一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒

技术领域

本发明属于马铃薯病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒。

背景技术

马铃薯A病毒PVA是一种重要的马铃薯检疫性病害，目前主要的检测方法包括RT-PCR技术、ELASA法、核酸斑点杂交法等。其中核酸斑点杂交是检测马铃薯病毒的一种重要方法，具有操作简单易掌握、检测灵敏度较高，易于推广等优点。探针是核酸斑点杂交的核心，现阶段应用的方法中探针产量低、成本高，一次反应产生约20μL探针，试剂成本约1600元。而且因现有探针中含有dUTP，易被RNA酶降解，引起其保存条件要求较高，长期保存需在-20℃以下。同时，受成本影响，每次检测探针用量极少，约1μL探针检测100个反应，造成杂交反应池中探针浓度较低，造成检测灵敏度低。因探针用量太少，大多用于大量样品检测，在少量样品检测时会造成探针成本增加，因此现有探针还存在应用场景不灵活等缺点。

发明内容

为解决现有核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒时使用的探针产量低、成本高的问题，本发明提供了一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针、其制备方法及试剂盒。

本发明的技术方案：

一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

一种本发明中用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法，以马铃薯A病毒反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PVA-F和反向引物PVA-R为引物进行非对称PCR扩增，所得167bp扩增产物即为检测马铃薯A病毒的探针；

所述正向引物PVA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述反向引物PVA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述反向引物PVA-R的5’端标记地高辛。

进一步的，所述非对称PCR扩增的反应体系为：PVA阳性样品DNA 1.0μL，浓度为10uM的正向引物PVA-F 0.1μL、浓度为10uM的反向引物PVA-R 0.5μL，10×PCR Buffer2.5μL，浓度为2.5mM的dNTPMixture 2.0μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL和ddH

进一步的，所述非对称PCR的扩增程度为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。

一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的试剂盒，含有本发明中的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针。

进一步的，还含有抗体液、洗液I、洗液II、洗涤缓冲液、核酸提取缓冲液、检测缓冲液、氯仿、杂交液、阻断液、显色反应缓冲液、NBT、BCIP和正电荷尼龙膜方格。

进一步的，所述抗体液含有抗地高辛AP酶。

进一步的，所述洗液I含有如下浓度的组分：2×SSC，0.1％SDS；所述洗液II含有如下浓度的组分：1×SSC，0.1％SDS；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween-20。

进一步的，所述提取缓冲液含有如下浓度的组分：1M NaCl、20mM MgCl

一种使用本发明中的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针进行马铃薯A病毒检测的方法，具体步骤如下：

步骤一、核酸提取：

取马铃薯样品按质量体积比与提取缓冲液混合、研磨，将研磨所得混合体系置于37℃条件下完成孵育，加入氯仿旋涡震荡使其充分混合，离心所得上清液即为核酸溶液，4℃保存备用；

步骤二、点样固定核酸：

取步骤一所得核酸溶液点样于正电荷尼龙膜的方格中，室温干燥后进行紫外交联固定核酸；

步骤三、杂交：

杂交液预热熔化后加入权利要求1所述用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，混匀后将步骤二完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，杂交过夜；

步骤四、洗膜：

取出步骤三中完成杂交的正电荷尼龙膜，依次用洗液I、洗液II和洗涤缓冲液进行洗涤；

步骤五、阻断：

配制1×阻断液和抗体液，将步骤四洗涤后的正电荷尼龙膜依次置于1×阻断液和抗体液中进行孵育；将完成孵育的正电荷尼龙膜置于洗涤缓冲液中洗涤，再置于检测缓冲液中平衡；

步骤六、显色：

将显色反应缓冲液、NBT和BCIP混匀后均匀涂在步骤五所得正电荷尼龙膜上，避光孵育显色，出现显色则表明待测马铃薯样本中存在马铃薯A病毒，显色越深则马铃薯A病毒阳性样本浓度越高。

进一步的，步骤一所述马铃薯样品与提取缓冲液的质量体积比为0.1g:150μL，所述提取缓冲液含有如下浓度的组分：1MNaCl、20mM MgCl

进一步的，步骤二所述点样为2μL核酸溶液点样于正电荷尼龙膜上的一个方格中；所述紫外交联固定是在1200J条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min。

进一步的，步骤三所述杂交液的预热温度为68℃；所述用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针与杂交液的体积比为10μL:5mL；所述杂交过夜的条件为68℃，8～15rpm。

进一步的，步骤四所述洗液I含有如下浓度的组分：2×SSC，0.1％SDS，所述洗液I洗涤是用20mL洗液I在室温下洗涤2次，每次15min；所述洗液II含有如下浓度的组分：1×SSC，0.1％SDS，所述洗液II洗涤是用20mL50℃预热的洗液II在55℃下洗涤2次，每次15min；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween-20，所述洗涤缓冲液洗涤是用20mL洗涤缓冲液洗涤5min。

进一步的，步骤五所述1×阻断液的配制方法为用0.1M马来酸缓冲液将预热熔化的10×阻断液稀释至1×阻断液；抗体液的配制方法为10mL 1×阻断液加入2μL抗地高辛AP酶；所述正电荷尼龙膜在1×阻断液中的孵育时间为20min，在抗体液中的孵育时间为30min；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween-20，所述洗涤缓冲液洗涤是用20mL洗涤缓冲液洗涤2次，每次15min；所述检测缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，所述检测缓冲液平衡是用15mL检测缓冲液平衡2～5min。

进一步的，步骤六所述显色反应缓冲液、NBT和BCIP混合的体积比为25:1:1；所述避光孵育显色是在37℃避光孵育显色30min。

本发明的有益效果：

本发明提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针只在反向引物5’端标记有地高辛，只标记1个碱基却保证了检测的显色效果，同时降低了探针对保存条件的要求。

本发明提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法提高了探针产量，降低了探针的制备成本，使得检测过程中可以提高探针的用量，以游离的探针与样品核酸进行杂交，能够检测到更低含量的核酸，检测方法的灵敏度更高，灵敏度能达到0.05pg。

本发明提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的试剂盒，不需要对待测样本进行PCR扩增，仅需粗提核酸即可进行检测，简化了检测程序，更易于操作，对检测设备的要求更低，检测场所的适应性更广，更便于马铃薯A病毒的田间检测和口岸检疫，能够显著提高马铃薯A病毒的检测效率。

附图说明

图1为实施例5利用实施例1制备的探针对马铃薯A病毒阳性样品和阴性样品进行核酸斑点杂交检测的显色照片；

图2为实施例6利用实施例3提供的试剂盒和实施例4提供的检测方法分别对大量待测马铃薯进行核酸斑点杂交检测的显色照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供了一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共167bp，具体序列如下：

CAGGTATGGTCTTCAACGCAACCTGAGAGATCAAAGTTTGGCAAGGTATGCTTTTGA

TTTCTATGAGATCACTGCAACCACTCCGATCAGAGCCAAAGAGGCGCATCTGCAGAT GAAAGCAGCAGCGCTGAAGAATTCGAACACTAATATGTTTGGACTGGACGGAA。

实施例2

本实施例提供了实施例1用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的制备方法。

本实施例以马铃薯A病毒反转录得到的cDNA为模板，马铃薯A病毒阳性样品DNA可由阳性样品RNA反转录获得，或为含有目的片段的质粒DNA，本实施例以马铃薯A病毒阳性样品RNA反转录获得。

本实施例使用的探针引物组为正向引物PVA-F和反向引物PVA-R，核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，具体为：

PVA-F：CAGGTATGGTCTTCAACGCA，

PVA-R：TTCCGTCCAGTCCAAACA，反向引物PVA-R的5’端标记地高辛。

本实施例使用的引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并进行标记。

本实施例中用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针的具体制备方法为：

以马铃薯A病毒反转录得到的cDNA为模板，以正向引物PVA-F和反向引物PVA-R为引物进行非对称PCR扩增，非对称PCR扩增的反应体系为：PVA阳性样品DNA 1.0μL，浓度为10uM的正向引物PVA-F 0.1μL、浓度为10uM的反向引物PVA-R 0.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 2.0μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL和ddH

本实施例制备的检测马铃薯A病毒的探针的浓度为64～160ng/μL，探针用量为10μL/100次，即每10μL探针可检测100个样品。也就是说，将100个待测样品点样至一片正电荷尼龙膜上的100个格内，检测杂交时需要5mL杂交液和10μL探针。

10×PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq酶和ddH

本实施例反向引物PVA-R的5’端标记地高辛时，后续检测马铃薯A病毒时抗体液中对应的添加抗地高辛AP酶。

实施例3

本实施例提供了一种用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的试剂盒，含有实施例1提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针；还含有抗体液、洗液I、洗液II、洗涤缓冲液、核酸提取缓冲液、检测缓冲液、氯仿、杂交液、阻断液、显色反应缓冲液、NBT、BCIP和正电荷尼龙膜方格。

本实施例中洗液I含有如下浓度的组分：2×SSC，0.1％SDS；洗液II含有如下浓度的组分：1×SSC，0.1％SDS；洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1M马来酸，0.3％Tween-20；提取缓冲液含有如下浓度的组分：1M NaCl、20mM MgCl

抗体液的配制方法为10ml 1×阻断液加入2μL抗地高辛AP酶。

本实施例中杂交液(货号Hyb-100)、阻断液(货号DIGD-110)、显色反应缓冲液(货号DIGD-110)、NBT、BCIP、抗地高辛碱性磷酸酶复合物、链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物均购自北京美莱博医学科技有限公司。

实施例4

本实施例利用实施例3提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的试剂盒对马铃薯样本进行检测，并提供了一种马铃薯A病毒的核酸斑点杂交检测的方法，具体步骤如下：

步骤一、核酸提取：

取0.2g马铃薯样品放入研磨袋中，加入300μL提取缓冲液，将马铃薯样本磨碎，将研磨所得混合体系转入1.5mL离心管中，37℃孵育15min，加入300μL氯仿，旋涡震荡使其充分混合，1000rpm离心10min至溶液分层，所得上清液即为核酸溶液，吸取上清液至新的离心管，4℃保存备用；

步骤二、点样固定核酸：

用移液器吸取2μL步骤一所得核酸溶液，点样于正电荷尼龙膜的一个方格中，室温干燥后，在紫外交联仪1200J条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min固定核酸；

步骤三、杂交：

杂交液在68℃下预热，取熔化后杂交液5mL加入到杂交管中，加入实施例1提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针10μL，探针浓度为120±20ng/μL，混匀，将步骤二完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，排除气泡，68℃，转速为8-15rpm的条件下杂交过夜；

步骤四、洗膜：

取出步骤三完成杂交的正电荷尼龙膜，置于20mL洗液I中，室温下洗涤2次，每次15min；将正电荷尼龙膜转入20mL50℃预热的洗液II中，在杂交管中55℃下洗涤2次，每次15min；将正电荷尼龙膜转入到20mL洗涤缓冲液中洗涤5min；

步骤五、阻断：

用0.1M马来酸缓冲液将预热熔化的10×阻断液稀释至1×阻断液，将正电荷尼龙膜置于阻断液中孵育20min；然后将正电荷尼龙膜置于含有抗地高辛AP酶的抗体液中孵育30min；将完成孵育的正电荷尼龙膜置于20mL洗涤缓冲液中洗涤2次，每次15min；再置于15mL检测缓冲液中平衡2～5min；

步骤六、显色：

将显色反应缓冲液、NBT、BCIP按体积比25:1:1混匀并均匀涂在夹在两层保鲜膜之间的正电荷尼龙膜上，37℃避光孵育显色30min，如出现显色则表明待测马铃薯样本中存在马铃薯A病毒，显色越深则马铃薯A病毒阳性样本浓度越高。

实施例5

本实施例利用实施例3提供的试剂盒和实施例4提供的检测方法分别对马铃薯A病毒阳性样品和阴性样品进行检测。

本实施例使用的马铃薯A病毒阳性样品由黑龙江省农业科学院经济作物研究所病毒检测实验室保存，马铃薯A病毒阳性样品初始核酸浓度为5ng。

本实施例在固定核酸时，分别用移液器吸取2μL马铃薯A病毒阳性样品，点样于正电荷尼龙膜的第一排由左至右第1-第4格中，第二排有左至右第2-第5格中；分别用移液器吸取2μL马铃薯A病毒阴性样品，点样于正电荷尼龙膜的第一排由左至右第5格中，第二排有左至右第1格中，室温干燥后，在紫外交联仪1200J条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min固定核酸。

本实施例在杂交时，加入实施例1提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针10μL，探针浓度为120±20ng/μL。

本实施例其他操作与实施例4操作均相同，显色结果如图1所示，阳性样品均产生较为明显的显色。

实施例6

本实施例利用实施例3提供的试剂盒和实施例4提供的检测方法分别对大量待测马铃薯进行马铃薯病毒A的检测，每个样品进行了2次重复检测，即点样时第一排第1点与第2点位同一样品，以此类推。点样候室温干燥，在紫外交联仪1200J条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min固定核酸。

本实施例在杂交时，加入实施例1提供的用于核酸斑点杂交法检测马铃薯A病毒的探针10μL，探针浓度为120±20ng/μL。

本实施例其他操作与实施例4操作均相同，显色结果如图2所示，不同待测样品显示出不同的显色结果，能够清晰、准确的判断出待测马铃薯是否感染了马铃薯A病毒。

正是由于本发明提供的制备方法降低了探针的制备成本，才能在检测过程中提高探针的用量。以游离的探针与样品核酸进行杂交，探针用量越多，与样品核酸结合越充分，检测方法的灵敏度越高，本发明检测马铃薯A病毒的灵敏度能达到0.05pg。

与此同时，本发明检测马铃薯A病毒使用的探针制备方法更简便，且产量高、成本低，降低了探针对保存条件的要求；而且本发明的检测方法不需要对待测样本进行PCR扩增，仅需粗提核酸即可进行检测；探针在使用前无需进行变性操作，简化了检测程序，更易于操作，对检测设备的要求更低，检测场所的适应性更广，更便于马铃薯A病毒的田间检测和口岸检疫，能够显著提高马铃薯A病毒的检测效率。