戊糖片球菌SC009及其应用

技术领域

本发明涉及微生物制品技术领域，具体涉及一种戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus) SC009及其应用。

背景技术

人一生中有近三分之一的时间在睡眠中度过，睡眠是人类和高等动物必须的生理过程，是维持体力和健康的基础。随着现代生活节奏的日益加快和竞争压力激增，失眠症的发生率逐年增高，严重影响人类身体健康和社会活动功能。据报道，暂时性失眠(transientinsomnia)大约影响近80％的人群；长期失眠(chronic insomnia)影响约15％的人群。在美国约有56％的人群受到失眠的困扰；中国北京等6城市普通人群失眠调查状况表明：成年人在过去12个月中失眠患病率为57％(44％-68％)；“浅睡眠”现象在人群中的比例更是高达77.3％。因此对于失眠症的研究与防治工作已迫在眉睫。目前，睡眠障碍的治疗以服用人工合成的镇静、催眠药物为主，其作用确切、见效快，但存在依赖、认知和运动损害、停药反跳等不良反应。因此，亟需寻找安全有效食品补充剂。

氧化应激是指细胞内氧自由基水平升高，导致脂类、蛋白质和DNA的损伤。高活性的氧自由基，包括超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(-OH)和过氧化氢(H

大多数生物在进化过程中拥有酶和非酶的抗氧化防御系统和修复系统，保护机体免受氧化损伤。超氧化物歧化酶(SOD)是机体中最重要，也是目前研究的最广泛的一种酶抗氧化系统，主要针对超氧阴离子自由基。丙二醛(MDA)是反应体内脂质过氧化的指标，反应出体内细胞受损伤的程度。MDA的检测通常与SOD的测定相互配合，SOD 活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。蛋白质碳基(Protein Carbonyl)是蛋白质氧化损伤的指标，反应的是蛋白质被H

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，属于革兰氏阳性球菌，链球菌科，片球菌属，能发酵葡萄糖产生乳酸，分布于麦芽汁及发酵植物材料，如酸腌菜、泡菜、青贮料等。2014年，戊糖片球菌被中国卫生计生委批准为新食品原料。作为一种乳酸菌，近年来戊糖片球菌的益生功能越来越受到关注和重视。Kwon等发现戊糖片球菌发酵的蛹虫草能抑制炎症反应并减轻接触性皮炎。Lv等，Shi等和Dubey等三个团队分别发现戊糖链球菌能减轻D-半乳糖胺、四氯化碳和镉诱导的肝损伤。Xu等发现戊糖链球菌能够抵抗艰难梭菌的感染。戊糖片球菌对于抗氧化作用的研究目前多停留于体外实验。Ayyash等发现戊糖片球菌M41在体外试验中对DPPH和ABTS的清除率分别为76.5％和48.9％。但目前还未有戊糖片球菌在体内实验中被证实具有促进睡眠、抗氧化或抗衰老的报道。

发明内容

本发明提供了一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)SC009及其应用，具有改善睡眠(促进睡眠)、抗氧化、抗衰老作用，可用于制备改善睡眠、抗氧化和/或抗衰老的食品、保健食品和药物，以及具有抗氧化和/或抗衰老的护肤品和化妆品。

本发明首先提供了一种戊糖片球菌SC009(Pediococcus pentosaceus SC009)，保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年6月28日,保藏号 为CGMCC No.22796，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。

本发明提供的戊糖片球菌SC009(Pediococcus pentosaceus SC009)的形态学特征为：革兰氏阳性，不形成芽孢，无运动性，专性厌氧的四联球菌。

本发明提供的戊糖片球菌SC009(Pediococcus pentosaceus SC009)在pH3.0处理4h 后，存活率达到35％以上。

本发明提供的戊糖片球菌SC009(Pediococcus pentosaceus SC009)在浓度为0.3-1.0％的牛胆汁中作用4h的存活率分别达到70％以上。

本发明提供的戊糖片球菌SC009(Pediococcus pentosaceus SC009)活菌和热灭活菌在戊巴比妥钠催眠小鼠中能均能极显著缩短睡眠潜伏期和延长睡眠时长，提高小鼠睡眠质量。

本发明提供的戊糖片球菌SC009能显著提高中老年大鼠血清中总SOD、还原型谷胱甘肽，降低MDA和蛋白质羰基的含量，具有显著的抗氧化活性。

本发明提供的戊糖片球菌SC009能延长老年大鼠的生存时间，具有抗衰老的作用。

本发明提供了一种含有戊糖片球菌SC009的微生物制品，其可以为包含戊糖片球菌SC009活菌或灭活菌的所有剂型。

本发明进一步提供了一种戊糖片球菌SC009的冻干菌粉，其制备方法为：戊糖片球菌SC009先接种于固体培养基中进行厌氧培养，得到种子后再接种于液体培养基中发酵，发酵后的上清液为菌液，得到的菌液进行真空冷冻干燥，得到冻干菌粉。优选的，所述的液体培养基为任意适合乳酸菌培养的培养基；所述固体培养基为在液体培养基的基础上加琼脂得到；液体培养基中发酵温度35-37℃，发酵培养12-72h。

本发明提供了所述的戊糖片球菌SC009或其冻干菌粉在制备改善睡眠、促进睡眠的食品中的用途，所述食品可以是乳制品、压片糖果、饮料、甜点、糖果、酱料等一切普通食品、保健食品的形式。

本发明提供了所述的戊糖片球菌SC009在制备治疗睡眠障碍的药物中的用途。所述的睡眠障碍为失眠症。

所述的戊糖片球菌SC009可用于制备改善睡眠食品、改善睡眠保健食品或治疗睡眠障碍的药物，所述的制备方法具体包括：

将戊糖片球菌SC009进行发酵，然后真空冷冻干燥制得冻干菌粉，将冻干菌粉添加到食品、保健食品或药物中，得到改善睡眠食品、改善睡眠保健食品或治疗睡眠障碍的药物。

本发明还提供了所述的戊糖片球菌SC009在制备抗氧化的护肤品或化妆品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明发现了一种新的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)SC009，具有促进睡眠、抗氧化和抗衰老的作用，可用于制备改善睡眠、抗氧化和抗衰老的食品、改善睡眠、抗氧化和抗衰老的保健食品或治疗睡眠障碍的药物，以及用于制备抗氧化和抗衰老的护肤品和化妆品。在动物试验中，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)SC009能显著缩短小鼠睡眠潜伏期和延长睡眠时长，提高小鼠睡眠质量；显著提高中老年大鼠血清中的总SOD和还原型谷胱甘肽含量，降低MDA和蛋白质羰基的含量，具有显著的抗氧化活性；能延长老年大鼠的生存时间，具有抗衰老的作用。戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) SC009因具备促进睡眠、抗氧化和抗衰老的作用，有利于市场化推广利用，具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为SC009热灭活后对戊巴比妥钠致睡眠小鼠的睡眠潜伏期(A)和睡眠时长(B)的影响比较图，其中，图1中A为SC009热灭活后对戊巴比妥钠致睡眠小鼠的睡眠潜伏期的影响比较图，图1中B为SC009热灭活后对戊巴比妥钠致睡眠小鼠的睡眠时长的影响比较图。

具体实施方式

下述实施例仅具有说明性，本发明不受这些实施例的限制。

下述实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所用的试剂、材料、仪器设备等，均可从商业途径获得。

本发明的戊糖片球菌SC009，可先接种于适合乳酸菌生长的固定培养基中进行厌氧培养，得到种子后再接种于适合乳酸菌生长的液体培养基中。

适合戊糖片球菌SC009生长的液体培养基，可为现有技术适合乳酸菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，具体可为：水解酪蛋白1-10g/L，植物胨1-5g/L，酵母粉1-2g/L，葡萄糖1-5g/L，L-半胱氨酸，0.2-0.5g/L，磷酸氢二钾0.5-2.0g/L，氯化镁0.2-0.5g/L，硫酸锌0.10-0.25g/L，氯化钙0.05-0.15g/L，氯化铁0.0001-0.0005g/L，吐温801.0-2.0g/L， pH＝6.5-7.4。

适合戊糖片球菌SC009生长的固定培养基，可在液体培养基的基础上加10-30g/L的琼脂。

所述的适合戊糖片球菌SC009的培养条件，可为现有技术任何适合乳酸菌培养的条件，具有可为温度35-37℃，培养12-72h。

实施例1.戊糖片球菌SC009的分离纯化

以浙江的腌制酸菜液为样品，接种于MRS固体培养基中，37℃条件下厌氧培养48h；挑取表面光滑的白色菌落做革兰氏染色，显微镜下观察到菌体为革兰氏阳性，无芽孢的四联球菌。将该菌落到接种到MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养48h；提取基因组，利用PCR扩增16S rDNA，测序并比对，发现并保存戊糖片球菌SC009。

实施例2.戊糖片球菌SC009的耐酸特性

取戊糖片球菌SC009悬浮在pH为1.0，2.0，3.0，4.0，7.0的PBS中，37℃培养1h， 2h，3h，4h，用平板计数方法测定活菌率。戊糖片球菌SC009在不同pH条件，不同时间点的活菌率见表1。

表1.戊糖片球菌SC009在酸性条件下活菌率

注：本次实验设置3个平行，数据为平均值±SD。

实施例3.戊糖片球菌SC009的耐胆汁特性

取戊糖片球菌SC009悬浮在含0％，0.3％，0.6％和1％牛胆汁的PBS中，37℃培养1h，2h，3h，4h，用平板计数方法测定活菌率。戊糖片球菌SC009在不同胆汁浓度，不同时间点的活菌率见表2，戊糖片球菌能抵抗浓度为0.3％，0.6％和1％牛胆汁。

表2.戊糖片球菌SC009牛胆汁处理后的活菌率

注：本次实验设置3个平行，数据为平均值±SD。

实施例4.戊糖片球菌SC009的生化反应结果

生化鉴定实验：挑取MRS平板上生长的戊糖片球菌的单个菌落，用梅里埃全自动微生物生化鉴定系统(VITEK 2 Systems Version)进行生化反应检测。戊糖片球菌SC009 的主要生化反应见表3。

表3.戊糖片球菌SC009的生化反应结果

实施例5.戊糖片球菌SC009活菌与热灭活菌促进睡眠的特性

⑴取厌氧培养24h的戊糖片球菌SC009，离心并用PBS洗涤3次并稀释到10

⑵取一部分活菌样品，放置在沸水中煮沸15分钟，即为热灭活处理后的热灭活菌样品；

⑶取20-24g的ICR小鼠，按照每天每只2-4×10

⑷腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠，计算小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时长。注射戊巴比妥钠到小鼠反正反射消失为睡眠潜伏期，小鼠反正反射消失到恢复为睡眠时长。

结果发现：戊糖片球菌SC009活菌和热灭活菌均能极显著的缩短小鼠的睡眠潜伏期，延长小鼠的睡眠时长，睡眠时长延长了200％(图1)。图1中，(A)示意了戊糖片球菌SC009对戊巴比妥钠致睡眠小鼠的睡眠潜伏期的影响，(B)示意了戊糖片球菌SC009对戊巴比妥钠致睡眠小鼠睡眠时长的影响；每组7-8只小鼠。*：p﹤0.05；***：p﹤0.001。

实施例6.戊糖片球菌SC009对中老年大鼠抗氧化的作用

⑴取厌氧培养24h的戊糖片球菌SC009，离心并用PBS洗涤3次并稀释到10

⑵取14月龄的SD大鼠，按照每天每只1-3×10

⑶大鼠处死后，留取血样检测抗氧化指标(总SOD，MDA，蛋白质羰基和还原型谷胱甘肽)。

结果发现：戊糖片球菌SC009能显著提高中老年大鼠血清中总SOD、还原型谷胱甘肽，降低MDA和蛋白质羰基的含量，具有显著的抗氧化活性(表4)。

表4.戊糖片球菌SC009对老年大鼠的抗氧化指标

注：本次实验每组共8只SD大鼠，数据为平均值±SD。*：p﹤0.05；**：p﹤0.01；***： p﹤0.001

实施例7菌液的制备

本发明的戊糖片球菌SC009，可先接种于适合生长的固体培养基中进行厌氧培养，得到种子后再接种于适合生长的发酵液发酵，发酵后的上清液即为菌液。

实施例8冻干菌粉的制备

本发明的戊糖片球菌SC009，可先接种于适合生长的固体培养基中进行厌氧培养，得到种子后再接种于适合生长的发酵液发酵，发酵后的上清液即为菌液，然后低温真空冷冻干燥机干燥制得冻干菌粉。

实施例9胶囊剂的制备

本发明的戊糖片球菌SC009制得冻干菌粉放置于胶囊中即为胶囊剂。

实施例10片剂的制备

本发明的戊糖片球菌SC009制得冻干菌粉压片后得到片剂。

实施例11颗粒剂的制备

本发明的戊糖片球菌SC009制得冻干菌粉与适量糖粉混合均匀后，用适量乙醇制粒、干燥、整粒，分装即得。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。