白菜根肿病感病基因BrSWEET2a的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及白菜根肿病感病基因BrSWEET2a、及其编码蛋白及其在植物抗病过程中的应用。

背景技术

白菜(Brassica rapa L.syn.B.campestris L.)属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)植物，因喜冷凉，在春、秋、冬季节栽培较多，是中国重要的绿叶蔬菜之一，目前在世界范围内广泛种植。

十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌引起的一种世界性病害，几个世纪以来一直是十字花科作物生产上的巨大威胁。油菜、卷心菜、羽衣甘蓝、大白菜和芥菜等几乎所有十字花科作物均难逃根肿病危害。芸薹根肿菌属于专性寄生菌，侵入后会导致寄主根部组织细胞异常膨大和恶性分裂，从而造成根部畸形产生大量肿瘤，根系疏导组织受到严重破坏。地上部分也会因营养和水分失去来源而表现出萎蔫、变黄和生长停滞。后期，寄主根部肿瘤破溃，散出的大量根肿菌休眠孢子会遗留在田间。其孢子寿命长，抗逆能力强，普通的化学药剂处理无法产生杀灭效果。孢子也很容易随着流水和人类活动而扩散出去，这些都使得根肿病成为经济上最重要的病害。

在高等植物中，糖的运输是非常复杂的，糖不仅被植株生长、发育、繁殖等生理生化过程所需要，还涉及植物与病原体间的相互作用。在前人的研究中，SWEETs基因家族一直参与多种病原菌侵染的过程。如最早在苜蓿中发现的MtN3基因，便是由根瘤菌所诱导表达的结瘤素相关基因，在水稻与白叶枯病菌作用中，糖转运蛋白OsSWEET11基因被诱导上调表达，从而使得更多的蔗糖运输到库细胞，病原菌获得更多的能量用以生长繁殖，使植株发病。在拟南芥中，丁香假单胞菌能够调控许多SWEETs基因的转录水平上调表达，例如AtSWEET2a、AtSWEET4、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET12和AtSWEET15；二孢白粉菌能够诱导AtSWEET11和AtSWEET12基因上调表达；真菌灰霉菌侵染能够诱导AtSWEET4、AtSWEET15和AtSWEET17基因的表达。

由此可见，SWEETs家族基因在行使糖转运蛋白功能的同时也参与到寄主与病原菌互作的过程中。这也许与植物—病原菌的长期共存有关。因此，SWEETs活性的降低或基因的表达受到抑制被认为是植物抗病的特征之一。SWEETs蛋白在植物抗病、抗逆研究中具有巨大的潜在利用价值，可以通过分子生物学手段进行研究培育出抗病抗逆的新品种。

发明内容

本发明的目的是提供白菜BrSWEET2a及其应用。经过材料接种处理后进行转录组表达分析，结合qRT-PCR，对转录组结果进行验证以获得SWEETs基因家族的基因表达变化趋势，发现BrSWEET2a在被根肿菌侵染后24h显著上调表达。

本发明采用的技术方案具体为：

本发明提供了一种根肿病感病基因BrSWEET2a，该基因为：从极感病的结球白菜(B.rapa var.pekinensis)ECD05中克隆到的基因，其具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明提供了含有上述白菜BrSWEET2a的生物材料，所述生物材料为表达载体，表达盒，宿主细胞或工程菌。

本发明提供了上述白菜BrSWEET2a及其同源基因AtSWEET2a或其相应的生物材料在筛选抗根肿病植物和/或调控植物抗根肿病功能中的应用。其中，白菜根肿病感病候选基因BrSWEET2a或AtSWEET2a表达越高，植物的抗根肿病功能越弱。

进一步地，通过上调表达植物的BrSWEET2a使植物抗病性下降，下调表达或敲除植物的BrSWEET2a使植物抗病性增强。

通过敲除或沉默白菜根肿病感病候选基因BrSWEET2a或AtSWEET2a，植物调控植物抗根肿病功能增强。

进一步地，所述根肿病为芸薹根肿菌引起的根肿病。

进一步地，所述植物为拟南芥或白菜。

本发明提供的白菜BrSWEET2a序列如SEQ ID No.1所示。通过农杆菌介导法将该基因导入拟南芥中，获得白菜BrSWEET2a异源表达的转基因拟南芥株系，结果发现，在抗病性分析实验中，BrSWEET2a拟南芥同源基因AtSWEET2a的T-DNA插入突变体材料比野生哥伦比亚型拟南芥更加抗病，BrSWEET2a的过量表达可以促进根肿菌侵染拟南芥根部引起的根部肿大。这表明了白菜BrSWEET2a与十字花科根肿病关系密切，将该基因应用于白菜或其他十字花科作物育种，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为BrSWEET2a在ECD05被根肿菌侵染后24h(24h)和48h(48h)与未侵染的对照组(CK)的定量分析柱图。

图2为白菜BrSWEET2a的CDS克隆PCR电泳图。其中左M泳道为marker0311，右3，4，5，8泳道为目的片段。

图3为BrSWEET2a过表达载体(A)及其亚细胞定位载体(B)示意图。

图4为BrSWEET2a蛋白的亚细胞定位情况观察结果图。

图5为T-DNA插入突变体材料SALK_034042的纯合株筛选PCR示意图，左边为筛选标准图，右为本实施例的电泳胶图，其中M为markerDL2000，2、3、8、11泳道为纯合株，1、4、5、6、7、10、14泳道与野生型wt泳道一致，9、13为杂合体。

图6为病原菌孢子悬浮液接种后21天(21d)SALK_034042突变体植株与对照植株生长状况比较情况。

图7为病原菌孢子悬浮液接种后21天(21d)异源过表达植株与对照植株生长状况比较情况。

图8为病原菌孢子悬浮液接种后21天(21d)SALK_034042突变体植株、异源过表达植株突变体与对照植株的根部病状比较情况。其中-H

图9为病原接种后T-DNA纯合突变体与对照植株病情指数调查分析的柱状图。

图10为拟南芥异源过表达植株与对照植株病情指数调查分析的柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，实施例中未作详细描述的技术手段属于本领域专业技术人员熟知的常规技术。实施例只用于说明本发明，但不限制本发明的范围，任何本领域的技术人员在不付出创造性劳动的情况下，以本发明的实施例为基础所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。

本发明实施例提供了一种根肿病感病基因BrSWEET2a，该基因从极感病的结球白菜(B.rapa var.pekinensis)ECD05中克隆到的基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明实施例还提供了上述白菜BrSWEET2a在拟南芥抗根肿病中的应用，下面对其进行具体描述。

实施例1实时荧光定量PCR分析

1.1实验材料

种植足量的ECD05，芸薹根肿菌侵染24h后取根，三次重复，每次重复包含20棵植株的根系。同时期取未经过芸薹根肿菌处理的为对照组，同样包含三次重复，每次重复包含20棵植株的根系；芸薹根肿菌侵染48h后取根，三次重复，每次重复包含20棵植株的根系。同时期取未经过芸薹根肿菌处理的为对照组，同样包含三次重复，每次重复包含20棵植株的根系。

1.2cDNA的合成

将得到的样品用TRIzol试剂提取总RNA，进而反转录获得cDNA，使用的是TaKaRa公司提供的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录专用试剂盒。详细操作步骤按照说明书进行。

1.3实时荧光定量PCR分析

qRT-PCR分析所用引物通过Primer Premier 6设计，如表1所示。反应体系为15μL：7.5μL的SYBR Green Master Mix，正反向引物各0.3μL，模板1μL，5.9μL双蒸水。qRT-PCR反应流程：95℃：30s,40个循环(95℃：5s，55℃：45s)。通过熔融曲线确定反应的特异性，内参基因为BcUBC10，基因的相对表达量通过2

结果(图1)显示该基因在ECD05白菜被根肿菌侵染后24h和48h上调表达。

表1白菜qRT-PCR分析所用引物

实施例2白菜BrSWEET2a异源表达载体的构建

2.1设计特异引物

高保真KOD酶扩增BrSWEET2a的CDS序列，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，长度符合，进行割胶回收(图2)。利用已经获得的白菜BrSWEET2a的CDS序列，然后设计带有SalⅠ和KpnⅠ酶切位点作为同源臂的引物(表2)，通过PCR扩增获得目的基因。

2.2对pFGC1008空载载体进行双酶切

酶切体系如下：Buffer 4μL，SalⅠ和KpnⅠ酶各2μL，双蒸水补足至40μL。37℃水浴1h后回收酶切产物。

2.3同源重组连接

将上述线性化载体和PCR扩增纯化的片段通过同源重组进行连接：用诺唯赞的单片段同源重组试剂盒C112进行，体系为：4μl 5×CEⅡBuffer，2μl ExaseⅡ，200ng双酶切回收的线性化载体，20ng BrSWEET2a的CDS片段，ddH

2.4转化大肠杆菌

培养所得菌液PCR验证，并提取目的质粒测序验证，验证比对成功的质粒电转法转化农杆菌感受态，通过PCR和生物公司测序进行验证后，保存菌种于-80℃。

表2异源表达载体构建所用引物

实施例3白菜BrSWEET2a表达定位分析

利用白菜ECD05根部提取的cDNA为模板，扩增基因BrSWEET2a的CDS序列，割胶回收，-20℃保存。使用表3引物构建亚细胞定位载体，使用实验室保存的pFGC-GFP载体，双酶切位点是BamHⅠ和XbaⅠ，酶切产物回收，连接，大肠杆菌转化(图3B)。鉴定阳性克隆，提质粒后电转法转化农杆菌GV3101，获得阳性克隆后，进行烟草的瞬时转染。将摇好的农杆菌菌液经过5,000rmp离心15min，弃上清，加入重悬液重悬至菌体OD

表3亚细胞定位载体构建所用引物

实施例4拟南芥浸花法转化及阳性转化株的筛选

4.1浸花法转化拟南芥

经过测序验证的上述2.3菌液以及pFGC1008空载体质粒的农杆菌GV3101菌液作为母液，浸花法转化拟南芥，步骤如下：含有目的载体的农杆菌菌液500μl，加入200ml含卡那霉素和利福平的液体LB中(50mg/L)，28℃，200rpm摇菌30h左右至OD

4.2阳性转化株的筛选

在卡那霉素播种培养基上播种浸花得到的拟南芥种子T1代，步骤如下：10vol％NaClO消毒2min；75vol％乙醇清洗种子2min；无菌水冲洗5次，每次1min；播种于卡那霉素播种培养基上，封口，置于22℃培养间培养(16h光照，8h黑暗)，约两周后，移出长势健壮，叶色深绿的阳性植株，PCR检测验证(表4)。

表4转基因拟南芥PCR检测所用引物

实施例5T-DNA插入突变体材料的筛选

BrSWEET2a在拟南芥中的同源基因是AT3G14770(AtSWEET2a)，从拟南芥突变体库ABRC购买的T-DNA插入突变体查找到了AtSWEET2a的SALK系列的纯合突变体SALK_034042。

将突变体播种后，培养于光照培养箱，待长出四至五片真叶后取少量叶片提取每个单株的组织DNA，使用三引物法PCR对每个单株进行纯合突变体检测，反应体系如下：1.1×T3 Super Mix 44μl，2μl Template，2μl Primer F，2μl Primer R；程序设定为98℃预变性2min 30sec，进入35圈循环扩增(98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸10sec)，最后72℃充分延伸2min保证片段完整的扩增。PCR扩增时，LP和RP扩增野生型基因组，BP和RP组合扩增T-DNA插入。在纯合突变体中，有且只有BP+RP引物的PCR产物，用0.8wt％琼脂糖凝胶电泳分离(图5)，即为突变体材料SALK_034042，根据检测结果，将纯合单株收种保存备用。纯合突变体SALK_034042中，AtSWEET2a几乎不表达；引物序列见表5。

表5T-DNA插入突变体材料筛选所用引物

实施例6芸薹属根肿菌侵染发病实验及表型观察

6.1芸薹属根肿菌孢子液的制备

1)取出保存在-20℃冰箱里的病根，进行解冻。

2)用70％乙醇溶液浸泡消毒1min。

3)10％ NaClO处理20min，用锡纸遮光后，用无菌水冲洗3次。

用榨汁机将根块榨成匀浆，灭菌过的纱布过滤2次。将滤液离心500rpm，5min,弃去黑色沉淀，留上层清液和灰色沉淀。换新的干净的50mL离心管，加无菌水补充至45mL，4000rmp，15min，弃上清。将沉淀溶解于无菌水后，4000rpm，10min离心，重复一次。将沉淀溶于50wt％蔗糖，3100rpm，10min，弃上清。加入无菌水至45mL，4000rpm，10min，弃上清，重复2～3次。沉淀溶于1mL无菌水中，获得高浓度孢子液，保存在-4℃冰箱里。

6.2根肿菌休眠孢子镜检

将细胞计数板置于显微镜下，中央放置盖玻片。用移液枪吸取孢子液，向盖玻片边缘凹槽处加入菌液，直至盖玻片内充满根肿菌孢子液体细胞计数板中具有用于计数的四角大方格，运用显微镜进行计数，压在上边线和左边线的孢子算在方格内孢子密度＝(大方格内细胞总数/4)×10

6.3侵染发病及表型观察

异源过表达植株的对照组为空载转化的拟南芥植株，T-DNA插入的突变体植株对照组为拟南芥野生型(WT)植株。待拟南芥种子播种后长出两片真叶时，进行浸根接种30min。菌液侵染后，做好标记，在光照培养箱中培养20d左右。小心取出所有植株，用清水将根部清洗干净，再针对根部发病情况进行统计和拍照记录。将发病情况划分为0至3级共4个标准，0级，根部无膨大，正常发育状态；1级，主根无膨大，发育正常，侧根有小肿块；2级，主侧根膨大面积超过整体1/3；3级：主侧根膨大明显甚至出现龟裂、腐烂。按照病情指数计算公式进行计算，公式如下：

病情指数DI(Disease Index)＝(0级株数*0+1级株数*30+2级株数*60+3级株数*100)/总株数*100。

如果DI≥10，则判定为感病；如果DI<10，则判定为抗病。

结果显示：BrSWEET2a的突变体材料SALK_034042无明显副效表型(黄化，早衰，植株矮小等)。且部分植株明显比野生型拟南芥更抗根肿病(图6、图8)。在转基因拟南芥植株的发现，BrSWEET2a异源表达的转基因拟南芥植株相比于对照组而言均出现了对根肿病抗性下降的表型(图7、图8、表6)。BrSWEET2a的突变体材料SALK_034042在三次病原接种的独立实验中总体平均病情指数显著低于野生型。在野生型拟南芥中过表达BrSWEET2a基因后，过表达植株表现出比pFGC1008空载更加感病(图9、图10、表7)。

表6T-DNA插入突变体材料及其野生型根肿病病情指数调查

表7BrSWEET2a过表达植株及其空载体转化株根肿病病情指数调查

以上所述为本发明较佳的具体实施方式，但在其基础上可以进行一些改进或修改，这对任何熟悉本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在本发明基础上所作的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。