MAP-2抑制剂在制备治疗高血压疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及MAP-2抑制剂在制备治疗高血压疾病的药物中的应用。

背景技术

高血压是充血性心衰、中风、终末期肾病的重要危险因子。据统计,全世界成年人群约有巧一患有高血压病,而岁以上的某些人群,高血压发病率可达。预计到年,全世界高血压发病人数将庵升至亿千万人。但令人遗憾的是,只有近三分之一的患者降压治疗达标。主要原因在于高血压病是一种终生性疾病,而目前所有降压药的半衰期相对较短,有效作用时间不超过小时,故必须每天服药,病人不易坚持。此外药物的非特异性和副作用,也使高血压的治疗难以达到预期目标。因此,寻找一种长期有效的、通过调节体内基因表达而控制高血压的方法即基因治疗一直是医学家们努力的目标和方向。

小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是RNA干扰的引发物，激发与之互补的目标mRNA沉默，对基因调控及疾病治疗有重要意义。

在神经科学领域，标记或操作投射神经元是研究神经环路必不可少的研究手段。目前，可以用DiI这种红色荧光染料顺行标记神经元，研究高位中枢下行的投射环路；或者用荧光金(Fluoro-Gold)来逆向标记神经元，研究外周肌肉在脊髓水平的神经元投射，或者脊髓传导束在中枢的投射环路等等。但这些荧光染料的标记方法只可以对传导束进行标记，却无法通过上调或者下调基因的表达来研究传导束的功能。在这样的背景下，AAV2-retro应运而生。2016年，发表在神经科学领域权威期刊Neuron上的文章，描述了这种AAV2-retro病毒的构建方法及其应用。

肾周脂肪组织是一种非典型的内脏脂肪垫，具有完整的血液供应、淋巴引流和神经支配系统。流行病学研究表明，肾周脂肪是高血压的风险预测因子。我们先前的研究还发现，肾周脂肪组织传入神经末梢的特异性破坏和脂肪清除都可以降低血压，而在肾周脂肪组织中注射辣椒素或完全弗氏佐剂(CFA)可增加血压。这表明肾周脂肪组织可能是参与高血压调节的关键组织之一。

发明内容

本发明的目的是提供MAP-2抑制剂在制备治疗高血压疾病的药物中的应用。

本发明采取的技术方案为：MAP-2抑制剂在制备治疗高血压疾病的药物中的应用，其中MAP-2的GeneID:25595；网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/25595。

优选的，所述MAP-2抑制剂为AAV-retro-MAP-2病毒。

优选的，所述MAP-2抑制剂为MAP-2的siRNA。

优选的，所述AAV-retro-MAP-2病毒的给药部位为肾周脂肪。

本发明还公开了AAV-retro-MAP-2病毒在制备治疗肾脏或血管损伤疾病的药物中的应用。

优选的，所述AAV-retro-MAP-2病毒的给药部位为肾周脂肪。

本发明发现于肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒可以调控SHR大鼠以及DOCA-Salt模型大鼠的高血压以及逆转肾脏和血管的损伤。于SHR大鼠腹腔注射MAP-2的siRNA也可以达到此效果。目前临床上高血压多为药物治疗，患者需长期高频率服用一种或多种高血压药以控制血压。而本发明采用的MAP-2敲低治疗高血压所持久的药理学作用可能支持每半年一次或可能每一年一次的给药来控制血压。与目前的治疗方案相比，减少给药频率可能有助于提高药物依从性，这是维持血压控制的一个重要部分。

附图说明

图1、自发性高血压大鼠(SHR)腹腔每3日一次注射MAP-2RNAi，并进行每周一次连续动脉血压监测38天。在SHR大鼠全身性敲低MAP-2可以显著降低其血压水平。A:收缩压(SBP)变化统计图。B:舒张压(DBP)变化统计图。C：平均动脉压(MAP)变化统计图。D：两组大鼠背根神经节中MAP-2基因的mRNA水平差异比较。(每组4只，P<0.05)

图2、在SHR大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒后监测血压心率16周(1次/周)。在SHR大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒敲低其背根神经节(DRG)的MAP-2水平可显著降低其血压水平。A:收缩压(SBP)变化统计图。B:舒张压(DBP)变化统计图。C：平均动脉压(MAP)变化统计图。D：心率(Heartrate)变化统计图。(每组10只，P<0.05)

图3、将SD(SpragueDawley)大鼠单侧肾切除+DOCA-Salt(DOCA盐)诱导5周后建立肾性高血压模型。造模后，与对照组相比，DOCA-Salt大鼠血压显著升高，肾功能显著下降。A：两组血中肌酐(CREA)含量。B：收缩压(SBP)变化统计图。C：两组血中尿素氮(BUN)含量。D：平均动脉压(MAP)变化统计图。(每组10只，P<0.05)

图4、A：在DOCA-Salt大鼠的背根神经节(L1节段)通过免疫荧光染色染MAP-2抗体。MAP-2在DOCA-Salt大鼠的背根神经节(L1节段)表达量显著增强。B：根据A图中的MAP-2阳性率的统计图。(每组n＝3，P<0.05)

图5、在DOCA-Salt大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒后监测血压6周(1次/周)。在DOCA-Salt大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒可以显著降低由DOCA-Salt引起的肾性高血压。A：收缩压(SBP)变化统计图。B：四组第6周的收缩压(SBP)水平。C：平均动脉压(MAP)变化统计图。D：四组第6周的平均动脉压(MAP)水平。(对照组(Sham)8只；DOCA-Salt组10只；AAV-retro-MAP-2组9只；DOCA-Salt+AAV-retro-MAP-2组10只，P<0.05)

图6、A：对这四组大鼠的5段背根神经节(T11-L2)进行MAP-2的免疫荧光染色。B：对染色结果进行统计。AAV-retro-MAP-2病毒敲低了T12-L1节段的背根神经节，表明这三个节段可能是肾周脂肪的投射节段。(每组3只，P<0.05)

图7、A：四组血中尿素氮(BUN)含量。B：四组血中肌酐(CREA)含量。(对照组(Sham)8只；DOCA-Salt组10只；AAV-retro-MAP-2组9只；DOCA-Salt+AAV-retro-MAP-2组10只，P<0.05)。在DOCA-Salt大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒可以显著改善由DOCA-Salt引起的肾功能下降。C：四组大鼠肾脏组织的马松和HE染色。D：马松面积统计图。(每组3只，P<0.05)。大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒可以显著改善由DOCA-Salt引起的肾脏纤维化。

图8、A：四组肾脏组织的TUNEL染色。B：TUNEL染色阳性细胞统计图。C：对纤维化指标(COL-1、TGF-β、α-SMA)和调亡指标(Caspase-3、Bax、BCL-2)的WesternBlot蛋白免疫印迹。D：WesternBlot统计图。(每组3只，P<0.05)。在DOCA-Salt大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒可以显著改善由DOCA-Salt引起的肾脏细胞的凋亡和纤维化。

图9、A：四组大鼠的肾脏体重比。(每组6只，P<0.05)B：四组大鼠的肾脏血流散斑实验。C：血流图的统计图。D：四组肾脏肾皮质的电镜图。(白色箭头：基底膜；黑色箭头：足突；红色星型：调亡细胞。)(每组3只，P<0.05).在DOCA-Salt大鼠肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2病毒可以显著改善由DOCA-Salt引起的肾脏肥大、肾小球基底膜增厚、足突融合和细胞调亡和供血不足。

图10：对四组大鼠的肠系膜动脉进行离体血管环收缩舒张实验。A:内皮依赖性血管收缩实验。B：非内皮依赖性血管收缩试验。C:内皮依赖性血管舒张实验。D:非内皮依赖性血管舒张实验。(每组3只，P<0.05)。

图11：A:对四组大鼠的肠系膜动脉进行了血流散斑实验。B:血流图的统计图。C:对肠系膜动脉纤维化指标(COL-1、TGF-β、α-SMA)的WesternBlot蛋白免疫印迹。D:WesternBlot统计图。(每组3只，P<0.05)

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

如图1所示，我们在8周龄的雄性自发性高血压大鼠(SHR，维通利华)腹腔每3日一次注射MAP-2RNAi(锐博生物，江苏南京)，并进行每周一次连续尾动脉血压监测38天。经过对血压的统计，我们发现，在SHR大鼠全身性敲低MAP-2可以显著降低其血压水平(图1A,B和C)。随后我们将大鼠安乐死，取材背根神经节，提取组织RNA，并用荧光实时定量PCR(RT-PCR)对背根神经节里的MAP-2基因的mRNA水平进行检测，发现与对照组相比注射了MAP-2RNAi的SHR大鼠背根神经节的MAP-2的mRNA水平显著下降(图1D)。

这表明对MAP-2的敲低可以降低自发性高血压。

实施例2

神经逆行性病毒AAV-retro-MAP-2的构建方法为：先建立一个空载体H12663pAAV-U6-spgRNAv2.0[shRNA]-CMV-EGFP-WPRE-spolyA(汉恒生物，上海)，后插入目的基因MAP2(靶点：GCATAACAGTACCTAGCAT)，上下游克隆酶切位点分别为BsmBI和NheI，从而构建后生成原件：pAAV-U6-shRNA(Map2)-CMV-EGFP-WPRE-spolyA。如图2所示，将神经逆行性病毒AAV-retro-MAP-2并注射在SHR大鼠的肾周脂肪处。目的是为了敲低由肾周脂肪投射的背根神经节中的MAP-2基因的表达。我们监测血压心率16周(1次/周)，发现在SHR大鼠的高血压水平(图2A,B和C)以及心率(图2D)均被显著降低。在持续了16周之久后血压与心率依旧稳定。

这表明对由肾周脂肪投射的背根神经节中的MAP-2的敲低可以降低自发性高血压。

实施例3

如图3所示，为了进一步探究MAP-2基因在肾周脂肪所投射的DRG的敲低对其他类型的高血压是否有相同的作用，我们建造了SD大鼠(8周龄，维通利华)的肾性高血压模型。我们将SD大鼠的单侧肾脏切除后，进行1％的盐水喂养以及皮下注射醋酸脱氧皮质酮(DOCA，10mg/2次/周，西格玛，美国)，共造模五周。查看血中肌酐和尿素氮水平来检测肾功能(图3A和C)，并每周检测血压(图3B和D)情况。我们发现造模组大鼠的血压、血肌酐和尿素氮水平显著高于对照组。

同时我们用荧光实时定量PCR(RT-PCR)对两组大鼠背根神经节里的MAP-2基因的mRNA水平进行检测，发现与对照组相比，造模组显著增高(图4A和B)。

我们在这两组中随机挑选一半的大鼠对他们的肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2，并持续监测血压6周。我们发现单纯注射AAV-retro-MAP-2病毒并不会影响大鼠血压，而若对肾性高血压大鼠注射病毒后，在第一周便可看到其血压显著降低，并一直稳定持续六周(图5)。

我们为了验证肾周脂肪投射的DRG节段以及MAP-2在各节段的敲除水平，我们取四组大鼠的T11至L2节段，并对他们进行MAP-2基因的免疫荧光染色。我们发现肾周脂肪投射的DRG主要为T12、T13和L1三个节段。而MAP-2的敲除以T13和L1最为显著(图6)。

我们检测了四组大鼠的血清肌酐和尿素氮水平，发现在肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2显著降低了肾性高血压大鼠的血清肌酐和尿素氮水平(图7A和B)。马松和HE染色也说明了肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2可以显著降低肾性高血压大鼠的肾脏纤维化(图7C和D)。

对肾脏组织的TUNEL染色(碧云天，上海)表明肾周脂肪注射AAV-retro-MAP-2可以显著降低肾性高血压大鼠的肾脏细胞的凋亡(图8A和B)。WesternBlot对纤维化和调亡的一些蛋白指标的结果也验证了上述结果(图8C和D)。

我们测量并计算了四组大鼠的肾重体重比，MAP-2在DRG的敲低也可以显著改善肾性高血压大鼠的肾脏肥大(图9A)。血流散斑实验显示MAP-2在DRG的敲低可以显著增加肾性高血压大鼠的肾脏血流量(图9B和C)。通过电镜，我们观察到MAP-2在DRG的敲低可以改善肾性高血压大鼠的肾小球基底膜的增厚、足细胞的融合和细胞凋亡(图9D)。

如图10，我们对四组大鼠的肠系膜动脉进行了离体的血管环实验，来检测其收缩与舒张能力。我们用内皮缩血管肽(ET-1)(图10A)和去甲基肾上腺素(NA)(图10B)分别来验证内皮和非内皮依赖性血管收缩能力，用硝普钠(SNP)(图10C)和乙酰胆碱(Ach)(图10D)分别来验证非内皮和内皮依赖性血管舒张能力。我们发现肾性高血压损伤了肠系膜动脉的内皮依赖性舒张能力，而MAP-2在DRG的敲低改善了其功能(图10D)。

对肠系膜动脉的血流散斑实验显示MAP-2在DRG的敲低可以显著增加肾性高血压大鼠的肠系膜动脉的血流量(图11A和B)。WesternBlot对纤维化的一些蛋白指标的结果也说明了MAP-2在DRG的敲低可以显著改善肾性高血压大鼠的肠系膜动脉的纤维化(图11C和D)。

综上所述，MAP-2在DRG的敲低可以显著降低肾性高血压大鼠的血压，也改善了肾性高血压大鼠肾脏功能和血管功能的损伤。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。