Erinacine A在制备治疗NAFLD的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及Erinacine A在制备治疗NAFLD的产品中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指肝脏中的脂类过度沉积而引起的一类代谢综合征。

NAFLD与肥胖、高血脂、2型糖尿病、心脏病等糖脂代谢异常疾病，而且NAFLD甚至可以发展成为肝癌。但是，尚无针对NAFLD的专门临床药物。因此，开发NAFLD的防治制剂、药物具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中尚无针对NAFLD的专门临床药物的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

Erinacine A或以Erinacine A为主体的衍生物在制备治疗NAFLD的产品中的应用。

优选的，包含Erinacine A或以Erinacine A为主体的衍生物。

优选的，所述产品包括注射剂、输液剂。

一种Erinacine A减少高脂引发的肝脂沉积的验证方法，包含以下步骤：

S1：构建NAFLD的细胞模型及小鼠模型；

S2：使用ELISA检测小鼠肝组织中的脂含量；

S3：油红染色检测肝中的脂滴积累。

优选的，所述S2中，包含以下步骤：称量小鼠肝脏样品，使用生理盐水或者乙醇匀浆。取100 μL至微量培养板中，使用TG检测试剂盒检测甘油三酯（TG）含量。

综上所述，Erinacine A可以显著地减少HFD小鼠肝脏的脂沉积和葡萄糖耐受、胰岛素抵抗，从而治疗NAFLD。因此，Erinacine A有望开发成为治疗NAFLD的生物医药制剂。

附图说明

图1为本发明Erinacine A抑制肝细胞株中的脂滴沉积验证实验的示图，

图中，（A，C）脂肪酸（FA）孵育鼠源肝细胞株AML12或HepG2为12小时，接着以Erinacine A处理该细胞12小时；然后ELISA检测AML12或HepG2中的TG含量。FA，脂肪酸；BSA，牛血清白蛋白，是FA的对照；Erinacine A，猴头菌二萜；Placebo，是Erinacine A的对照组。（B，D）油红染色检测AML12和HepG2中的脂滴积累。&p< 0.05与BSA+Placebo比，#p<0.05与FA+Placebo比；

图2为本发明Erinacine A抑制HFD小鼠肝脏中的脂沉积验证实验的示图，

图中，8周龄的C57 BL/6小鼠，先以ND、HFD饲喂小鼠10周，再Erinacine A灌胃给药5周。（A）ELISA检测小鼠肝脏的TG、含量；（B）油红染色检测小鼠肝脏中的脂滴沉积。&p<0.05与ND+Placebo比，#p< 0.05与HFD+Placebo。ND，Normal diet；HFD，High fat diet；Placebo为阴性对照（生理盐水）；

图3 Erinacine A缓解HFD小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗验证实验的示图，

图中，8周龄的C57 BL/6小鼠，先以ND、HFD饲喂小鼠10周，再Erinacine A灌胃给药5周。（A，B）血糖仪检测Erinacine A对HFD小鼠葡糖糖耐受的影响。&p< 0.05与ND+Placebo比，#p< 0.05与HFD+Placebo。ND，Normal diet；HFD，High fat diet；Placebo为阴性对照（生理盐水）。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

Erinacine A及含有该结构式为主体的衍生物在制备治疗NAFLD的产品中的应用。

本申请还提供了一种治疗NAFLD的产品，其包含Erinacine A及以Erinacine A为主体的衍生物。所述产品包括注射剂、输液剂或其他药物制剂。

以下为本申请的验证过程：

实施方案1：Erinacine A减少高脂（HFD）引起的肝脂增加。

1.1 实验方法

实施方案1：Erinacine A抑制高脂饮食诱发的肝脂沉积

1.1 实验方法：

1.1.1 NAFLD的细胞模型

为了研究Erinacine A在NAFLD治疗中的作用，我们先使用肝细胞进行验证。首先，AML12和HepG2细胞种于六孔板；第二天，使用FA孵育肝细胞12小时；接着，使用Erinacine A处理该肝细胞12小时。最后，ELISA检测该细胞中的TG含量变化情况，并油红染色检测该肝细胞中的脂滴积累。

1.1.2 NAFLD小鼠模型的建立

从常州卡文斯实验动物有限公司购买8周龄的C57 BL/6小鼠，以ND（普通饮食）和HFD（高脂饮食）饲养小鼠10周，其中HFD饲养小鼠则可形成脂肪肝，此时灌胃给药ErinacineA并持续饲养小鼠5周。之后，检测此小鼠的各项指标（肝脂含量、GTT、ITT）。

1.1.3 ELISA检测小鼠肝组织中的脂含量

先称量少许小鼠肝脏样品，再生理盐水或者乙醇匀浆。取100 μL至微量培养板中，使用TG检测试剂盒检测甘油三酯（TG）含量。该ELISA酶试剂盒购自中国上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.4 油红染色检测肝中的脂滴积累

油红染色（Oil Red O）的过程是，将冰冻切片室温PBS冲洗3遍；0.17%油红染色液滴加于肝组织切片，并室温孵育10min。吸去油红染色液，以60%异丙醇冲洗3遍并蒸馏水轻洗3次，再明胶固定该染色切片。在显微镜下观察并拍照。

1.2 实验结果：

1）本专利的研究结果指出，FA可以促进肝细胞株中的脂类沉积，Erinacine A孵育则能减少FA诱导的脂沉积；HFD饮食显著地增加小鼠肝中的脂含量（TG），而灌胃给药Erinacine A则显著减少HFD小鼠肝中的脂含量（图1和图2）。

2）油红染色得出，Erinacine A可以显著抑制肝细胞中的脂滴沉积，而灌胃给药Erinacine A则显著减少HFD小鼠肝脏中的脂沉积（图1B和图1D，图2A-B）。

实施方案2：Erinacine A可以降低HFD小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗

2.1 实验方法：

2.1.1 血糖仪检测小鼠的葡萄糖耐受（GTT）

根据1.1.2方法建立NAFLD动物模型，灌胃给药Erinacine A并HFD饲喂5w。之后，对小鼠禁食16 h。然后，腹腔注射葡萄糖溶液（2 g/kg体重），在0、15、30、60和120 min，血糖仪对尾部取血测定血糖浓度。

2.1.2 血糖仪检测小鼠的胰岛素抵抗（ITT）

根据1.1.2方法建立NAFLD动物模型，灌胃给药Erinacine A并HFD饲喂5w。之后，对小鼠禁食16 h。然后，腹腔注射胰岛素溶液（0.75 U/kg体重），在0、15、30、60和120 min，血糖仪对尾部取血而测定血糖浓度。

2.2 实验结果：

在小鼠体内的实验表明，Erinacine A可显著地缓解HFD小鼠的葡萄糖耐受（图3A），并且Erinacine A可以显著地抑制HFD小鼠的胰岛素抵抗（图3B）。

综上所述，Erinacine A可以显著地减少HFD小鼠肝脏的脂沉积和葡萄糖耐受、胰岛素抵抗，从而治疗NAFLD。因此，Erinacine A有望开发成为治疗NAFLD的生物医药制剂。

本发明专利通过细胞和动物实验表明，Erinacine A显著抑制了肝脏中的脂类沉积，从而用于治疗NAFLD。我们发现，Erinacine A可以显著地减少鼠源肝细胞AML12和人源肝细胞HepG2中的脂类沉积；更有意义的是，Erinacine A显著抑制了HFD小鼠肝脏中的脂滴积累，缓解该HFD小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗。因为NAFLD已经成为关乎人类健康的重要问题，与肥胖、肝纤维化、肝癌、糖尿病等密切相关，NAFLD也是困扰老年人肝脏健康的重要病原，所以，将猴头菇中的天然化合物Erinacine A用于治疗NAFLD具有较好的前景。

以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围。