可接受的盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

目前还没见对SETDB1-TTD结构域具有高活性高选择性的小分子抑制剂报道，本发明首次研究出了能够靶向SETDB1-TTD的小分子抑制剂。

实验结果表明，本发明提供的化合物对SETDB1-TTD结构域具有良好的亲和活性，能够竞争性的靶向抑制SETDB1-TTD结构域对底物蛋白的识别，有效抑制SETDB1-TTD结构域在细胞内与组蛋白的结合。

本领域技术人员公知的，SETDB1-TTD抑制剂能够用于治疗与SETDB1表达异常相关的疾病，例如肝细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、恶性间皮瘤、亨廷顿病、自闭症、艾滋病等。因此，本发明提供的化合物可以制备SETDB1-TTD抑制剂，可以制备预防和治疗与SETDB1表达异常相关疾病(例如肝细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、恶性间皮瘤、亨廷顿病、自闭症、艾滋病等)的药物，应用前景广阔。

本发明提供的化合物制备方法简单，条件温和，成本低廉，适合工业化生产。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：化合物13、(S,S)-13的HTRF实验测试结果。

图2：化合物13、(S,S)-13的CETSA实验测试结果。

图3：化合物13、(S,S)-13的FRAP实验测试结果。

图4：化合物13的NanoBRET实验测试结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1：化合物1的制备

1、合成中间体5

按照以下路线，合成中间体5：

步骤i：合成中间体1

往吡啶-2-甲酸(4.45g，36.1mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入HATU(16.5g，43.3mmol)冰浴下搅拌30min后，加入(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶(7.22g，36.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.5g，73mmol)。将混合物在室下搅拌过夜，并在减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯(200mL)中并用饱和氯化铵溶液(3×100mL)和饱和NaHCO3水溶液洗涤(3×100mL)。合并有机层后，减压除去溶剂，并通过柱色谱纯化，得到中间体1：(3R)-3-(吡啶-2-酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(9.35g，30.5mmol，85％)，为白色固体。

步骤ii：合成中间体2

往250mL的耐压瓶中加入中间体1(3.6g，11.8mmol)，碘苯(12g，58.9mmol)，碳酸银(3.25g，11.8mmol)，醋酸钯(529mg，2.36mmol)，2,6-二甲基苯甲酸(885mg，5.9mmol)和60mL叔丁醇。氩气置换容器中的空气后用卷边盖密封。110℃下反应36小时，冷却至室温，并加入60mL二氯甲烷充分搅拌10分钟，过滤除去固体后减压浓缩滤液，通过柱色谱纯化，得到中间体2：(3R,5R)-3-苯基-5-(吡啶-2-酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.41g，9mmol，76.2％)，为白色固体。

步骤iii：合成中间体3

将中间体2(3.41g,9mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，常温搅拌4小时后，点板检测反应，反应完成后，旋干溶剂，将残余物溶解于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶萃取洗涤(2×100mL)，合并有机层，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂后即可得中间体3(2.41g，8.55mmol，95％)。

步骤iv：合成中间体4

向搅拌的中间体3(2.41g，8.55mmol)的甲醇(60mL)溶液中加入冰醋酸(0.1mL)，37％w/v甲醛溶液(1.1mL)，然后分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(3.98g，18.81mmol)(每20分钟加入780mg)。最后一次加入2小时后，真空除去溶剂，残余物用EtOAc萃取两次，将合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤，经无水Na

步骤v：合成中间体5

向N-[(3R,5R)-1-甲基-5-苯基哌啶-3-基]吡啶-2-甲酰胺(2.16g，7.35mmol)的i-PrOH(80mL)悬浮液中加入NaOH(2.96g，74mmol)。将混合物在85℃下搅拌18小时。然后减压除去溶剂，加入水(50mL)。将溶液用EtOAc(50mL×2)萃取，将合并的有机层用无水Na

2、合成中间体8

按照以下路线，合成中间体8：

步骤i：合成中间体6

将2,4-二氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶(12.1g，65mmol)加入到100mL1M NaOH溶液中并在100℃下搅拌16小时。冷却至室温后，用3N HCl将所得深棕色溶液酸化至pH5。通过过滤收集沉淀物，用水(2×50mL)洗涤，真空干燥，得到2-氯-3H，4H，5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(中间体6，9.88g，58.5mmol，90％)，为黄褐色固体。

步骤ii：合成中间体7

往250mL的圆底烧瓶中加入中间体6(9g，53.2mmol)，Boc酸酐(13g，60mmol)和DMAP(500mg，2.25mmol)，然后加入80mL的DMF，接着加入三乙胺(6g，60mmol)。反应在室温下搅拌过夜。反映完成后加入450mL水，用柠檬酸将所得溶液酸化至pH＝6。过滤收集沉淀，用水(2×50mL)洗涤，真空干燥，得到2-氯-4-氧代-3H，4H，5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-羧酸酯(中间体7，11.8g，,44.2mmol，83％)，为棕色固体。

步骤iii：合成中间体8

将中间体7(8.7g，32.3mmol)溶解于100mL的无水DMF中，0℃下，将NaH(60％，1.9g，47.5mmol)分批加入到搅拌的反应液中。0℃下反应30分钟后，加入碘甲烷(6.67g，47mmol)。升温至在40℃，搅拌过夜。反应完成后，将反应液冷却至室温。用水小心淬灭反应液，并用乙酸乙酯萃取。向合并的有机相中加入三氟乙酸并再搅拌5小时，然后减压除去溶剂。通过柱色谱纯化残余物，得到2-氯-3-甲基-3H，4H，5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(中间体8，2.7g，14.7mmol)，为白色固体。

3、合成终产物：化合物1

按照以下路线，合成化合物1：

将中间体5(344mg，1.31mmol)、中间体8(200mg，1.09mmol)和N,N-二异丙基乙胺(183mg，1.42mmol)溶于5mL NMP。升温至150℃并在该温度下搅拌2小时。冷却至室温后，加入15倍的水稀释反应后，用乙酸乙酯萃取混合液(3×40mL)。将双相溶液用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机物用水洗涤，用无水MgSO

化合物1：

实施例2：化合物2-8的制备

按照实施例1合成中间体5的方法，将步骤ii中的原料碘苯替换为对应的碘苯取代物，合成对应的中间体5-a；

按照实施例1合成终产物化合物1的方法，将中间体5替换为对应的中间体5-a，制得化合物2-8。

化合物2：

化合物3：

化合物4：

化合物5：

化合物6：

化合物7：

化合物8：

实施例3：化合物9的制备

以化合物6作为原料，采用钯碳氢气脱苄基即可制得化合物9。具体操作如下：将化合物6(660mg，1.49mmol)和10％Pd/C加入到MeOH中，容器抽真空并用H

化合物9：

实施例4：化合物10-14的制备

1、合成中间体11

按照以下路线，合成中间体11：

步骤i:合成中间体9

将原料4(3.08g,20mmol)和原料5(2.55g,30mmol)溶解于100mL的甲苯中，接着加入三乙胺(5.55ml,40mmol)，反应液室温反应16小时。反应完成后，有大量固体析出，过滤，滤饼用乙醇洗涤后干燥即得目标产物中间体9(4.27g,95％)。

步骤ii:合成中间体10

将中间体9(4g,17.8mmol)悬浮于50mL 1N的KOH甲醇溶液中,加热回流反应2小时后，冷却至20℃，并用醋酸调节pH值至pH＝4，再用饱和NaHCO

步骤iii:合成中间体11

将中间体10悬浮于25mL的POCl3中，升温至100℃，并维持在100℃反应24小时。反应完成后，减压除去多余的POCl3。用冰水小心淬灭剩余的残渣，并在冰浴下用饱和NaHCO

2、合成中间体12-15

按照以下路线，合成中间体12-15：

按照合成中间体8的方法，使用不同的卤代烷与中间体7进行亲核取代，即分别得到中间体12-15。

3、终产物10-14的合成

按照实施例1合成中间体5的方法，将步骤ii中的原料碘苯替换为1-苄氧基-4-碘苯，即制得中间体16；

按照实施例1合成终产物化合物1时相同的方法，将中间体5替换中间体16，将中间体8替换为对应的中间体11-15，经过亲和取代反应，分别制得化合物10-14。

化合物10：

化合物11：

化合物12：

化合物13：

化合物14：

实施例5：化合物(S,S)-13的制备

按照实施例5合成中间体16的方法，将初始原料(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶替换为(S)-1-Boc-3-氨基哌啶，制得中间体17；

按照实施例5合成化合物13的方法，将中间体17与中间体14经过亲和取代反应，即制得化合物(S,S)-13。化合物(S,S)-13为化合物13的对映异构体。

化合物(S,S)-13：

以下通过实验例证明本发明制备的化合物的有益效果

实验例1：本发明化合物对SETDB1-TTD结构域的亲和活性

(1)试验方法

使用差示扫描荧光法(DSF)和等温滴定量热法(ITC)评估本发明制备的化合物对SETDB1-TTD结构域的亲和活性。

差示扫描荧光实验：使用Bio-Rad CFX96RT-PCR仪进行热位移ΔTm的测定。配置样品时，每孔加入9.8μL的SETDB1-TTD蛋白与SYPRO Orange的混合液，再加入0.2μL的化合物溶液。最终测试体系为20mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl的缓冲体系。SETDB1-TTD域蛋白的终浓度为10μM，待测试化合物终浓度为100μM，样品池的溶液总体积为10μL体积。测试时首先将样品在25℃下平衡3分钟；然后以1℃/min的速度从25℃加热至95℃。

等温滴定量热实验：使用MicroCal ITC200微量热仪(Malvern Instruments)进亲和力KD值的测定。所有测试均在25℃下，使用20mM HEPES(pH 7.5)、200mM NaCl、0.4％DMSO的缓冲液体系。在实验之前，将化合物直接在相同批次的缓冲液中稀释。每次实验都是反向滴定实验(注射器中吸入SETDB1-TTD蛋白和样品池中注入小分子)。初始滴定0.2μL蛋白，然后每隔2分钟滴定2μL蛋白，连续19滴。实验数据采用ΔG＝ΔH-TΔS＝-RTlnKA计算热力学参数分析，其中KD＝1/KA。ΔG，ΔH和ΔS分别是自由能，焓和熵的变化。在数据分析中使用的是独立单点结合模型。

(2)试验结果

本发明化合物对SETDB1-TTD结构域的亲和活性测试结果如表1所示：

表1本发明化合物对SETDB1-TTD结构域的亲和活性测试结果

表1中，NA:无活性；NB:不结合。

实验结果显示：在DSF和ITC测试中，本发明的化合物1～13都是对SETDB1-TTD结构域具有亲和活性的化合物，其中化合物13显示了最高的亲和力，K

实验例2：本发明化合物对SETDB1-TTD结构域的抑制活性表征

(1)试验方法

选择上述实验例1中亲和活性较好的化合物13，进一步进行均相时间分辨荧光(HTRF)生物化学活性测试。以化合物(S,S)-13为对照。

实验使用Cisbio Mab Anti GST-Eucryptate(61GSTKLA)试剂盒，GST-SETDB1-TTD蛋白，生物素化的多肽(Bio-KQTARK(me2/me3)STGGK(ac)APRKQ)，进行HTRF测定。将1.25μLGST-SETDB1-TTD蛋白(终浓度100nM)，1.25μL待测试化合物，2,5μL生物素化的多肽(终浓度500nM)，5μLSA-XL665(终浓度6.6nM)和5μL GST Ab-Eu3+(终浓度133nM)加入384孔板(Cisbio 6008280)，然后将384孔板密封并在室温下孵育1小时。使用CLARIOstarmicroplate reader仪器记录读数，其中荧光测量波长为620和665nm，根据拟合的曲线计算半数抑制浓度(IC

(2)实验结果

实验结果显示(图1)：化合物13竞争H3K9me2/K14ac的IC

实验例3：本发明化合物在细胞上对SETDB1-TTD结构域抑制活性的评价

(1)试验方法

分别使用细胞热转移实验(CETSA)、荧光漂白恢复实验(FRAP)以及NanoBRET实验评估化合物13对SETDB1-TTD结构域的活性。

细胞内热转移实验(CETSA)：采用转染了pLVX-mCherry-N1-SETDB1-TTD的HEK293T细胞株。将不同浓度的待测化合物或DMSO加入到细胞株中，孵育6小时后收集细胞，使用PBS平衡生理盐水清洗(PBS的用量为2×106cells/mL)，并使其重悬于包含1％蛋白酶抑制剂Cocktail的PBS中。随后，将细胞均分到不同的试管，在50℃孵育3分钟后，降至20℃孵育3分钟。细胞在液氮中经过三次冻融循环裂解。在每个冻融循环后，对裂解液进行短暂的涡旋，以确保均质化。处理后的样品在4℃，13000rpm条件下，离心30分钟，去除不溶性蛋白，可溶性部分进行SDS-PAGE和western blotting实验分析。以化合物(S,S)-13为对照。

荧光漂白恢复实验(FRAP)：将EGFP标记的野生型SETDB1-TTD和SETDB1-TTD-Y268a突变质粒转染到HEK293T细胞中，并将细胞接种于35mm玻璃底细胞培养皿中(biosharp,BS-20-GJM)(细胞接种量为6×104cells/mL)。在37℃，5％CO

NanoBRET实验：将HEK293T细胞(4×10

(2)试验结果

CETSA实验结果显示(图2)，化合物13可以进入细胞中并在50℃时剂量依赖性地稳定SETDB1-TTD，(S,S)-13没有这种稳定SETDB1-TTD的效果。FRAP实验结果显示(图3)，化合物13可以明显缩短荧光恢复时间，而(S,S)-13与DMSO组均没有这种效果，Y268A突变可以使SETDB1-TTD结构域丧失识别H3K9me3/K14ac的能力，其荧光恢复时间与化合物13处理组恢复时间相当，说明化合物13在细胞内作用于SETDB1-TTD结构域。NanoBRET实验结果显示(图4)，化合物13能够在细胞内在抑制SETDB1-TTD蛋白与组蛋白H3.3的结合，其IC

综上，本发明提供了一种靶向SETDB1-TTD的小分子抑制剂及其制药用途。实验结果表明，本发明提供的化合物对SETDB1-TTD结构域具有良好的亲和活性，能够竞争性的靶向抑制SETDB1-TTD结构域对底物蛋白的识别，有效抑制SETDB1-TTD结构域在细胞内与组蛋白的结合。本发明提供的化合物可以制备SETDB1-TTD抑制剂，可以制备预防和治疗与SETDB1表达异常相关疾病(例如肝细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤等)的药物，应用前景广阔。