一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及荧光探针，尤其是一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

活性氧(reactive oxidative species,ROS)是生物体在线粒体氧化代谢过程中产生的部分氧化还原产物，包括超氧化物、过氧化物、羟基自由基、单线态氧、过氧自由基、烷氧基、脂质过氧化物、过氧亚硝酸盐、次氯酸和臭氧等。生理条件下，低浓度的活性氧可调节维持细胞稳态的诸如细胞信号转导、细胞增殖和分化、能量转换、免疫反应等生理功能。然而细菌感染等病理刺激产生的过量ROS就会破坏核酸、蛋白质和酶，导致脓毒症、急性肝炎、阿尔兹海默症、肿瘤等疾病。

ROS的传统检测方法包括电化学方法、化学发光法、分光光度法、色谱法和荧光光谱法等。其中，荧光光谱法由于具有易于操作、低成本、高灵敏度、高选择性和非侵入性等优点，吸引了科学家们的关注，在生物传感和生物检测领域有广泛的应用。近年来发展了二氢乙胺(DHE)及靶向线粒体的mitoSOX用于细胞和线粒体内ROS的检测。然而由于DHE可以通过非特异性氧化还原反应形成乙锭，同时通过超氧化加和形成2-羟基乙锭，使得荧光光谱重叠，无法用共聚焦显微镜或其他基于荧光的显微分析方法进行简单的荧光定量检测。二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)是一种细胞通透性酯，可在细胞内水解为二羟基-DCFH，也是常用于细胞内ROS检测的荧光探针。然而由于DCFH不直接与ROS反应，而是通过在细胞内氧化为DCF。DCF自由基可被过渡金属、细胞色素C、血红素等催化氧化生成过氧化物和超氧化物，易产生假阳性结果。

发明内容

针对现有的不足，本发明提供一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针，如下化学式所示的化合物、或其立体异构体、或其互变异构体:

其中：R

一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针的制备方法，步骤如下：

S1，将4-溴邻苯二胺和丙酮酸乙酯分散在溶剂1中搅拌，反应结束后纯化得到化合物1；

S2，将化合物1分散在溶剂2中，加入烯丙基溴和碳酸钾，反应结束后纯化得到化合物2；

S3，化合物2分散在冰醋酸中，加入化合物3和催化量的浓硫酸，反应结束后纯化得到中间体化合物4；

S4，将化合物4、化合物5和联硼酸频那醇酯分散在溶剂3中，加入碳酸钾和催化剂(Ph

S5，将化合物6分散在溶剂4中，加入碘乙烷，反应结束后纯化得到最终产物；

其中,

化合物1是如下结构式的化合物:

化合物6是如下结构式的化合物:

其中：R

溶剂1是乙醇，溶剂2是丙酮，溶剂3是去离子水和1,4-二氧六环，溶剂4是四氢呋喃。

作为优选，所述4-溴邻苯二胺和丙酮酸乙酯的摩尔比为1:1.1-1:1.5，所述步骤S1的反应温度是室温，反应时间是6-12小时。

作为优选，所述化合物1和烯丙基溴的摩尔比为1:1-1:1.5，所述步骤S2的反应温度为50℃，反应时间为8～12小时。

作为优选，所述化合物2和化合物3的摩尔比为1:1.1-1:1.5，所述步骤S3的反应温度是80℃，反应时间是12-24小时。

作为优选，所述化合物4、化合物5、联硼酸频那醇酯的摩尔比为1:1:1.2-1:1:1.5，所述步骤S4的反应温度是80℃，反应时间是48-72小时。

作为优选，所述化合物6和碘乙烷的摩尔比为1:1.5-1:2.0，所述步骤S5的反应温度是室温，反应时间是12-24小时。

一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针的用途，采用如前所述的荧光探针用于检测细胞内ROS含量。

本发明的有益效果在于：该发明的荧光探针是基于喹喔啉酮骨架的聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针，基于聚集诱导发光(aggregation induced emission，AIE)的荧光探针由于斯托克斯位移大、发光强度高、耐光漂白性强、无随机闪烁、生物相容性好等优点，很好的解决了传统荧光探针易发生光淬灭和光漂白的问题，同时该荧光探针能在ROS作用下将分子中的硫醚氧化为砜和亚砜，导致荧光发射波长蓝移，进而实现ROS的高灵敏检测，形成聚集体后荧光效率增强，检测结果更准确，解决了传统ROS检测中产生的荧光光谱重叠，假阳性的问题，并且能够与细胞共培养，应用更方便。

附图说明

图1是本发明实施例荧光探针(QuinoNS)在ROS响应前后的荧光谱图(2为ROS响应前，1为响应后)；

图2是本发明实施例RAW264.7细胞对QuinoNS的摄取研究；

图3是本发明实施例QuinoNS对RAW264.7细胞的毒性研究；

图4是本发明实施例QuinoNS的核磁共振氢谱表征；

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

一种基于聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针及其制备方法和应用，荧光探针具有如下化学式所示的化合物、或其立体异构体、或其互变异构体:

其中：R

其制备过程是以4-溴邻苯二胺为起始原料通过与丙酮酸乙酯环化，随后通过亲核取代，缩合，Suzuki偶联，和乙基化反应构建具有聚集诱导发光特性的荧光探针，制备方法的反应路线如下：

S1，将4-溴邻苯二胺和丙酮酸乙酯分散在溶剂1中搅拌，溶剂1选择乙醇，反应结束后纯化得到化合物1，此时4-溴邻苯二胺和丙酮酸乙酯的摩尔比为1:1.1-1:1.5，其反应温度是室温，即化学实验中通常所指25℃，反应时间是6-12小时；制得的化合物1形成喹喔啉酮骨架，其结构式为：

S2，将前述步骤中制得的化合物1分散在溶剂2中，溶剂2是丙酮，然后加入烯丙基溴和碳酸钾，反应结束后纯化得到化合物2；此时化合物1和烯丙基溴的摩尔比为1:1-1:1.5，反应温度为50℃，反应时间为8～12小时；

化合物2是如下结构式的化合物:

S3，化合物2分散在冰醋酸中，加入化合物3和催化量的浓硫酸，即加入的浓硫酸是起到催化剂作用的，此时其摩尔浓度是18mol/L，加入的量则以2-4滴为宜，反应结束后纯化得到中间体化合物4；所述化合物2和化合物3的摩尔比为1:1.1-1:1.5，反应温度是80℃，反应时间是12-24小时；

化合物3是如下结构式的化合物:

化合物4是如下结构式的化合物:

在实施例中浓硫酸加入3滴,化合物2和化合物3的摩尔比1:1.2，反应时间23小时；

S4，将化合物4、化合物5和联硼酸频那醇酯分散在溶剂3中，溶剂3是去离子水和1,4-二氧六环，加入碳酸钾和催化剂(Ph

化合物5是如下结构式的化合物:

在实施例中化合物4、化合物5、联硼酸频那醇酯和碳酸钾的摩尔比为1:1:1.3:1.5，催化剂(Ph

S5，将化合物6分散在溶剂4中，溶剂4是四氢呋喃，加入碘乙烷，反应结束后纯化得到最终产物，亦即

同时在前述的结构式中：R

这样所制得的荧光探针是基于喹喔啉酮骨架的聚集诱导发光的ROS响应的荧光探针，其性质与卟啉类光敏剂正好相反，在水相中形成聚集体后荧光效率会显著增强，同时该荧光探针能在ROS作用下将分子中的硫醚氧化为砜和亚砜，导致荧光发射波长蓝移，进而实现ROS的高灵敏检测，检测结果更准确，解决了传统ROS检测中产生的荧光光谱重叠，假阳性的问题，就可以将其用于检测细胞内ROS含量，在细胞培养过程中就可以直接加入到细胞培养液中与细胞共培养，方便检测细胞内的ROS水平，应用更方便。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。