EMP3作为治疗慢性肾脏病的靶点用途

技术领域

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种抑制EMP3作为治疗慢性肾脏病的靶点用途。

背景技术

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是由多种原因引起的，以肾脏结构损伤和功能障碍为主要特征的慢性疾病，而CKD进展后可发展为肾纤维化。肾纤维化是以正常肾单位丢失、大量成纤维细胞及肌成纤维细胞增生、细胞外基质堆积而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化为特征的一种病理生理改变，是引起终末期肾功能衰竭的主要原因。目前，临床上尚缺乏治疗或延缓肾纤维化的有效手段。

上皮膜蛋白3(Epithelial membrane protein 3，EMP3)基因是外周髓磷脂蛋白PMP22基因家族成员。人类EMP3基因位于染色体19q13.3，编码163个氨基酸的髓磷脂相关上皮膜蛋白3。EMP3基因编码蛋白的功能，与调节细胞增殖、分化、激活凋亡通路以及细胞间的相互作用有关，研究发现，EMP3基因在少突胶质瘤中过表达，除此之外，在原发性胶质母细胞瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、T细胞肿瘤中也均有EMP3差异表达的报道，因此，EMP3被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。但是，EMP3基因与肾纤维化之间的关系目前尚未见报道。

近年来，随着基因编辑技术的成熟，研究人员已经广泛将基因编辑技术应用于疾病相关基因的研究、疾病模型的建立和药物靶点的探索。现有的基因编辑技术以基于CRISPR系统的基因编辑为研究热点，目前最受关注的有3种：(1)CRISPR-Cas9：是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，在特定的位点切割双链DNA断裂，在没有模板的情况下发生非同源重组连接，造成基因发生移码突变，从而导致基因的表达受阻。(2)CRISPR-Cas12：也是一种核酸内切酶，在识别DNA序列时，形成半封闭的R-loop,只有当识别的是特定的目的片段时，才能形成封闭的R-loop，因而具有较cas9有更高的靶向性。(3)CRISPR-Cas13d：是一类RNA介导的靶向RNA切割系统，常用于RNA敲低、单碱基编辑等领域。其中，Cas9、Cas12等系统主要针对DNA，对基因的剪切是永久性的，可能影响正常组织中该基因的功能，并且对基因的敲低效率不高。相比之下，CRISPR-Cas13d主要通过切割RNA降低目的基因的表达，使得结果具有一定可恢复性，并且所编辑的蛋白分子量最小，更利于载体的转染。

不过，尽管目前已有采用CRISPR-Cas13d系统在CHO悬浮细胞中敲低AMPK、IGFBP4-1基因的报道，但针对EMP3基因的靶向性sgRNA设计以及抑制EMP3对慢性肾脏病肾纤维化等疾病发生发展的影响等还有待进一步研究探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制EMP3基因表达的CRISPR-Cas13d系统及EMP3抑制剂的用途。

本发明提供了一种靶向EMP3基因mRNA的sgRNA，序列如SEQ IDNO.1～4任一所示。

进一步地，上述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，它是表达上述的sgRNA的重组载体。

本发明还提供了一种CRISPR-Cas13d系统，它是A组中任一项和B组中任一项的组合，或是C组中任一项：

A组：sgRNA、表达sgRNA的质粒、表达sgRNA的病毒；

B组：Cas13d蛋白、表达Cas13d蛋白的质粒、表达Cas13d蛋白的病毒；

C组：表达sgRNA和Cas13d蛋白的重组质粒、表达sgRNA和Cas13d蛋白的重组病毒；

所述sgRNA是上述的sgRNA。

进一步地，它是表达sgRNA和Cas13d蛋白的重组质粒。

本发明还提供了一种抑制小鼠肾脏细胞或组织中EMP3基因表达的方法，包括将上述的CRISPR-Cas13d系统转染至小鼠肾脏细胞或组织中的步骤；

优选地，所述转染至小鼠肾脏细胞中的方法是原位电化学转化法。

本发明还提供了EMP3抑制剂在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途。

进一步地，上述药物是预防或治疗慢性肾脏病肾脏损伤或肾纤维化的药物。

进一步地，上述EMP3抑制剂包括敲除或敲低EMP3基因的试剂、抑制EMP3基因表达的试剂或降低机体EMP3蛋白含量的试剂。

更进一步地，上述EMP3抑制剂是抑制EMP3基因表达的试剂，优选为敲低EMP3基因的mRNA的试剂；更优选为上述的CRISPR-Cas13d系统。

本发明的有益效果：本发明提供了一种靶向EMP3基因RNA的sgRNA及相应的CRISPR-Cas13d系统，基因编辑效率高，能够有效抑制小鼠TCMK1细胞以及肾脏组织中EMP3的表达，作为一种EMP3抑制剂，能够显著延缓慢性肾脏病肾纤维化的进展，为临床治疗慢性肾脏病肾纤维化提供了新的靶点和治疗策略。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)的图谱。

图2为同源重组后的修饰基因片段示意图。

图3为改造后的载体Pro-cas13d-NLS的图谱。

图4为4条不同的sgRNA序列构建的CRISPR-Cas13d系统在TCMK1细胞中的基因编辑效率验证结果。

图5为免疫组化检测Emp3蛋白的表达(A)和Q-rtPCR、WB检测EMP3的含量(B)。

图6为肾组织切片免疫组化染色检测Fn、Coli(A)，Q-rtPCR定量分析肾组织中Fn、coli的表达(B-C)，WB检测Fn、Coli的蛋白含量(D)，Fn、coli的蛋白半定量分析(E-F)。

图7为肾脏组织切片的HE染色(A)和Masson染色(B)结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明根据目的基因EMP3设计的4条sgRNA序列如下：

sgRNA1(SEQ ID NO.1)(5’→3’)：

AAGACAAGAATGAGGATGTGGAGGGCAGAG

sgRNA2(SEQ ID NO.2)(5’→3’)：

ATACCACAGGTTCAGGGACTCTTTGTCTGG

sgRNA3(SEQ ID NO.3)(5’→3’)：

TCACTGACGTTACTGCAGGCCCATGTTTGA

sgRNA4(SEQ ID NO.4)(5’→3’)：

GACTTGTCCAAAGTGGCCACAAAAAGCAAG

实施例1、靶向EMP3基因mRNA的CRISPR-Cas13d系统构建

1、载体改造

步骤1:以pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(Addgene,#48138)为载体模板，设计引物，PCR法获得质粒扩增的基本原件(具体引物序列为Forward primer(SEQ ID NO.5):5’-taactagagctcgctgatcagcc-3’；Reverse primer(SEQ ID NO.6):5’-acatgtgagcaaaaggccagc-3’),电泳验证无误后胶回收获得载体DNA；扩增载体图谱如图1所示。

步骤2：委托公司合成序列(U6-DR-CMV-NLS-Cas13d-NLS-FLAG)，合成完成后以步骤1获得的PCR和合成序列使用无缝克隆的方法完成同源重组，细菌转化后培养于含有氨苄抗生素的陪伴培养12-16hr；同源重组后的修饰基因片段如图2所示。

步骤3:挑取单克隆培养过夜，提取质粒外送测序鉴定，即获得具有全长序列的真核敲低载体Pro-cas13d-NLS，图谱如图3所示。

2、EMP3敲低载体构建

改造后的载体经过BbsⅠ酶切后(酶切位点在3257-3283处)与磷酸化后的sgRNAoligos粘性末端(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3或sgRNA4)通过T4 DNA连接酶将载体片段与sgRNA片段相连，组成完整的表达sgRNA的质粒，序列为：

表达sgRNA1和Cas13d的质粒(SEQ ID NO.7)：taactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaactctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggtctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtggaagccgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttGTGGAAAGGACGAAACACCgAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACAAGACAAGAATGAGGATGTGGAGGGCAGAGTTTTTTTgaattcgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtttatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccaccatgAGCCCCAAGAAgAAGAGaAAGGTGGAGGCCAGCATCGAAAAAAAAAAGTCCTTCGCCAAGGGCATGGGCGTGAAGTCCACACTCGTGTCCGGCTCCAAAGTGTACATGACAACCTTCGCCGAAGGCAGCGACGCCAGGCTGGAAAAGATCGTGGAGGGCGACAGCATCAGGAGCGTGAATGAGGGCGAGGCCTTCAGCGCTGAAATGGCCGATAAAAACGCCGGCTATAAGATCGGCAACGCCAAATTCAGCCATCCTAAGGGCTACGCCGTGGTGGCTAACAACCCTCTGTATACAGGACCCGTCCAGCAGGATATGCTCGGCCTGAAGGAAACTCTGGAAAAGAGGTACTTCGGCGAGAGCGCTGATGGCAATGACAATATTTGTATCCAGGTGATCCATAACATCCTGGACATTGAAAAAATCCTCGCCGAATACATTACCAACGCCGCCTACGCCGTCAACAATATCTCCGGCCTGGATAAGGACATTATTGGATTCGGCAAGTTCTCCACAGTGTATACCTACGACGAATTCAAAGACCCCGAGCACCATAGGGCCGCTTTCAACAATAACGATAAGCTCATCAACGCCATCAAGGCCCAGTATGACGAGTTCGACAACTTCCTCGATAACCCCAGACTCGGCTATTTCGGCCAGGCCTTTTTCAGCAAGGAGGGCAGAAATTACATCATCAATTACGGCAACGAATGCTATGACATTCTGGCCCTCCTGAGCGGACTGAGGCACTGGGTGGTCCATAACAACGAAGAAGAGTCCAGGATCTCCAGGACCTGGCTCTACAACCTCGATAAGAACCTCGACAACGAATACATCTCCACCCTCAACTACCTCTACGACAGGATCACCAATGAGCTGACCAACTCCTTCTCCAAGAACTCCGCCGCCAACGTGAACTATATTGCCGAAACTCTGGGAATCAACCCTGCCGAATTCGCCGAACAATATTTCAGATTCAGCATTATGAAAGAGCAGAAAAACCTCGGATTCAATATCACCAAGCTCAGGGAAGTGATGCTGGACAGGAAGGATATGTCCGAGATCAGGAAAAATCATAAGGTGTTCGACTCCATCAGGACCAAGGTCTACACCATGATGGACTTTGTGATTTATAGGTATTACATCGAAGAGGATGCCAAGGTGGCTGCCGCCAATAAGTCCCTCCCCGATAATGAGAAGTCCCTGAGCGAGAAGGATATCTTTGTGATTAACCTGAGGGGCTCCTTCAACGACGACCAGAAGGATGCCCTCTACTACGATGAAGCTAATAGAATTTGGAGAAAGCTCGAAAATATCATGCACAACATCAAGGAATTTAGGGGAAACAAGACAAGAGAGTATAAGAAGAAGGACGCCCCTAGA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表达sgRNA2和Cas13d的质粒(SEQ ID NO.8)：taactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaactctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggtctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtggaagccgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttGTGGAAAGGACGAAACACCgAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACATACCACAGGTTCAGGGACTCTTTGTCTGGTTTTTTTgaattcgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtttatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccaccatgAGCCCCAAGAAgAAGAGaAAGGTGGAGGCCAGCATCGAAAAAAAAAAGTCCTTCGCCAAGGGCATGGGCGTGAAGTCCACACTCGTGTCCGGCTCCAAAGTGTACATGACAACCTTCGCCGAAGGCAGCGACGCCAGGCTGGAAAAGATCGTGGAGGGCGACAGCATCAGGAGCGTGAATGAGGGCGAGGCCTTCAGCGCTGAAATGGCCGATAAAAACGCCGGCTATAAGATCGGCAACGCCAAATTCAGCCATCCTAAGGGCTACGCCGTGGTGGCTAACAACCCTCTGTATACAGGACCCGTCCAGCAGGATATGCTCGGCCTGAAGGAAACTCTGGAAAAGAGGTACTTCGGCGAGAGCGCTGATGGCAATGACAATATTTGTATCCAGGTGATCCATAACATCCTGGACATTGAAAAAATCCTCGCCGAATACATTACCAACGCCGCCTACGCCGTCAACAATATCTCCGGCCTGGATAAGGACATTATTGGATTCGGCAAGTTCTCCACAGTGTATACCTACGACGAATTCAAAGACCCCGAGCACCATAGGGCCGCTTTCAACAATAACGATAAGCTCATCAACGCCATCAAGGCCCAGTATGACGAGTTCGACAACTTCCTCGATAACCCCAGACTCGGCTATTTCGGCCAGGCCTTTTTCAGCAAGGAGGGCAGAAATTACATCATCAATTACGGCAACGAATGCTATGACATTCTGGCCCTCCTGAGCGGACTGAGGCACTGGGTGGTCCATAACAACGAAGAAGAGTCCAGGATCTCCAGGACCTGGCTCTACAACCTCGATAAGAACCTCGACAACGAATACATCTCCACCCTCAACTACCTCTACGACAGGATCACCAATGAGCTGACCAACTCCTTCTCCAAGAACTCCGCCGCCAACGTGAACTATATTGCCGAAACTCTGGGAATCAACCCTGCCGAATTCGCCGAACAATATTTCAGATTCAGCATTATGAAAGAGCAGAAAAACCTCGGATTCAATATCACCAAGCTCAGGGAAGTGATGCTGGACAGGAAGGATATGTCCGAGATCAGGAAAAATCATAAGGTGTTCGACTCCATCAGGACCAAGGTCTACACCATGATGGACTTTGTGATTTATAGGTATTACATCGAAGAGGATGCCAAGGTGGCTGCCGCCAATAAGTCCCTCCCCGATAATGAGAAGTCCCTGAGCGAGAAGGATATCTTTGTGATTAACCTGAGGGGCTCCTTCAACGACGACCAGAAGGATGCCCTCTACTACGATGAAGCTAATAGAATTTGGAGAAAGCTCGAAAATATCATGCACAACATCAAGGAATTTAGGGGAAACAAGACAAGAGAGTATAAGAAGAAGGACGCCCCTAGA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表达sgRNA3和Cas13d的质粒(SEQ ID NO.9)：taactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaactctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggtctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtggaagccgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttGTGGAAAGGACGAAACACCgAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACTCACTGACGTTACTGCAGGCCCATGTTTGATTTTTTTgaattcgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtttatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccaccatgAGCCCCAAGAAgAAGAGaAAGGTGGAGGCCAGCATCGAAAAAAAAAAGTCCTTCGCCAAGGGCATGGGCGTGAAGTCCACACTCGTGTCCGGCTCCAAAGTGTACATGACAACCTTCGCCGAAGGCAGCGACGCCAGGCTGGAAAAGATCGTGGAGGGCGACAGCATCAGGAGCGTGAATGAGGGCGAGGCCTTCAGCGCTGAAATGGCCGATAAAAACGCCGGCTATAAGATCGGCAACGCCAAATTCAGCCATCCTAAGGGCTACGCCGTGGTGGCTAACAACCCTCTGTATACAGGACCCGTCCAGCAGGATATGCTCGGCCTGAAGGAAACTCTGGAAAAGAGGTACTTCGGCGAGAGCGCTGATGGCAATGACAATATTTGTATCCAGGTGATCCATAACATCCTGGACATTGAAAAAATCCTCGCCGAATACATTACCAACGCCGCCTACGCCGTCAACAATATCTCCGGCCTGGATAAGGACATTATTGGATTCGGCAAGTTCTCCACAGTGTATACCTACGACGAATTCAAAGACCCCGAGCACCATAGGGCCGCTTTCAACAATAACGATAAGCTCATCAACGCCATCAAGGCCCAGTATGACGAGTTCGACAACTTCCTCGATAACCCCAGACTCGGCTATTTCGGCCAGGCCTTTTTCAGCAAGGAGGGCAGAAATTACATCATCAATTACGGCAACGAATGCTATGACATTCTGGCCCTCCTGAGCGGACTGAGGCACTGGGTGGTCCATAACAACGAAGAAGAGTCCAGGATCTCCAGGACCTGGCTCTACAACCTCGATAAGAACCTCGACAACGAATACATCTCCACCCTCAACTACCTCTACGACAGGATCACCAATGAGCTGACCAACTCCTTCTCCAAGAACTCCGCCGCCAACGTGAACTATATTGCCGAAACTCTGGGAATCAACCCTGCCGAATTCGCCGAACAATATTTCAGATTCAGCATTATGAAAGAGCAGAAAAACCTCGGATTCAATATCACCAAGCTCAGGGAAGTGATGCTGGACAGGAAGGATATGTCCGAGATCAGGAAAAATCATAAGGTGTTCGACTCCATCAGGACCAAGGTCTACACCATGATGGACTTTGTGATTTATAGGTATTACATCGAAGAGGATGCCAAGGTGGCTGCCGCCAATAAGTCCCTCCCCGATAATGAGAAGTCCCTGAGCGAGAAGGATATCTTTGTGATTAACCTGAGGGGCTCCTTCAACGACGACCAGAAGGATGCCCTCTACTACGATGAAGCTAATAGAATTTGGAGAAAGCTCGAAAATATCATGCACAACATCAAGGAATTTAGGGGAAACAAGACAAGAGAGTATAAGAAGAAGGACGCCCCTAGA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表达sgRNA4和Cas13d的质粒(SEQ ID NO.10)：taactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaactctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggtctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtggaagccgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttGTGGAAAGGACGAAACACCgAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACGACTTGTCCAAAGTGGCCACAAAAAGCAAGTTTTTTTgaattcgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtttatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccaccatgAGCCCCAAGAAgAAGAGaAAGGTGGAGGCCAGCATCGAAAAAAAAAAGTCCTTCGCCAAGGGCATGGGCGTGAAGTCCACACTCGTGTCCGGCTCCAAAGTGTACATGACAACCTTCGCCGAAGGCAGCGACGCCAGGCTGGAAAAGATCGTGGAGGGCGACAGCATCAGGAGCGTGAATGAGGGCGAGGCCTTCAGCGCTGAAATGGCCGATAAAAACGCCGGCTATAAGATCGGCAACGCCAAATTCAGCCATCCTAAGGGCTACGCCGTGGTGGCTAACAACCCTCTGTATACAGGACCCGTCCAGCAGGATATGCTCGGCCTGAAGGAAACTCTGGAAAAGAGGTACTTCGGCGAGAGCGCTGATGGCAATGACAATATTTGTATCCAGGTGATCCATAACATCCTGGACATTGAAAAAATCCTCGCCGAATACATTACCAACGCCGCCTACGCCGTCAACAATATCTCCGGCCTGGATAAGGACATTATTGGATTCGGCAAGTTCTCCACAGTGTATACCTACGACGAATTCAAAGACCCCGAGCACCATAGGGCCGCTTTCAACAATAACGATAAGCTCATCAACGCCATCAAGGCCCAGTATGACGAGTTCGACAACTTCCTCGATAACCCCAGACTCGGCTATTTCGGCCAGGCCTTTTTCAGCAAGGAGGGCAGAAATTACATCATCAATTACGGCAACGAATGCTATGACATTCTGGCCCTCCTGAGCGGACTGAGGCACTGGGTGGTCCATAACAACGAAGAAGAGTCCAGGATCTCCAGGACCTGGCTCTACAACCTCGATAAGAACCTCGACAACGAATACATCTCCACCCTCAACTACCTCTACGACAGGATCACCAATGAGCTGACCAACTCCTTCTCCAAGAACTCCGCCGCCAACGTGAACTATATTGCCGAAACTCTGGGAATCAACCCTGCCGAATTCGCCGAACAATATTTCAGATTCAGCATTATGAAAGAGCAGAAAAACCTCGGATTCAATATCACCAAGCTCAGGGAAGTGATGCTGGACAGGAAGGATATGTCCGAGATCAGGAAAAATCATAAGGTGTTCGACTCCATCAGGACCAAGGTCTACACCATGATGGACTTTGTGATTTATAGGTATTACATCGAAGAGGATGCCAAGGTGGCTGCCGCCAATAAGTCCCTCCCCGATAATGAGAAGTCCCTGAGCGAGAAGGATATCTTTGTGATTAACCTGAGGGGCTCCTTCAACGACGACCAGAAGGATGCCCTCTACTACGATGAAGCTAATAGAATTTGGAGAAAGCTCGAAAATATCATGCACAACATCAAGGAATTTAGGGGAAACAAGACAAGAGAGTATAAGAAGAAGGACGCCCCTAG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最终得到靶向EMP3基因mRNA的CRISPR-Cas13d系统。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)中EMP3基因RNA的敲低

将实施例1构建好的质粒用PEI转染试剂转入小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)，Trizol试剂提取细胞RNA，用Qrt-PCR检测EMP3(引物：F(SEQ ID NO.11):5’-GGTCTCTGCCCTCCACAT-3’，R(SEQ ID NO.12):5’-TGTTCCACGTGCAGTCATAC-3’)的表达量，并设置未转染质粒的对照组(Control)和转染空载体的对照组(Vector)，结果如图4所示。

可以看出，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4均可实现有效的EMP3基因RNA靶向，其中sgRNA1/Cas13d系统基因编辑效率最高。

实验例2、小鼠肾组织中EMP3基因RNA的敲低

C57BL/6(8周，22-25g)雄性小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠，待小鼠麻醉后，在小鼠右侧肾脏组织结构表皮处切开皮肤，暴露右肾，分离小鼠肾静脉、肾动脉、输尿管，用手术夹将输尿管夹住，使用36G注射针头从输尿管注射质粒约100μl(质粒浓度＝1μg/μl，质粒构建方法与实施例1中相同，使用表达sgRNA1的质粒)，观察肾脏膨胀且色泽变苍白，即为注射成功。将无菌纸剪成约肾脏面积大小，浸生理盐水湿润后，覆于肾脏两侧，等待5min让质粒充分进入肾脏表面，再用电极轻夹住湿无菌纸包裹的肾脏，观察电阻＜500Ω时，即可开始电转(参数：电转电压(Pd V)＝50V，电转电流(Pd A)＝300mA，瞬时电转持续时长(Pd on)＝50.0ms，瞬时电转休息时长(Pd off)＝1000ms，总电转次数(Pd N)＝4次。进行电转后的肾脏侧做输尿管结扎手术，并造小鼠肾脏纤维化模型(造模方法：取SPF级雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，体重20-22g，戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠后，剔除背部毛发并消毒后，从小鼠背部脊柱左侧开口，分离筋膜、肌肉、脂肪等，暴露输尿管，分别取靠近肾门端以及靠近膀胱端双重结扎输尿管用4号丝线结扎，并剪断中间输尿管，确认手术视野内无明显出血后，理顺肠道，使用伤口缝合器缝合肌肉和皮肤。术后置于保温箱中，至苏醒后转移至饲养笼，建模后7天处死小鼠收集标本)(UUO&shEmp3组)。

同时设置未进行电转和肾脏纤维化造模处理的假手术组(Sham)、未进行电转，但进行肾脏纤维化造模处理的肾纤维化模型组(UUO)、从输尿管中注入100μL生理盐水，按照电转相应参数正常电转，然后对小鼠进行肾脏纤维化造模处理的对照组(E&UUO)。

动物手术完成7天后取肾脏组织进行后续验证，主要通过Q-rtPCR、WB、免疫组化检测Emp3以及纤维化指标Fn、coli等的表达情况，并通过肾脏组织切片HE染色和Masson染色结果验证小鼠肾损伤和纤维化的进展情况。

结果如图5～7所示。可以看出，本发明靶向EMP3基因RNA的CRISPR-Cas13d系统能够有效抑制肾组织中EMP3基因的表达，降低纤维化指标Fn、coli的表达，有效抑制血管扩张、降低胶原纤维的表达量，从而有效延缓慢性肾脏病肾脏损伤和纤维化的进展。

综上，本发明提供了一种靶向EMP3基因mRNA的sgRNA以及相应的CRISPR-Cas13d系统，基因编辑效率高，能够有效抑制小鼠TCMK1细胞以及肾脏组织中EMP3的表达，作为一种EMP3抑制剂，能够显著延缓慢性肾脏病肾纤维化的进展，为临床治疗慢性肾脏病肾纤维化提供了新的靶点和治疗策略。