一种掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体为一种掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷、制备方法及应用。

背景技术

肿瘤、外伤、畸形等疾病造成的大块骨缺损严重影响患者的生活质量。而人体自身的骨再生水平有限，因此骨移植手术是修复大块骨缺损的重要治疗方式，同时也是世界范围内公认的难点。自体异体骨移植是常用的骨缺损修复再生手段，但是往往伴随着高昂的费用及供体损伤。目前通过细胞、生物材料相结合的组织工程技术引导骨缺损修复再生，可以避免供体损伤，但现有兼具良好生物相容性及生物活性的临床转化材料较少，因此如何得到长期稳定和良好修复效果的材料，仍是本技术领域研究的难点和热点。

羟基磷灰石又称羟磷灰石，其分子式为Ca

羟基磷灰石材料作为天然的人体骨组织主要成分，具有良好的骨传导、骨诱导和骨整合性能。而羟基磷灰石纳米线生物陶瓷材料较成分相同的微米级颗粒材料具有更大的接触面积，更佳的细胞粘附性和生物活性，更活跃的细胞－细胞外基质的相互作用，表现为优越的诱导细胞增殖和成骨效果。

锰(Mn)作为人体微量元素参与调节骨和肌肉代谢，其在骨中的含量约为1.7～3ppm。研究表明，不同锰含量的羟基磷灰石纳米材料在形貌上有显著多样性，不同形貌的掺锰羟基磷灰石纳米材料也将影响蛋白的表面吸附能力。掺锰羟基磷灰石材料通过降解释放的二价锰(Mn)离子，其具有调控整合素、稳定细胞粘附、促进成骨细胞增殖与矿化和抑制破骨作用，对细胞外间质成分进行调控。因此，通过将锰离子的特性及羟基磷灰石纳米线的优势相结合，能使该材料具有更佳的生物学特性，有利于提高骨缺损修复能力。

申请号为201611095409.1的发明专利申请公布了一种羟基磷灰石纳米线、纳米线组装网状结构及其制备方法。二维网状结构羟基磷灰石纳米线由能在水中以单分散状态存在的直径为2～100nm，长度为50nm～100μm的羟基磷灰石纳米线自组装形成。此种羟基磷灰石纳米线不含锰元素，无法发挥锰(Mn)作为人体微量元素参与调节骨和肌肉代谢的作用。

申请号为201810205600.X的发明专利申请公布了一种微量锰掺杂羟基磷灰石生物陶瓷粉体材料及其制备方法和应用，微量锰掺杂羟基磷灰石陶瓷粉体材料的组成通式为Ca

以羟基磷灰石材料作为人体骨组织主要成分所具有的天然优势为基础，利用纳米结构优越的生物活性，线形晶体形貌以及锰离子的促成骨特性，能够制备掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。由于羟基磷灰石纳米线制备条件较苛刻，目前尚没有对掺锰羟基磷灰石纳米线进行系统的研究。因此，亟需一种掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷作为长期稳定和良好修复效果的材料，以提高骨缺损的修复能力。

发明内容

本发明意在提供一种掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷、制备方法及应用，基于不同形貌的羟基磷灰石以及不同金属元素的促成骨特性，通过调整材料的元素组成设计与材料制备方法，研制出同时具备纳米线形貌及锰元素的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷，以应用于骨缺损修复。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。上述掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的化学组成通式为Ca

在一些实施例中，纳米线的长度为1μm～20μm，直径为1nm～20nm。

在一些实施例中，掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的化学组成通式Ca

本发明的第二方面，提供了上述掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的制备方法，包括如下步骤：将可溶性钙盐、可溶性锰盐、磷酸二氢钠溶于油酸钠溶液中，得到水热反应前驱液，水热反应前驱液置于反应釜中进行水热反应，反应产物经由过滤、洗涤、干燥、过筛，得到掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。

在一些实施例中，水热反应前驱液置于反应釜中在200℃条件下反应36小时。

在一些实施例中，油酸钠溶液采用如下方法制得：将油酸钠粉末溶于70℃去离子水中，然后冷却至室温。

在一些实施例中，制备方法包括如下步骤：先将可溶性钙盐与可溶性锰盐溶于油酸钠溶液中，得到钙离子和锰离子的总浓度为0.02～0.03mol/L的混合溶液；再将磷酸二氢钠溶于混合溶液中，得到磷酸根离子浓度为0.03～0.04mol/L的水热反应前驱液。

在一些实施例中，可溶性钙盐选用硝酸钙或氯化钙中的一种或多种的组合。

在一些实施例中，可溶性锰盐选用硝酸锰或氯化锰中的一种或多种的组合。

本发明的第三方面，公开了上述掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷作为具有促成骨能力的骨缺损修复材料的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷，羟基磷灰石掺杂二价锰离子，呈现纳米线形晶体形貌。掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷可作为具有成骨修复能力的骨缺损修复材料，具有良好的生物相容性及促进成骨修复的潜能。

附图说明

图1为0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的扫描电镜(SEM)照片。

图2为0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的透射电镜(TEM)照片与形貌统计图。

图3为0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的mapping能谱点扫。

图4为0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的X射线衍射(XRD)。

图5为0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的傅立叶变换红外吸收光谱(FTIR)。

图6为mBMSC小鼠骨髓间充质干细胞在浓度为0、0.1、1、10、100μg/ml，0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液中培养1、3和7天后的增殖情况。

图7为mBMSC小鼠骨髓间充质干细胞在浓度为0、0.1、1、10、100μg/ml，0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液中培养7天后碱性磷酸酶(ALP)的表达情况。

图8为mBMSC小鼠骨髓间充质干细胞在浓度为0、0.1、1、10、100μg/ml，0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液中培养14天后的成骨细胞矿化结节染色情况。

图9为mBMSC小鼠骨髓间充质干细胞在浓度为0、0.1、1、10、100μg/ml，0％与5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷培养4、7、14天后的成骨相关基因表达情况。

具体实施方式

在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义，“多种”一般包含至少两种。

本发明通过改变钙盐与锰盐比例，制作分别含有Mn/(Mn+Ca)为0％和5％的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷，其中，Mn/(Mn+Ca)为0％即未掺入Mn元素，它作为对比例。研究表明：纳米级材料较微米级材料有更优越的生物活性、降解性。形貌不同的纳米级羟基磷灰石表现出不同的生物学特性，长度适当的纳米线较纳米棒具有更好的促成骨作用，锰掺杂的羟基磷灰石颗粒对蛋白的吸附水平受其形貌影响。羟基磷灰石有良好的骨传导、骨诱导性能，同时锰离子能对细胞外间质成分进行调控，稳定细胞粘附，促进成骨细胞增殖与矿化。因此本发明拟结合羟基磷灰石纳米线与锰离子的特点，构建新型的骨修复材料，用以提高骨缺损区域的成骨修复能力。

本发明提供了一种掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷，其化学组成通式为Ca

本发明提供的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷，其纳米线的长径为1μm～20μm，直径为1nm～20nm；含有锰元素。

上述掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的制备方法是：以油酸钠作为分散系，可溶性钙盐提供钙离子，可溶性锰盐提供锰离子，可溶性磷酸二氢钠提供磷酸根。上述原料按化学计量比配料后，进行200℃36小时水热反应。将得到产物通过抽滤、洗涤、干燥、过筛，制得掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。具体步骤为：

步骤一、以油酸钠溶液作为分散系，以可溶性钙盐为钙源、以可溶性锰盐为锰源，按化学计量比Ca

其中，可溶性钙盐为硝酸钙和氯化钙中的一种或多种，可溶性锰盐为硝酸锰和氯化锰中的一种或多种。优选地，油酸钠溶液采用如下方法制得：将油酸钠粉末溶于70℃去离子水中，然后冷却至室温。

步骤二、将可溶性磷酸二氢钠溶于上述混合溶液，以使磷酸根离子浓度为0.03～0.04mol/L，物料加毕后继续搅拌0.5小时。

步骤三、将步骤二所得液体于反应釜中200℃反应36小时，经过过滤、洗涤、干燥、过筛，得到掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷的长度为1μm～20μm，直径为1nm～20nm的纳米线。

本发明的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷主要运用于骨缺损修复方向，特点为：1)超长纳米线形晶体形貌；2)掺杂二价锰离子。

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的温度、时间等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

对比例1

取2.432g油酸钠溶于70℃25ml去离子水中充分溶解，冷却至室温，得到油酸钠溶液。以10mL/min的速率，向上述油酸钠溶液中滴加含0.222g氯化钙的25ml水溶液，得到混合溶液。搅拌30min后，再以10mL/min的速率，向上述混合溶液中滴加含0.281g二水合磷酸二氢钠的25ml水溶液。然后将上述混合液转移到100mL的Teflon反应釜中，200℃条件下反应36h，之后自然冷却至室温。将反应产物搅拌后，在乙醇中沉淀。水洗3遍，乙醇洗3遍。于60℃烘箱开盖干燥。研磨、过筛得羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。为了便于比较，本对比例制得产物用0％Mn-HANW表示，其化学式为Ca

将上述生物陶瓷进行透射电镜、扫描电镜、mapping能谱点扫、X射线衍射和傅立叶变换红外吸收光谱仪检测，进行材料表征。将小鼠骨髓间充质干细胞与羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液混合培养，并培养1、3和7天进行细胞增殖评价，培养7天进行碱性磷酸酶含量评价，培养14天进行成骨细胞矿化结节，培养4、7、14天进行成骨相关基因检测。

实施例1

取2.432g油酸钠溶于70℃25ml去离子水中充分溶解，冷却至室温，得到油酸钠溶液。以10mL/min的速率向上述混合溶液中滴加含0.209g氯化钙和0.0123g氯化锰的25ml水溶液，得到混合溶液。搅拌30min后，再以10mL/min的速率向上述混合溶液中滴加含0.281g二水合磷酸二氢钠的25ml水溶液。然后将上述混合液转移到100mL的Teflon反应釜中，200℃条件下反应36h，之后自然冷却至室温。将反应产物搅拌后，在乙醇中沉淀。水洗3遍，乙醇洗3遍。于60℃烘箱开盖干燥。研磨、过筛得5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷。本实施例制得产物用5％Mn-HANW表示，其化学式为Ca

将上述生物陶瓷进行透射电镜、扫描电镜、mapping能谱点扫、X射线衍射和傅立叶变换红外吸收光谱仪检测，进行材料表征。将小鼠骨髓间充质干细胞与羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液混合培养，并培养1、3和7天进行细胞增殖评价，培养7天进行碱性磷酸酶含量评价，培养14天进行成骨细胞矿化结节，培养4、7、14天进行成骨相关基因检测。

对上述比例1和实施例1的材料进行材料表征及体外细胞培养实验结果如下：

(1)材料表征

分别采用扫描电镜、透射电镜、能谱点扫、X射线衍射和傅立叶变换红外吸收光谱仪对Mn/(Mn+Ca)为0％和5％的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷(0％Mn-HANW与5％Mn-HANW)进行表征和分析。

图1的扫描电镜(SEM)显示，0％Mn-HANW及5％Mn-HANW为纳米线，5％Mn-HANW相互交织成网状。

图2的透射电镜(TEM)显示，0％Mn-HANW及5％Mn-HANW为纳米线，0％Mn-HANW长、宽分别为5.38±2.39μm、5.84±2.95nm，5％Mn-HANW长、宽分别为7.03±5.23μm、4.04±1.31nm。5％Mn-HANW为更长及更细的纳米长线形貌。

为了获知锰元素含量，采用能谱点扫对0％Mn-HANW及5％Mn-HANW进行元素半定量分析。图3能谱点扫实验显示5％掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷中Mn元素均匀分布，Mn/(Ca+Mn)＝6.67±0.22％。

图4的X射线衍射(XRD)显示0％Mn-HANW及5％Mn-HANW符合标准羟基磷灰石的晶体结构。

图5的傅立叶变换红外吸收光谱仪(FTIR)显示0％Mn-HANW及5％Mn-HANW的标准羟基磷灰石的基团分布。3570cm

(2)体外细胞评价

细胞模型的构建：小鼠骨髓间充质干细胞：采用4-6周小鼠原代骨髓间充质干细胞(mBMSC)，研究掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷对mBMSC的增殖和成骨能力的影响。采用mBMSC在掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷混悬液中培养，材料混悬液浓度分为五组：0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml。检测细胞的增殖能力、成骨分化能力、成骨矿化能力及成骨相关基因的表达情况。

如图6和图7所示，其分别示出mBMSC在0％Mn-HANW[x＝0，Ca

如图8所示，成骨细胞矿化结节染色液(茜素红S法)显示，在1μg/ml及10μg/ml掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷混悬液可以明显提高mBMSC成骨矿化能力，以5％Mn-HANW最为显著。图8证实了适宜浓度的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液可以明显提高mBMSC成骨矿化能力。

如图9所示，聚合酶链式反应(PCR)检测在掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷混悬液中培养的mBMSC，在4、7、14天时成骨相关基因的表达情况，包括Osterix1、Collagen1、OCN、ALP、Runx2、OPN。在1μg/ml的5％Mn-HANW混悬液中，mBMSC的Osterix1、Collagen1和ALP表达显著升高。ALP为成骨细胞生成的早期标志；Collagen1为细胞外基质蛋白，可刺激成骨细胞的粘附与分化；Osterix1是调节成骨细胞增殖、分化和骨形成的重要转录因子。5％Mn-HANW可明显利于构建良好的成骨环境，直接促进成骨调控相关基因表达。图9证实了适宜浓度的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷悬液可以明显提高mBMSC的Osterix1、Collagen1和ALP成骨基因表达。

体外实验本发明采用0％Mn-HANW与5％Mn-HANW悬液分别对小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSC)进行培养，培养浓度为0、0.1、1、10、100μg/ml，除100μg/ml悬液之外，其他浓度的悬液对mBMSC的增殖无明显的抑制作用，适宜浓度的5％Mn-HANW悬液可以明显提高mBMSC成骨分化、矿化能力，并能促进Osterix1、Collagen1和ALP成骨基因表达。

综上所述，经过材料表征及体外细胞实验证实，本发明成功合成掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷，其具有良好的生物相容性、成骨活性，具体表现为在适宜浓度下可促进小鼠骨髓干细胞构建良好的成骨环境、成骨调控相关基因表达，并最终促进成骨分化与矿化。因此，本发明的掺锰羟基磷灰石纳米线生物陶瓷可以应用于骨缺损修复。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。