特征在于促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EPHA2)的过表达的疾病的治疗

技术领域

本发明涉及对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，以及用于预防或治疗疾病、障碍或病症的用途，该疾病、障碍或病症的特征在于在患病组织例如肿瘤组织中促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)的过表达。

背景技术

环肽能够以高亲和力和靶标特异性结合蛋白质靶标，因此是用于开发治疗剂的有吸引力的分子类别。事实上，已经在临床上成功地使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂药物环孢菌素或抗癌药物奥曲肽(Driggers等人(2008),Nat Rev Drug Discov7(7),608-24)。良好的结合性质由肽与靶标之间形成的相对较大的相互作用表面以及环状结构的降低的构象柔性产生。通常，大环化合物与数百平方埃的表面结合，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(

由于它们的环状构型，大环肽的柔性不如线性肽，导致与靶标结合时的熵损失更小并导致更高的结合亲和力。降低的柔性还导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比增加了结合特异性。这种作用已通过基质金属蛋白酶8(MMP-8)的强效选择性抑制剂得到例证，当它的环打开时，它相对于其他MMP失去了它的选择性(Cherney等人(1998),J Med Chem41(11),1749-51)。通过大环化实现的有利的结合性质在具有多于一个肽环的多环肽中甚至更显著，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中。

不同的研究团队此前已经将具有半胱氨酸残基的多肽连接到合成的分子结构(Kemp和McNamara(1985),J.Org.Chem；Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。Meloen及其同事使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速定量地环化到合成支架上，用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。用于产生候选药物化合物的方法，其中所述化合物通过将含有半胱氨酸的多肽连接到分子支架例如TATA(1,1',1″-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮，Heinis等人Angew Chem,Int Ed.2014；53:1602-1606)而产生。

已经开发了基于噬菌体展示的组合方法来生成大型双环肽库并将其筛选到目标靶标(Heinis等人(2009),Nat Chem Biol 5(7),502-7和WO 2009/098450)。简言之，将含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸的两个区域(Cys-(Xaa)

发明内容

如本文所述，本发明人已经发现，患病组织中的EphA2水平指示患者对用对EphA2特异性的双环毒素缀合物治疗的反应性。EphA2在许多难以治疗的肿瘤诸如NSCLC、TNBC、胰腺癌(pancreatic cancer)、卵巢癌、胃癌/上消化道癌和尿道上皮癌中过表达。EphA2在正常成人组织中以相对较低的水平表达。EphA2已被某些其他药物靶向，其由于不可接受的毒性而在临床上失败。

在一个方面，本发明提供了一种鉴定或选择患病组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括测量患者的患病组织中的EphA2水平，以及选择患病组织中EphA2水平升高的患者。

在另一个方面，本文提供了一种治疗患病组织中EphA2水平升高(例如，如使用本文所述的方法所确定的)的患者的疾病的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗患者的疾病的方法，所述方法包括选择患病组织中EphA2水平升高的患者，例如，使用如本文所述的方法，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，疾病是癌症，例如，如本文所述的癌症。在一些实施方案中，患病组织是肿瘤组织。在一些实施方案中，对EphA2特异性的双环毒素缀合物选自如本文所述的那些。

具体实施方式

1.本发明的某些实施方案的一般描述：

已经通过IHC染色测定法测量了肿瘤组织中的EphA2水平。已经发现，肿瘤细胞膜上和肿瘤细胞细胞质中的EphA2水平指示肿瘤对用对EphA2特异性的双环毒素缀合物治疗的反应性。不希望受任何特定理论或机制的束缚，本发明人已经发现在患病组织中EphA2水平升高的肿瘤更可能受益于用对EphA2特异性的双环毒素缀合物的治疗。还发现在肿瘤细胞膜上EphA2水平升高的肿瘤更可能受益于用BT5528的治疗。

因此，在一个方面，本发明提供了一种鉴定或选择患病组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括测量患者的患病组织中的EphA2水平，以及选择患病组织中EphA2水平升高的患者。

在另一个方面，本文提供了一种治疗患病组织中EphA2水平升高(例如，如使用本文所述的方法所确定的)的患者的疾病的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗患者的疾病的方法，所述方法包括选择患病组织中EphA2水平升高的患者，例如，使用如本文所述的方法，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

2.化合物和定义：

如本文所用，术语“对EphA2特异性的双环毒素缀合物”是指与EphA2特异性结合的双环毒素缀合物。此前已经在例如US2019/0184025、WO 2019/122861和WO 2019/122863中描述了多种对EphA2特异性的双环毒素缀合物，它们各自的内容以引用方式全文并入本文。

如本文所用，术语“BT5528”是具有如下所示结构的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐，其中分子支架是1,1',1″-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)，并且肽配体包含以下氨基酸序列：

(β-Ala)-Sar

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合接触人和低等动物的组织使用而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐，该文献以引用方式并入本文。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸或有机酸或通过使用本领域中使用的其他方法形成的氨基基团的盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，所述本领域中使用的其他方法诸如离子交换。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。

衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N

本发明的盐可以由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法诸如在Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑),Camille G.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,Hardcover,388页,2002年8月中描述的方法合成。通常，这样的盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。

除非另有说明，否则本文描述的结构还意在包括该结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构和几何(或构象))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型、Z和E双键异构体以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何(或构象)混合物均在本发明的范围内。除非另有说明，否则本发明的化合物的所有互变异构形式均在本发明的范围内。此外，除非另有说明，本文描述的结构还意在包括不同之处仅在于存在一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，具有包括用氘或氚置换氢或用富含

如本文所用，术语“约”或“大约”具有在给定值或范围的20％内的含义。在一些实施方案中，术语“约”是指在给定值的20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内。

3.本发明的示例性实施方案的描述

在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定或选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括测量患者的肿瘤组织中的EphA2水平，以及选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者。在一些实施方案中，该方法还包括向肿瘤组织中EphA2水平升高的患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，患者是患有胰腺癌的患者。在一些实施方案中，患者是患有胃癌(stomach cancer)的患者。在一些实施方案中，患者是患有膀胱癌的患者。在一些实施方案中，患者是患有头颈癌的患者。在一些实施方案中，患者是患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。在一些实施方案中，患者是患有三阴性乳腺癌(TNBC)的患者。在一些实施方案中，患者是患有卵巢癌的患者。

在一些实施方案中，肿瘤组织是胰腺肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织是胃肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织是膀胱肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织是头颈肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织是非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织是三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织是卵巢肿瘤组织。

如本文所用，术语“EphA2水平升高”是指肿瘤组织中一定百分比的细胞具有可检测量的EphA2，例如，在肿瘤细胞膜上或在肿瘤细胞细胞质中或两者。在一些实施方案中，EphA2阳性是指肿瘤组织中约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的细胞具有可检测量的EphA2，例如，在肿瘤细胞膜上或在肿瘤细胞细胞质中或两者。

有多种方法测量组织中EphA2的量。在一些实施方案中，测量患者肿瘤组织中EphA2水平的方法包括使用EphA2免疫组织化学(IHC)染色测定法。在一些实施方案中，EphA2 IHC染色测定法包括使用人EphA2抗体对肿瘤组织切片进行染色。在一些实施方案中，人EphA2抗体与EphA2的细胞外结构域(ECD)选择性地结合。在一些实施方案中，与EphA2的ECD选择性地结合的人EphA2抗体是人EphA2抗体AF3035。在一些实施方案中，人EphA2抗体与EphA2的细胞质结构域选择性地结合。在一些实施方案中，与EphA2的细胞质结构域选择性地结合的人EphA2抗体是人EphA2抗体CST6997。

在一些实施方案中，人EphA2抗体的浓度高达约50μg/mL。在一些实施方案中，人EphA2抗体的浓度高达约40μg/mL。在一些实施方案中，人EphA2抗体的浓度高达约30μg/mL。在一些实施方案中，人EphA2抗体的浓度高达约20μg/mL。在一些实施方案中，人EphA2抗体的浓度高达约10μg/mL。在一些实施方案中，人EphA2抗体的浓度为约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL或约15μg/mL。在一些实施方案中，与EphA2的ECD选择性地结合的人EphA2抗体诸如AF3035的浓度为约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL或约15μg/mL。在一些实施方案中，与EphA2的ECD选择性地结合的人EphA2抗体诸如AF3035的浓度为约10μg/mL。

在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定或选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，以及选择在EphA2 IHC染色测定法中染色呈阳性的患者。在一些实施方案中，EphA2 IHC染色测定法如本文实施例2中所述。

如本文所用，术语“染色呈阳性的患者”是指在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中具有一定百分比的染色呈阳性的细胞的患者。在一些实施方案中，染色呈阳性的患者在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中具有约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的染色呈阳性的细胞。

在IHC染色测定法中有多种方法测量染色强度。在一些实施方案中，染色强度通过视觉评分，例如通过使用常规光学显微镜的人工评分来测量。在一些实施方案中，染色强度通过计算组织分析(CTA)评分来测量。染色强度水平可以是无染色(0)、弱染色(1+)、中值染色(2+)或强染色(3+)。在一些实施方案中，在肿瘤组织切片的肿瘤细胞膜上测量染色强度。在一些实施方案中，在肿瘤组织切片的肿瘤细胞细胞质中测量染色强度。在一些实施方案中，在肿瘤组织切片的肿瘤细胞膜上和肿瘤细胞细胞质中测量染色强度。

在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约15或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约20或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约30或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约40或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约50或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约75或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约100或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约125或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的H评分为约150或更高。

H评分是细胞百分比×它们的根据如上文所述的0-3的等级(无染色(0)、弱染色(1+)、中值染色(2+)或强染色(3+))的染色强度的乘积的总和：

[((0×(处于0的细胞％))+((1×(处于1+的细胞％))+((2×(处于2+的细胞％))+((3×(处于3的细胞％))]

可以为肿瘤组织切片中的不同区室(包括例如肿瘤细胞膜和细胞质)生成H评分。在一些实施方案中，H评分是指肿瘤细胞膜的H评分，它是细胞百分比×它们的根据如上文所述的0-3的等级的细胞膜染色强度的乘积的总和。在一些实施方案中，H评分是指肿瘤细胞细胞质的H评分，它是细胞百分比×它们的根据如上文所述的0-3的等级的细胞质染色强度的乘积的总和。

在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约20或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约30或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约40或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约50或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约75或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约100或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约125或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞膜的H评分为约150或更高。

在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约15或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约20或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约30或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约40或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约50或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约75或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约100或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约125或更高。在一些实施方案中，染色阳性是指在IHC染色测定法中肿瘤组织切片中的肿瘤细胞细胞质的H评分为约150或更高。

在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定或选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，以及选择H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者。

在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定或选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，以及选择肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者。

在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定或选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的方法，其包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，以及选择肿瘤细胞细胞质的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，EphA2水平升高如本文所述。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，EphA2水平升高如本文所述。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括测量患者的肿瘤组织切片中的EphA2水平，选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，EphA2水平升高如本文所述。

在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是胃癌。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，EphA2 IHC染色测定法如本文中所述。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中肿瘤细胞细胞质的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中肿瘤细胞细胞质的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，选择H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，选择肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，选择肿瘤细胞细胞质的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，对EphA2特异性的双环毒素缀合物选自如US 2019/0184025、WO 2019/122861和WO 2019/122863中所述的化合物，这些文献各自以引用方式全文并入本文。

在一些实施方案中，对EphA2特异性的双环毒素缀合物是如本文所述的BT5528或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用BT5528或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗在EphA2 IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用BT5528或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者，以及向患者施用BT5528或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择在IHC染色测定法中在肿瘤组织切片中肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用BT5528或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括测量患者的肿瘤组织中的EphA2水平，选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者，以及向患者施用BT5528或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括使用EphA2 IHC染色测定法测量患者的肿瘤组织切片中的染色强度，选择肿瘤细胞膜的H评分为约15或更高、约20或更高、约30或更高、约40或更高、约50或更高、约75或更高、约100或更高、约125或更高或约150或更高的患者，以及向患者施用BT5528或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物可以多种剂量范围施用于患者。

在一些实施方案中，本发明的方法包括以约1mg/kg或更小的剂量向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，本发明的方法包括以约0.9mg/kg、约0.8mg/kg、约0.7mg/kg、约0.6mg/kg、约0.5mg/kg、约0.4mg/kg、约0.3mg/kg、约0.2mg/kg或约0.1mg/kg的剂量向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

在一些实施方案中，本发明的方法包括以约100mg/m

对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物可以多种剂量频率施用于患者。在一些实施方案中，本发明的方法包括以每2天一个剂量、每3天一个剂量、每4天一个剂量、每5天一个剂量、每6天一个剂量或每7天一个剂量的剂量频率向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，本发明的方法包括以每周两个剂量、每周一个剂量、每两周一个剂量、每三周一个剂量或每4周一个剂量的剂量频率向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

4.配制和施用

在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用包含如本文所述的对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，将对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐配制用于IV施用于患者。

术语“药学上可接受的载体、佐剂或媒介物”是指不破坏与其一起配制的化合物的药理活性的无毒载体、佐剂或媒介物。可用于本发明组合物的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白诸如人血清白蛋白、缓冲物质诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质诸如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的组合物可以经口、肠胃外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入的储库施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物通过口服、腹膜内或静脉内施用。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性混悬液。这些混悬液可依照本领域中已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂也可为在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作为溶剂或混悬介质。

为达成此目的，任何温和的不挥发性油均可被使用，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物适用于注射剂的制备，如同天然的药学上可接受的油如橄榄油或蓖麻油，尤其是处于其聚氧乙烯化的形式一样。这些油溶液或混悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和混悬液)的类似分散剂。其他通常使用的表面活性剂，如Tween、Span和通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他乳化剂或生物利用度增强剂也可用于达成制剂的目的。

本发明的药学上可接受的组合物可以任何经口可接受的剂型经口施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。在口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂如硬脂酸镁，也通常加入。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当水性混悬液需口服时，将活性成分与乳化剂和助悬剂组合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。

替代性地，本发明的药学上可接受的组合物可以用于直肠施用的栓剂形式施用。这些可通过将药剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的药学上可接受的组合物也可以局部施用，特别是当治疗目标包括易于通过局部施用到达的区域或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道的疾病。对于这些区域或器官的每一者而言，容易制备合适的局部制剂。

下肠道的局部施用可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠制剂实现。也可以使用局部透皮贴剂。

对于局部施用，可以将所提供的药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适的软膏。用于本发明化合物的局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。替代性地，可以将所提供的药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适的洗剂或乳膏。合适的载体包括但不限于矿物油、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

对于眼部使用，可以将所提供的药学上可接受的组合物配制成在等渗、pH调节的无菌盐水中的微粉化混悬液，或者优选地，配制成在等渗、pH调节的无菌盐水中的溶液，其具有或不具有防腐剂，诸如苯扎氯铵。替代性地，对于眼部使用，可以将药学上可接受的组合物配制成软膏诸如凡士林。

本发明的药学上可接受的组合物也可以通过鼻气溶胶或吸入施用。这样的组合物根据药物制剂领域公知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂制备为盐水中的溶液。

最优选地，将本发明的药学上可接受的组合物配制成用于口服施用。这样的制剂可以与或不与食物一起施用。在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物在没有食物的情况下施用。在其他实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物与食物一起施用。

可与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的本发明化合物的量将根据所治疗的宿主、特定施用模式而变化。优选地，所提供的组合物应当被配制成使得可以向接受这些组合物的患者施用0.01-1mg/kg体重/天的剂量。

还应当理解，用于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合和主治医生的判断以及所治疗的特定疾病的严重程度。本发明化合物在组合物中的量还将取决于组合物中的具体化合物。

5.用途

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括选择肿瘤组织中EphA2水平升高的患者，例如，使用如本文所述的方法，以及向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗方法还包括例如使用如本文所述的IHC测定法测量患者的肿瘤组织中的EphA2水平。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗肿瘤组织中EphA2水平升高的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用对EphA2特异性的双环毒素缀合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗方法还包括例如使用如本文所述的IHC方法测量患者的肿瘤组织中的EphA2水平。

癌症

使用本文所述的方法和用途治疗的癌症或增殖性病症或肿瘤包括但不限于血液癌症、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、神经癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、头颈癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系统癌、骨癌、肾癌和血管癌。

使用本文所述的方法治疗的癌症可以选自结肠直肠癌，诸如微卫星稳定(MSS)转移性结肠直肠癌，包括晚期或进行性微卫星稳定(MSS)CRC；非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如晚期和/或转移性NSCLC；卵巢癌；乳腺癌，诸如炎性乳腺癌；子宫内膜癌；子宫颈癌；头颈癌；胃癌(gastric cancer)；胃食管结合部癌；以及膀胱癌。在一些实施方案中，癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，结肠直肠癌是转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，结肠直肠癌是微卫星稳定(MSS)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，癌症是晚期或进行性微卫星稳定(MSS)CRC。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，癌症是晚期和/或转移性NSCLC。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是炎性乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是子宫内膜癌。在一些实施方案中，癌症是子宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌。在一些实施方案中，癌症是胃癌。在一些实施方案中，癌症是胃食管结合部癌。在一些实施方案中，癌症是膀胱癌。

在一些实施方案中，癌症包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病或非霍奇金病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、重链病和实体瘤诸如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM，也称为成胶质细胞瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。

在一些实施方案中，癌症是神经胶质瘤、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM，也称为成胶质细胞瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是听神经瘤、星形细胞瘤(例如I级-毛细胞性星形细胞瘤、II级-低级星形细胞瘤、III级-间变性星形细胞瘤或IV级-成胶质细胞瘤(GBM))、脊索瘤、CNS淋巴瘤、颅咽管瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、混合性神经胶质瘤、视神经胶质瘤、室管膜下瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、转移性脑肿瘤、少突神经胶质瘤、垂体肿瘤、原始神经外胚层(PNET)肿瘤或神经鞘瘤。在一些实施方案中，癌症是在儿童中比在成人中更常见的类型，诸如脑干神经胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、青少年毛细胞性星形细胞瘤(JPA)、成神经管细胞瘤、视神经神经胶质瘤、松果体肿瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)或横纹肌样瘤。在一些实施方案中，患者是成人。在一些实施方案中，患者是儿童或儿科患者。

在另一个实施方案中，癌症包括但不限于间皮瘤、肝胆管(肝和胆管)癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃肠癌(胃癌、结肠直肠癌和十二指肠癌)、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、非霍奇金淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤或一种或多种前述癌症的组合。

在一些实施方案中，癌症选自肝细胞癌、卵巢癌、卵巢上皮癌或输卵管癌；乳头状浆液性囊腺癌或子宫乳头状浆液性癌(UPSC)；前列腺癌；睾丸癌；胆囊癌；肝胆管癌；软组织和骨滑膜肉瘤；横纹肌肉瘤；骨肉瘤；软骨肉瘤；尤文肉瘤；甲状腺未分化癌；肾上腺皮质腺瘤；胰腺癌；胰腺导管癌或胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma)；胃肠/胃(GIST)癌；淋巴瘤；头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)；唾液腺癌；神经胶质瘤或脑癌；神经纤维瘤病-1相关的恶性外周神经鞘瘤(MPNST)；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症选自肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、输卵管癌、乳头状浆液性囊腺癌、子宫乳头状浆液性癌(UPSC)、肝胆管癌、软组织和骨滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、甲状腺未分化癌、肾上腺皮质腺瘤、胰腺癌、胰腺导管癌、胰腺腺癌、神经胶质瘤、神经纤维瘤病-1相关的恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是实体瘤，诸如肉瘤、癌或淋巴瘤。实体瘤通常包括通常不包括囊肿或液体区域的异常组织块。在一些实施方案中，癌症选自肾细胞癌或肾癌；肝细胞癌(HCC)或肝母细胞瘤，或肝癌；黑素瘤；乳腺癌；结直肠癌或结肠直肠癌；结肠癌；直肠癌；肛门癌；肺癌，诸如非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)；卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢肿瘤或输卵管癌；乳头状浆液性囊腺癌或子宫乳头状浆液性癌(UPSC)；前列腺癌；睾丸癌；胆囊癌；肝胆管癌；软组织和骨滑膜肉瘤；横纹肌肉瘤；骨肉瘤；软骨肉瘤；尤文肉瘤；甲状腺未分化癌；肾上腺皮质癌；胰腺癌；胰腺导管癌或胰腺腺癌；胃肠/胃(GIST)癌；淋巴瘤；头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)；唾液腺癌；神经胶质瘤或脑癌；神经纤维瘤病-1相关的恶性外周神经鞘瘤(MPNST)；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、结直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢肿瘤、输卵管癌、乳头状浆液性囊腺癌、子宫乳头状浆液性癌(UPSC)、肝胆管癌、软组织和骨滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、甲状腺未分化癌、肾上腺皮质癌、胰腺癌、胰腺导管癌、胰腺腺癌、神经胶质瘤、脑癌、神经纤维瘤病-1相关的恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症选自肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢肿瘤、输卵管癌、乳头状浆液性囊腺癌、子宫乳头状浆液性癌(UPSC)、肝胆管癌、软组织和骨滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、甲状腺未分化癌、肾上腺皮质癌、胰腺癌、胰腺导管癌、胰腺腺癌、神经胶质瘤、神经纤维瘤病-1相关的恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，癌症是肝母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，癌症是直肠癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌或卵巢肿瘤。在一些实施方案中，癌症是卵巢上皮癌。在一些实施方案中，癌症是输卵管癌。在一些实施方案中，癌症是乳头状浆液性囊腺癌。在一些实施方案中，癌症是子宫乳头状浆液性癌(UPSC)。在一些实施方案中，癌症是肝胆管癌。在一些实施方案中，癌症是软组织和骨滑膜肉瘤。在一些实施方案中，癌症是横纹肌肉瘤。在一些实施方案中，癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，癌症是甲状腺未分化癌。在一些实施方案中，癌症是肾上腺皮质癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌或胰腺导管癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺腺癌。在一些实施方案中，癌症是神经胶质瘤。在一些实施方案中，癌症是恶性外周神经鞘瘤(MPNST)。在一些实施方案中，癌症是神经纤维瘤病-1相关的MPNST。在一些实施方案中，癌症是瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在一些实施方案中，癌症是成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑和脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发灶不明癌、中枢神经系统癌、子宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管原位癌(DCIS)、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、组织细胞增多症、朗格汉斯细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌、小叶原位癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、恶性间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性病症、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、唇癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体中分化实质肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、乳腺癌、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、肾盂癌、输尿管癌、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性鳞状颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、妊娠滋养细胞肿瘤、原发灶不明癌、儿童期异常癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或维尔姆斯瘤。

在某些实施方案中，癌症选自膀胱癌、乳腺癌(包括TNBC)、子宫颈癌、结肠直肠癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、食管腺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、白血病(急性和慢性)、低级神经胶质瘤、肺癌(包括腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、黑素瘤、多发性骨髓瘤(MM)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌(包括肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌)和胃癌。

在一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、成神经细胞瘤、其他实体瘤或其他血液癌症。

在一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤或AML。

本发明的特征还在于用于诊断、预后和治疗病毒相关癌症的方法和组合物，所述病毒相关癌症包括人类免疫缺陷病毒(HIV)相关实体瘤、人乳头状瘤病毒(HPV)-16阳性不可治愈的实体瘤和成人T细胞白血病，所述成人T细胞白血病由人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)引起并且是特征在于HTLV-I在白血病细胞中的克隆整合的高度侵袭性形式的CD4+T细胞白血病(参见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02631746)；以及胃癌、鼻咽癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、头颈部鳞状细胞癌和默克尔细胞癌中的病毒相关肿瘤。(参见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02488759；另见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT0240886；https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02426892)

在一些实施方案中，癌症或肿瘤包括本文所述的任何癌症。在一些实施方案中，癌症包括黑素瘤癌症。在一些实施方案中，癌症包括乳腺癌。在一些实施方案中，癌症包括肺癌。在一些实施方案中，癌症包括小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，癌症包括非小细胞肺癌(NSCLC)。

在一些实施方案中，本文所述的方法或用途抑制或减少或阻止癌症或肿瘤的生长或扩散。在一些实施方案中，本文所述的方法或用途抑制或减少或阻止癌症或肿瘤的进一步生长。在一些实施方案中，相对于治疗前癌症或肿瘤的大小，本文所述的方法或用途使癌症或肿瘤的大小(例如，体积或质量)减小至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％或至少99％。在一些实施方案中，相对于治疗前癌症或肿瘤的量，本文所述的方法或用途使患者的癌症或肿瘤的量减少至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％或至少99％。

根据本发明的方法，化合物和组合物可以使用有效治疗癌症或肿瘤或减轻其严重程度的任何量和任何施用途径施用。所需的确切量因受试者而异，具体取决于受试者的种类、年龄和一般状况、疾病或病症的严重程度、特定药剂、其施用模式等。根据本发明的方法，优选将化合物和组合物配制成易于施用和剂量均匀的剂量单位形式。如本文所用的表述“剂量单位形式”是指适合于待治疗患者的药剂的物理离散单位。然而，应当理解，化合物和组合物的总日用量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者或生物体的具体有效剂量水平取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；使用的具体化合物的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；使用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与使用的具体化合物组合使用或同时使用的药物，以及医学领域熟知的类似因素。如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指动物，优选哺乳动物，最优选人。

本发明的药学上可接受的组合物可以口服、直肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏或滴剂)、口腔、作为口服或鼻喷雾剂等施用于人和其他动物，这取决于所治疗的疾病或病症的严重程度。在某些实施方案中，本发明的化合物可以每天约0.01mg/kg至约50mg/kg并且优选约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重的剂量水平口服或胃肠外施用，每天一次或多次，以获得所需的治疗效果。

用于经口施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、混悬液、糖浆以及酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及其混合物。除惰性稀释剂外，经口组合物还可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。

可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬液，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是含于无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液或乳液，例如如1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作为溶剂或混悬介质。为了这个目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸用于制备可注射制剂。

可注射制剂可以灭菌，例如，通过经由细菌截留过滤器过滤或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述灭菌剂可以在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。

为了延长本文所述的化合物的作用，通常需要减缓化合物从皮下或肌内注射中的吸收。这可通过使用水溶性不良的结晶或非晶物质的液体混悬液来达成。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。替代性地，通过将化合物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现胃肠外施用的化合物的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微胶囊基质来制备可注射贮库形式。根据化合物与聚合物的比率和使用的具体聚合物的性质，可以控制化合物释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物包埋在与人体组织相容的脂质体或微乳液中来制备贮库型可注射制剂。

用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，其可以通过将本发明的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，所述合适的无刺激性赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。

用于经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填料或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)湿润剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解延迟剂，诸如石蜡，f)吸收加速剂，诸如季铵化合物，g)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及它们的混合物。在胶囊、片剂以及丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填料，使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳诸如肠溶包衣和药物制剂领域熟知的其他包衣来制备。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在或优选地在肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填料，使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。

活性化合物也可以呈与一种或多种如上所述的赋形剂一起的微囊化形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳诸如肠溶包衣、释放控制包衣和药物制剂领域熟知的其他包衣来制备。在这样的固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。通常的做法是，这样的剂型还可包含除惰性稀释剂之外的另外的物质，例如，制片润滑剂以及诸如硬脂酸镁和微晶纤维素的其他制片助剂。在胶囊、片剂以及丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。它们可任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在或优选地在肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

用于局部或经皮施用本发明化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也被认为在本发明的范围内。另外，本发明涵盖使用经皮贴剂，其具有增加的优点，即向身体控制递送化合物。这样的剂型可以通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收增强剂也可用于增加化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。

实施例

以下实施例旨在说明本发明，而不应解释为对本发明的限制。除非另有说明，否则所有氨基酸均以L-构型使用。

实施例1：BT5528的合成

通过固相合成来合成肽。使用Rink酰胺MBHA树脂。向含有Rink酰胺MBHA(0.4-0.45mmol/g)和Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.0当量)的混合物中添加DMF，然后添加DIC(3当量)和HOAt(3当量)并混合1小时。使用20％哌啶的DMF溶液解封闭。使用活化剂试剂、DIC(3.0当量)和HOAT(3.0当量)的DMF溶液将每个后续氨基酸与3当量偶联。通过茚三酮显色反应或四氯显色反应监测反应。合成完成后，将肽树脂用DMF×3、MeOH×3洗涤，然后在N

使用8.0g树脂产生2.1g双环肽1(99.2％纯度；16.3％产率)，为白色固体。

化合物2的制备

通过固相合成来合成肽。使用50g CTC树脂(低于：1.0mmol/g)。向含有CTC树脂(50mmol，50g，1.0mmol/g)和Fmoc-Cit-OH(19.8g，50mmol，1.0当量)的混合物中添加DCM(400mL)，然后添加DIEA(6.00当量)并混合3小时。然后添加MeOH(50mL)并混合30分钟用于封端。使用20％哌啶的DMF溶液解封闭。使用HBTU(2.85当量)和DIPEA(6.0当量)的DMF(400mL)溶液将Boc-Val-OH(32.5g，150mmol，3当量)与3当量偶联。通过茚三酮显色反应试验监测反应。合成完成后，将肽树脂用DMF×3、MeOH×3洗涤，然后在N

化合物3的制备

将化合物2(4.00g，10.68mmol，1.00当量)在DCM(40.00mL)和MeOH(20.00mL)中的溶液在室温下搅拌，然后添加(4-氨基苯基)甲醇(1.58g，12.82mmol，1.20当量)和EEDQ(5.28g，21.37mmol，2.00当量)并将混合物在黑暗中搅拌9小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝5/1，Rf＝0.56)指示形成了一个新的斑点。减压浓缩反应混合物以除去溶剂。将所得残余物通过快速硅胶色谱法(

化合物4的制备

向化合物3(3.00g，6.26mmol，1.00当量)在无水THF(35.00mL)及无水DCM(15.00mL)中的溶液中添加氯甲酸(4-硝基苯基)酯(6.31g，31.30mmol，5.00当量)和吡啶(2.48g，31.30mmol，2.53mL，5.00当量)，并在25℃下搅拌混合物5小时。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1，Rf＝0.55)指示形成了一个新的斑点。将反应混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法(

化合物5的制备

将化合物4(278.43mg，387.80μmol，1.00当量)和DIEA(501.19mg，3.88mmol，677.29μL，10.00当量)在DMF(5.00mL)中的混合物在氮气下搅拌10分钟。添加MMAE(250.00mg，387.80μmol，1.00当量)和HOBt(52.40mg，387.80μmol，1.00当量)，并将混合物在0℃下在氮气下搅拌20分钟并在30℃下再搅拌18小时。LC-MS显示检测到一个具有所需质量的主峰。将所得混合物通过快速C18凝胶色谱法(

化合物6的制备

向化合物5(170.00mg，138.94μmol，1.00当量)在DCM(2.70mL)中的溶液中添加2,2,2-三氟乙酸(413.32mg，3.62mmol，268.39μL，26.09当量)，并在25℃下搅拌混合物1小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗。将混合物减压浓缩，得到残余物。将残余物溶于THF(10.00mL)中并添加K

化合物7的制备

向化合物6(110.00mg，97.92μmol，1.00当量)在DMA(5mL)中的溶液中添加DIEA(25.31mg，195.83μmol，34.20μL，2.00当量)和四氢吡喃-2,6-二酮(22.34mg，195.83μmol，2.00当量)。将混合物在室温下搅拌18小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗，并且检测到一个具有所需质量的主峰。将反应混合物通过快速C18凝胶色谱法(

化合物8(MMAE-PABC-Cit-Val-戊二酸酯-NHS)的制备

在N

BT5528的制备

向双环肽1(1.0-1.3当量)在DMA中的溶液中添加DIEA(3当量)和化合物8(1当量)。将混合物在25℃下搅拌18小时。通过LC-MS监测反应，并在完成后直接通过制备型HPLC纯化。

使用双环肽1(71.5mg，22.48μmol)作为双环试剂。得到BT5528(40.9mg，9.05μmol，40.27％产率，97.42％纯度)，为白色固体。

实施例2.EphA2 IHC测定

该测定检测EphA2细胞外结构域(ECD)，其为BT5528的结合位点。

1.固定并包埋组织，切割切片并将其安装到带正电荷的载玻片上，按照标准操作规程对切片进行脱蜡和再水合

2.将样品装载到Dako PT Link预处理模块中

3.将模块加热至65℃，在97℃下用低pH目标修复溶液进行抗原修复20分钟，将自动染色仪冷却至65℃

4.从PT Link中取出载玻片，并在室温下浸入Dako洗涤缓冲液中(至少5分钟)

5.将样品装载到Dako自动染色仪48中

6.在环境温度下用Dako洗涤缓冲液洗涤5分钟

7.在环境温度下用Flex过氧化物封闭试剂封闭5分钟

8.用洗涤缓冲液冲洗

9.在环境温度下用蛋白质封闭剂封闭10分钟

10.鼓风

11.与稀释在Dako背景减少稀释剂中的抗hEphA2抗体(10ug/ml)在环境温度下孵育30分钟

12.用洗涤缓冲液冲洗

13.与2.5％正常马血清在环境温度下孵育20分钟

14.用洗涤缓冲液冲洗

15.与马抗山羊IgG聚合物试剂在环境温度下孵育15分钟

16.用洗涤缓冲液冲洗

17.与FLEX DAB底物缓冲液和色原在环境温度下孵育10分钟

18.用洗涤缓冲液冲洗

19.用DI水冲洗

20.与FLEX苏木精在环境温度下孵育1分钟

21.用DI水冲洗

22.用DI水冲洗

23.从Dako中取出，在梯度酒精中脱水，并在二甲苯中在环境温度下澄清7分钟

24.封片

使用H评分方法对EphA2染色结果进行评分(定义为细胞百分比与它们的根据0-3的等级的染色强度的乘积的总和，其中0为阴性并且3为强染色)。可以生成肿瘤细胞膜(TM)和肿瘤细胞质(TC)的独立H评分以区分两个区室。H评分≥20被视为EphA2呈阳性。

对包括胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、胃癌、NSCLC、TNBC和卵巢癌的适应症的TMA进行染色并对EphA2表达进行评分。EphA2表达模式在测试的适应症中不同，其中胰腺具有最大EphA2表达频率。与所评估的其他适应症相比，胰腺和膀胱的TM的核阳性百分比高于TC。这些差异可能与BT5528适应症选择有关，因为在TM阳性的情况下，BTC的机制可能会得到增强。

使用IHC测定法评估EphA2跨多个TMA的表达并分别对TM和TC进行评分可帮助指导BT5528临床方案的适应症选择。

虽然描述了本发明的多个实施方案，但是显然可以改变实施例以提供利用本发明的化合物和方法的其他实施方案。因此，应当理解，本发明的范围将由本申请和权利要求书限定，而不是由通过实施例表示的具体实施方案限定。

序列表

<110> 拜斯科技术开发有限公司(BicycleTx Limited)

<120> 特征在于促红细胞生成素产生肝细胞受体A2 (EPHA2)的过表达的疾病的治疗

<130> BIC-C-P3077PCT

<150> 63/038,279

<151> 2020-06-12

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是HArg

<220>

<221> Xaa

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是HyP

<220>

<221> Xaa

<222> (15)..(15)

<223> Xaa是D-Asp

<220>

<221> Xaa

<222> (17)..(17)

<223> Xaa是HArg

<400> 1

Ala Xaa Asp Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Xaa Trp

1 5 10 15

Xaa Cys