一种复合水凝胶支架及其制备方法与应用

文献发布时间：2023-06-19 19:16:40

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种复合水凝胶支架及其制备方法与应用。

背景技术

随着近年来，组织工程的研究和应用越来越广泛，对于临床中缺损或丧失组织的再生与重建具有重大意义。组织工程技术是应用生命科学、工程学的原理和方法，在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损的一门学科。

其中支架材料是组织工程的三大核心要素之一，理想的组织工程支架材料应具备以下条件：(1)良好的生物相容性：无细胞毒性、无排斥感染、低抗原性；(2)适宜的生物降解性；(3)一定的表面活性，能够为细胞的生长、增殖、分化提供良好的微环境，激活细胞特异的基因表达；(4)多孔性和高孔隙率，有利于细胞的黏附和增殖以及营养成分和代谢产物的交换。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的由胶原、非胶原糖蛋白和糖胺聚糖等大分子构成的复杂生物网络结构，具有纳米纤维结构，为细胞提供结构支撑和黏附位点，并在细胞黏附、迁移、增殖、分化和基因表达的程中起到重要的信号传递作用。脱细胞处理后的ECM免疫原性低，可生物降解，并且具有良好的生物相容性，是一种较为理想的支架材料。但经脱细胞处理后的ECM本身结构致密、孔隙率低、缺乏三维结构，影响营养物质的交换以及细胞的迁移爬行。将ECM溶解后通过控制温度或pH可诱导蛋白发生自组装形成水凝胶，该水凝胶具有三维纳米纤维结构，有利于细胞黏附、增殖，将其做成不同形状和厚度的水凝胶已经广泛地用于骨、肌肉、皮肤、心脏、膀胱等组织和器官修复的研究中。但其致密的三维纳米纤维结构使得细胞在ECM水凝胶内部难以迁移较深，限制了其作为组织工程支架的应用。另外，ECM水凝胶本身强度很弱，在很多组织修复中易塌陷，难以与被修复组织的力学性能相匹配。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有相互连通微孔结构、机械性能高、迁移性强、存储模量大的复合水凝胶支架及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种复合水凝胶支架的制备方法，包含以下步骤：

(a)将细胞外基质酶解，得到细胞外基质溶胶；所述细胞外基质采用人源或非人源去细胞组织器官经脱细胞处理工艺得到；

(b)将步骤(a)所得细胞外基质溶胶与海藻酸盐溶液混合并搅拌均匀，离心，除气泡后静置得到预凝胶；

(c)对步骤(b)所得预凝胶先浸泡在二价金属阳离子溶液中进行离子交联固定，再浸泡在交联剂中进行化学交联固定，即得所述复合水凝胶支架。

一方面，本发明提供了一种复合水凝胶支架的制备方法，该制备方法将细胞质基质酶解后与海藻酸盐溶液混合制得复合水凝胶支架，提高了细胞外基质(ECM)水凝胶的力学强度；并且通过海藻酸盐水凝胶发生离子交换而易溶解的特点，达到在ECM水凝胶支架上致孔的效果。进一步地，本发明所述制备方法制得的复合水凝胶，同时具有互相连通的微孔结构和ECM本身的纳米纤维结构，并且其机械性能大幅提升，克服了传统的温敏ECM水凝胶因致密的三维纳米纤维结构使细胞难以迁移，凝胶本身太弱的缺点。

作为本发明所述复合水凝胶支架的制备方法的优选实施方式，所述海藻酸盐为海藻酸钠。

多糖是一类具有特殊化学结构、复杂分子构象和流变学特性的天然大分子。其中，海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取点和甘露醇之后的副产物，其分子由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic,M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic,G)按(1→4)键连接而成，具有良好的生物相容性、可生物降解、无毒等优点。海藻酸钠可以在极其温和的条件下快速形成水凝胶，本发明在ECM水凝胶中加入海藻酸钠，既可提高水凝胶的力学性能，又能提高水凝胶的储存模量。

作为本发明所述复合水凝胶支架的制备方法的优选实施方式，所述细胞外基质与海藻酸钠的重量份之比为细胞外基质：海藻酸钠＝(3.33～36.7)：1。

本发明经过大量研究发现，随着复合凝胶中海藻酸钠的比例增加，复合凝胶的储存模量提高；在一定范围内海藻酸钠的加入可以提高复合凝胶的力学强度，但是，复合凝胶中海藻酸钠的比例过高，形成的凝胶结构较为致密，不利于水凝胶结构的迁移。

进一步优选地，所述细胞外基质与海藻酸钠的重量份之比为细胞外基质：海藻酸钠＝(10～36.7)：1。

进一步地，本发明研究发现复合凝胶中海藻酸钠的比例过高会阻碍复合凝胶形成胶状结构，从而进一步影响水凝胶的储存模量。

作为本发明所述复合水凝胶支架的制备方法的优选实施方式，所述二价金属阳离子溶液中二价金属阳离子为Ca

作为本发明所述复合水凝胶支架的制备方法的优选实施方式，步骤(c)中，所述交联剂为包括1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液或氮丙啶交联剂。

本发明基于用-COOH与-NH

作为本发明所述复合水凝胶支架的制备方法的优选实施方式，所述细胞外基质为包括脱细胞猪小肠黏膜下层、脂肪组织脱细胞基质、脱细胞真皮基质、外周神经脱细胞基质或脊髓神经脱细胞基质。

本发明所述制备方法具有普适性，可根据不同组织的修复需求，更换相应组织来源的ECM进行制备。

第二方面，本发明提供了一种由上述制备方法制得的复合水凝胶支架。

本发明利用海藻酸盐水凝胶与ECM水凝胶进行复合，提高ECM水凝胶的力学强度；并且通过海藻酸盐水凝胶发生离子交换而易溶解的特点，在细胞外基质水凝胶支架上制孔，从而提升水凝胶的储存模量。本发明所制得多糖与细胞外基质的复合水凝胶，同时具有互相连通的微孔结构和细胞外基质本身的纳米纤维结构，并且其机械性能大幅提升，克服了传统的温敏细胞外基质水凝胶因致密的三维纳米纤维结构使细胞难以迁移，凝胶本身太弱的缺点。

第三方面，本发明提供了一种复合水凝胶支架的应用。

本发明所述微孔纳米纤维复合水凝胶支架具有良好的生物相容性、适宜的生物降解性、一定的表面活性、具有多孔和高孔隙率的结构，可作为支架材料应用于组织工程中，拓展了ECM水凝胶作为组织工程支架的应用范围。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述复合水凝胶支架同时具有互相连通的微孔结构和细胞外基质本身的纳米纤维结构，并且其机械性能大幅提升。其中，纳米纤维结构有利于细胞的黏附和增殖，微孔结构有利于细胞向支架内部迁移，有利于提高ECM水凝胶支架对组织的修复效果，很好地拓展了ECM水凝胶在组织工程中的应用。

(2)本发明所述复合水凝胶支架克服了传统的温敏ECM水凝胶因致密的三维纳米纤维结构使细胞难以迁移，凝胶自身太弱的缺点。

(3)所述的制备具有微孔纳米纤维结构的复合水凝胶支架的方法具有普适性，可根据不同组织的修复需求，更换相应组织来源的ECM进行制备。

(4)本发明所述复合水凝胶支架可根据不同组织的机械强度，调整ECM和SA的混合比例，制备与相应组织力学性能相匹配的微孔纳米纤维结构的复合水凝胶支架。

(5)本发明所述复合水凝胶支架拓展了细胞外基质水凝胶作为组织工程支架的应用范围。

附图说明

图1为本发明对比例1制备得到的凝胶pDSM-gel、实施例1、2、3制备得到的复合凝胶pDSM/SA-gel的扫描电子显微镜(SEM)图。

图2为本发明对比例2、实施例4、5、6得到的复合凝胶pDSM/SA-gel和对比例3得到的凝胶SA-gel的储存模量变化图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围及实施方式不限于此。

实施例1

本发明所述复合水凝胶的一种实施例，本实施例所述复合水凝胶支架的制备方法如下：

(1)把20份上述脱细胞猪小肠黏膜下层粉末加入80份浓度为0.01M的含胃蛋白HCl溶液中，调节pH，低温下加入10×PBS混合均匀，在4℃下储存待用，得到20wt％pDSM-sol；

(2)将2份海藻酸钠粉末完全溶解于98份水中，得到2wt％SA水溶液；

(3)将88份20wt％pDSM-sol和12份2wt％SA水溶液在低温下混合并搅拌均匀，低温下4℃离心除去气泡后于37℃下静置8分钟得到预凝胶；然后将预凝胶在37℃下浸泡于浓度为5wt％的CaCl