一种脑胶质瘤的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种脑胶质瘤的生物标志物及其应用。

背景技术

脑胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，其中多形性胶质母细胞瘤(GBM)是恶性度最高的原发性脑肿瘤，五年生存率只有5％。多形性胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，占原发性中枢神经系统肿瘤的14.9％，占全部恶性中枢神经系统肿瘤的46.6％。世界卫生组织根据组织学和分子特征将中枢神经系统肿瘤分为I至IV分级，GBM为IV级脑胶质瘤。恶性脑胶质瘤中存在一部分具有自我更新能力、多向分化能力和极强致瘤能力的细胞，即脑胶质瘤干细胞(GSCs)。GSCs被认为是恶性脑胶质瘤复发和复发后预后较差的主要原因。

对于诊断为GBM的患者，目前常规的治疗方法是手术切除肿瘤，术后放射治疗并辅以替莫唑胺。在过去的十年中，基因组分析揭示了GBM突变、拷贝数、基因表达和表观遗传学的改变。GBM最常见的基因改变包括TERT启动子点突变，CDKN2A/B、EGFR突变，抑癌因子TP53和PTEN失活，PIK3CA或PIK3R1突变，RB1失活，NF1突变等等。端粒在细胞周期中不能完全复制，因此每一次细胞分裂都会缩短，最终导致细胞衰老。为防止衰老，大多数GBM会上调端粒酶逆转录酶的表达水平，端粒酶逆转录酶能够合成端粒DNA、维持端粒稳定性，赋予细胞无限增殖的潜能。

尽管对于多形性胶质母细胞瘤的研究不断深入，GBM的治疗仍然很难，尽可能在早期发现并积极治疗是唯一能治愈的途径，而早期发现，需要检测手段的不断进步，已有多项报道多形性胶质母细胞瘤的标志物。然而，公开的多形性胶质母细胞瘤检测的标志物仍然很少，需要进一步开发，以进行更有效的相互验证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑胶质瘤的生物标志物及其应用。

一种脑胶质瘤的生物标志物，所述标志物为C10ORF5B蛋白或其RNA。

C10ORF5B基因在脑胶质瘤细胞中表达下调。

所述C10ORF5B蛋白的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

所述C10ORF5B基因的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

所述C10ORF5B蛋白或其RNA作为检测靶标在制备脑胶质瘤检测试剂盒中的应用。

一种试剂盒，含所述生物标志物C10ORF5B蛋白或其RNA。

一种产品，包括制剂、芯片或试剂盒，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测C10ORF5B基因表达水平的试剂。

一种试剂，所述试剂包含特异性扩增C10ORF5B基因的引物；或特异性识别C10ORF5B基因表达的mRNA的探针；或特异性结合C10ORF5B蛋白的抗体。

本发明的有益效果：本发明发现了一种脑胶质瘤的生物标志物C10ORF5B蛋白或其RNA，该标志物在脑胶质瘤细胞中表达下调，使用该分子标志物可以辅助确定脑胶质瘤的发生，由此可开发便于临床应用的辅助诊断试剂盒，为脑胶质瘤的筛查和诊断治疗提供支持。

附图说明

图1为人正常脑组织细胞和人脑胶质瘤细胞中C10ORF5B的mRNA表达量。

图2为人正常脑组织细胞和人脑胶质瘤细胞中C10ORF5B的蛋白水平含量。

图3为分析TCGA数据库中人脑胶质瘤患者的基因表达数据，根据C10ORF5B表达量的高低分为两类患者，比较这两类患者的生存期。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，为常规实验方法或按照试剂说明书规定的方法操作。

实施例1筛选人脑胶质瘤组织中差异表达基因

人脑胶质瘤为肿瘤原发病灶组织，对照为正常脑组织，材料分别选择200mg人脑胶质瘤和200mg正常脑组织，研磨充分后加入1.5mL细胞裂解液研磨至匀浆，分别取20μL匀浆至2个0.2mL PCR管中，用于DNA定量；在剩下的匀浆中加入1.46mL TrizoL，继续研磨匀浆3min；分别取0.8mL匀浆至1.5mL离心管中，同时在匀浆中加入不同拷贝数的spike RNA，氯仿抽提，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，DEPC水溶解。

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，Agilent2100测定RIN值，RNA完整，浓度≥20ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间，进行文库构建。应用IlluminaHiseq x-ten第二代高通量测序技术对样品进行测序。使用软件cuffquant、cuffdiff进行mRNA表达定量与差异表达分析。

RNA-seq结果显示，与对照组相比，人脑胶质瘤组中的C10ORF5B表达水平显著下调。

实施例2 Q-PCR验证人脑胶质瘤细胞中C10ORF5B的表达

实验材料：正常人脑组织细胞取自某医院的医学捐赠，人U251细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞培养基为10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM(武汉普诺赛生命技术有限公司)。

采用TIANGEN公司的培养细胞总RNA提取试剂盒，提取各组细胞的总RNA，利用TIANGEN公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录，具体反应操作步骤如下：

(1)将1.0μg的总RNA模板与2.0μl的5×gDNA buffer和RNase Free水混合，终体积为10μL，42℃孵育3min；

(2)将2.0μl的10×Fast RT buffer、1.0μL的PrimerScript RT Enzyme Mix I与2.0μL的FQ-RT Primer Mix混合，加入10μL的去除基因组DNA的反应体系和5.0μl的RNaseFree水，共20μL，42℃反应15min，之后95℃反应3min。

Q-PCR反应过程如下：

(1)引物设计

根据NCBI公开的C10ORF5B基因序列(GenBank:AJ535621.1)设计Q-PCR引物：

F P：GGGACCCGGGGCTTGATGCTG；

R P：AACAGCAAGTTAAGCAGGAAG。

利用TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus试剂盒。2×SuperReal PreMixPlus10μL，上下游引物各0.6μL，cDNA模板2μL，50×ROX Reference Dye 2μL，ddH

PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以SYBR Green作为荧光标志物，在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2

结果如图1所示，人胶质瘤细胞U251中C10ORF5B的mRNA表达量均显著低于人正常脑组织细胞。

实施例3 Western Blotting验证人胶质瘤细胞C10ORF5B蛋白的表达

(1)细胞蛋白提取

离心收集培养的人胶质瘤细胞(U251)，捣碎同质量的正常人脑组织(W1)，每个EP管加入裂解液200μL，使用移液枪反复吸取打出溶液至裂解液中无明显沉淀后，放置冰上静置裂解30min，然后在4℃下12000r/min离心8min，吸取上清即为细胞总蛋白提取液；测定蛋白浓度；蛋白浓度<1000μg/mL时加入1/4体积的上样缓冲液，蛋白浓度≥1000μg/mL时加入1/3体积的上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性。

将蛋白标准品稀释为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1mg/mL，待测蛋白样品稀释3倍进行浓度测定。向蛋白中加入1/4的上样缓冲液，煮沸5min变性。

(2)Western Blotting

将得到的变性蛋白样品以10μL直接上样到电泳胶的加样孔中，在冰浴中进行电泳，设置初始电泳电压为80V，待上样缓冲液中的示踪染料至浓缩胶与分离胶交界处，将电压调至90V。示踪染料到达胶的底端停止电泳，切下待测蛋白分子量区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100V，转膜后将印迹膜放入无蛋白封闭缓冲液中，于摇床上常温封闭3.5h，然后用洗膜液洗膜3次，加入待测蛋白的一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，4℃孵育3h后洗膜，然后进行显影。

结果如图2所示，人胶质瘤细胞U251中C10ORF5B蛋白的表达量均显著低于正常脑组织细胞。

实施例4 C10ORF5B表达量与人胶质瘤患者的生存期关联分析

从TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载肿瘤患者的mRNA数据和每位患者的临床信息，选择人胶质瘤患者的数据做后续分析，共有328个人胶质瘤样本。

使用R程序包中的edgeR package(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)进行基因表达分析，根据C10ORF5B的表达水平将328名人胶质瘤患者分为低表达组和高表达组。再进行Kaplan-Meier生存分析，根据two-sidedlong-rank test计算P值，P值小于0.05说明两组之间的生存曲线具有统计学差异。

分析TCGA数据库中人胶质瘤患者的基因表达数据，根据C10ORF5B表达量的高低分为两类患者(高表达组166人，低表达组162人)，比较这两类患者的生存期。结果如图3所示，发现C10ORF5B表达量高的患者，生存期明显优于C10ORF5B表达量低的患者。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。